CC BY
85
УДК 616-77-037.43-092.467.68
РОЛЬ ЭКЗОГЕННЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ В ПРОЦЕССЕ КОЛЛАГЕНО-ОБРАЗОВАНИЯ ПРИ ИМПЛАНТАЦИИ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПРОТЕЗА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
© Лазаренко В.А., Иванов И.С., Иванов С.В., Горяйнова Г.Н., Иванов А.В.,
Мартынцев А.А., Тарабрин Д.В.
Кафедра хирургических болезней № 1, кафедра патологической анатомии, кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: [email protected]
Одной из серьезных проблем современной герниологии является нарушение коллагенового обмена и, как следствие, замедление созревания соединительной ткани, ухудшение ее структурных свойств и возникновение рецидивов. Имплантация же чужеродного материала неизбежно приводит к развитию воспалительного процесса. Все это заставляет искать пути улучшения условий для создания прочной соединительной капсулы вокруг эндопротеза с целью предотвращения развития рецидивов. В эксперименте на мышах, с использованием окраски препаратов Сириус Ред и поляризационной микроскопии изучено влияние введения экзогенных эмбриональных фибробластов, а также кратности их введения на динамику коллагенового обмена при использовании эндопротеза «Экофлон» из политетрафторэтилена в зависимости от ориентации его сторон. Использование поляризационной микроскопии позволило доказать увеличение содержания коллагена I типа на средних и поздних сроках эксперимента при введении экзогенных фибробластов.
Ключевые слова: фибробласт, коллаген I и III типа, послеоперационная грыжа, поляризационная микроскопия, сетчатые эндопротезы.
THE ROLE OF EXOGENOUS EMBRYONIC FIBROBLASTS ON COLLAGEN METABOLISM IN EXPERIMENTAL IMPLANTATION SYNTHETIC PROSTHESES Lazarenko V.A., Ivanov I.S., Ivanov S.V., Goryainova G.N., Ivanov A. V., Martyntsev A.A., Tarabrin D. V.
Department of Surgical Diseases N 1, Department of Pathological Anatomy,
Department of Histology, Embryology, Cytology of Kursk State Medical University, Kursk
One of the most actual problems of herniology is the disturbance of collagen metabolism, and as the result the delayed maturation of the connective tissue with worsening its structural characteristics and recidivation of hernia. Implantation of the foreign material inevitably leads to the development of inflammation. All these problems force us to look for the ways to facilitate the formation of stable connective tissue capsule around endoprosthesis in order to prevent recidivation. The experiment on mice with using Sirius Red dye and polarization microscopy was performed to investigate the influence of exogenous embryonic fibroblasts, and the quantity of their using upon the dynamics of collagen metabolism in application of endoprosthesis “Ecophlon” - polytetraphtorethilen depending on the orientation of endoprosthesis sides. Using the polarization microscopy managed to approve an increase in contents of Collagen Type I in intermediate and late time after the onset of experiment with using the fibroblasts.
Keywords: fibroblast, Collagen Type I and Type II, post operation hernia, polarization microscopy, endoprosthesis.
Актуальность диагностики и лечения послеоперационных вентральных грыж (ПОВГ) не вызывает сомнений. Использование синтетических эндопротезов в настоящее время является общепризнанным методом лечения при ПОВГ передней брюшной стенки обширных и гигантских размеров [1, 5, 10].
Лечения рецидивных грыж больших и гигантских размеров доказывает эффективность только методик эндопротезирования. Самыми распространенными способами пластики грыж является "sublay" или "inlay" методики. При обширных и гигантских грыжах живота развиваются значительные деформации мышечных и апоневротических структур брюшной стенки, что зачастую делает необходимым использование также пластики типа "onlay». Одной из задач герниологии являет-
ся изучение структурных свойств тканей в месте пластики. Применение разнообразных синтетических протезов, помимо несомненного положительного эффекта, вызывает развитие ответной воспалительной реакции, с длительным экссудативным компонентом [2, 5, 10].
Технически грамотно выполненная операция с применением синтетического протеза не является гарантией успеха (отсутствия рецидива), если не учитывается состояние соединительнотканных структур в месте пластики [2, 5]. Значительный процент прооперированных больных остаются грыженосителями, что доказывает актуальность изучения структурных свойств соединительной ткани в зоне пластики. Основную роль в ослаблении передней брюшной стенки играет нарушение образования коллагена, приводящее к нарушению
формирования зрелой соединительной ткани. Патология коллагенового обмена и соотношения коллагена I и III типов играет существенную роль в развитии структурной и функциональной недостаточности тканей передней брюшной стенки
[2, 7].
Важным клеточным звеном, участвующим в регенераторных и регуляторных процессах соединительной ткани являются фибробласты. Введение экзогенных культивируемых фибробластов в область эндопротезирования представляется перспективным методом для улучшения и ускорения процесса созревания функционально достаточной, прочной соединительной ткани [6, 8, 9]. Культивируемые эмбриональные фибробласты способствуют формированию углеводнобелковых комплексов основного вещества, коллагеновых, ретикулярных и эластических волокон, стимулируют и потенцируют пролиферацию других клеток. Влияние экзогенных фибробластов способствует формированию прочной пространственной структуры соединительнотканых образований передней брюшной стенки на ранних сроках. Применение экзогенных фибробластов в условиях «чистой» хирургии ПОВГ является перспективным методом также ввиду их низкой им-муногенности [4].
Изменение в соотношении I и III типов коллагена можно визуализировать и оценивать с использованием окраски Sirius Red и поляризационной микроскопии, что делает возможным исследование процессов формирования и оценки структурных особенностей соединительной ткани в динамике [2, 3]. Изучение применения алло-генных эмбриональных фибробластов представляет несомненный интерес при эндопротезировании ПОВГ передней брюшной стенки.
Цель исследования: изучение влияния экзогенных эмбриональных фибробластов на динамику коллагенового обмена при помощи поляризационной микроскопии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование выполнено на 450 половозрелых белых мышах. Проводили хирургическую операцию для размещения участка протеза размерами 1,0 х 0,5 см над апоневрозом передней брюшной стенки. Применяли стандартные протезы из полипропилена (ППРО) - «Линтекс», СПб, политетрафторэтилена (ПТФЭ) - «Экофлон», СПб, и из поливинилиденфторида (ПВДФ) -«Линтекс», СПб.
Животные были подразделены на 3 группы.
Группа А - фибробласты в область протеза не вводили.
Группа B - однократное введение фибробла-стов на 7 сут. с момента имплантации эндопротеза;
Группа С - двукратное введение экзогенных фибробластов: на 7 и 10 сутки.
Каждая группа состоит из трех равных подгрупп по 50 животных, отличающихся типом использованного протеза (ППРО, ПТФЭ или ПВДФ).
Фибробласты получали из культуры эмбриональных фибробластов, извлекаемых из эмбрионов белых мышей на сроке беременности 10-15 дней. Эмбрионы помещались в среду 199 с антибиотиками и доставлялись в лабораторию отделения клеточной трансплантации и иммунотерапии Курской областной клинической больницы. После экспозиции в течение 4 ч при 4°С и промывания стерильным раствором Хенкса фрагменты эмбриона измельчали и трипсинизировали в течение 20 мин при постоянном перемешивании.
По окончании трипсинизации к раствору трипсина добавлялась сыворотка крупного рогатого скота, клеточную суспензию отбирали в стерильные пробирки и ценрифугировали при 1000 об/мин. Осадок клеток ресуспензировали в среде 199 c 10% сывороткой крупного рогатого скота. Через 48 ч производили смену среды. Выросший через 7-10 сут клеточный монослой снимали с подложки раствором Хенкса. Открепившиеся от подложки клетки осаждали центрифугированием и трижды отмывали средой 199. Затем клетки подсчитывали и засевали в культуральные флаконы. Культивирование проводили на полной среде RPM 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки до формирования монослоя фибробластов.
Животные выводились из эксперимента на 10, 30 и 60 сутки. Исследования проводили с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986).
Участок тканей передней брюшной стенки с эндопротезом иссекали и полученный макропрепарат размером 1.5 х 1 см помещали в 10% раствор формалина, затем его заключали в парафиновый блок. Из полученных блоков изготавливали гистологические срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивали Sirius Red. Исследование проводили в обычном и поляризованном свете с использованием поляризационного микроскопа Altami Polar
2, при объективах х10, x25 и x40. Фотосъемка микропрепаратов осуществлялась с использованием цифровой окулярной камеры Altami 3 Mpx, выполнялась съемка 10 полей зрения при различном увеличении.
Соотношение I и III типов коллагена (ТК) основывается на отличиях в цветовой гистограмме. Для первого типа коллагена характерно превалирование красной части спектра, II типа коллагена (незрелого) - желтой части, III типа коллагена -зеленой части спектра. Подсчет соотношения ТК осуществлялся с помощью программного комплекса Altami Studio 3.0 и Image J 1,46h на основании изучения построенной цветовой гистограммы выбранного участка в каждом поле зрения. Абсолютные значения красного и зеленого цветов спектра, переводились в относительные, с расчетом соотношения ТК.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При использовании поляризационной микроскопии проведено изучение динамики коллагенового обмена в тканях паратрансплантатной зоны при однократном и двукратном введении культивированных фибробластов с целью изучения динамики изменений соотношения I и III типов коллагена в зависимости от типа протеза и кратности применения экзогенных клеток.
Группа A
Нами не выявлены достоверные отличия в соотношении ТК на ранних сроках исследования (10 суток) во всех трех подгруппах животных (табл. 1).
Главной особенностью использования окраски Сириус Ред и поляризационной микроскопии является возможность дифференцировки различий между соединительноткаными структурами, не определяемыми при обычной световой микроскопии. Однако в группе А парапротезные ткани при поляризационной микроскопии дифференци-
руются очень плохо, особенно на ранних сроках, создают эффект «разреженных» тканей (рис. 1). ^отношения ТК демонстрирует повышение содержание коллагена I типа к 30 суткам (с 1 до 1,45 при использовании протеза ПВДФ). Для эндопротезов ППРО и ПТФЭ отмечается достоверное, синхронное повышение соотношения ТК до уровня 1,2.
Показатели соотношения ТК при использовании протезов ПТФЭ и ППРО остаются «синхронными» на протяжении всего периода эксперимента в группе А (до 1,6). Соотношение ТК при использовании ПВДФ к 60 суткам составляет 2,6.
Применение поляризационной микроскопии указывает на прогрессивное увеличение коллагена I типа. К 30 суткам это повышение статистически достоверно, к 60 суткам отмечается достоверное превышение в 1,6 раза уровня коллагена I типа для материалов ПТФЭ и ППРО. Использование ПВДФ показывает, что превалирование коллагена I типа, по сравнению с показателями при использовании протезов ПТФЭ и ППРО, достоверно на всех сроках.
Группа B (однократное введение фибробла-стов на 7 сутки)
Соотношение ТК у животных группы В имеет тенденцию к неуклонному повышению содержания коллагена I типа и синхронному снижению коллагена III типа, аналогично динамике ТК в группе А. Введение экзогенных фибробластов на 7 сутки не оказывает к 10 суткам статистически достоверного эффекта, соотношение ТК одинаково для всех материалов и стремится к 1. Однако визуально в ряде препаратов группы В на сроке 10 суток отмечаются участки повышенного содержания коллагена I типа, что в препаратах группы А не наблюдалось (табл. 2).
Таблица 1
Динамика изменения содержания I и III типа коллагена в месте имплантации протеза (группа А)
Материал/ Срок I тип коллагена (%) III тип коллагена (%) m Отношение I/III типов коллагена
Группа А (без введения экзогенных фибробластов)
ППРО
10 сут. 50,4 49,59 ±0,608 1,01
30 сут. 54,49 45,5 ±0,568 1,19
60 сут. 62,01* 37,99* ±0,991 1,63
ПТФЭ
10 сут. 50,09 49,91 ±0,567 1,01
30 сут. 54,76* 45,24* ±1,414 1,21
60 сут. 61,56* 38,44* ±0,875 1,6
ПВДФ
10 сут. 50,16 49,84 ±0,378 1
30 сут. 59,19* 40,81* ±0,643 1,45
60 сут 72,26* 27,74* ±0,589 2,6
Примечание: * p<0,01 (при сравнении между эндопротезами на одном сроке исследования после протезирования)
P^. 1. Структура паратрансплантатного пространства, эндопротез ПВДФ, 10 сут., без введения фиб-робластов. Pазреженность зрелых соединительнотканых волокон в парапротезном пространстве. Поляризационная микроскопия. Окраска Sirius Red. Объектив х 25. Окуляр х 10.
Таблица 2
Динамика изменения содержания I и III типа коллагена в месте имплантации протеза (группа В)
Материал/ срок I тип коллагена (%) III тип коллагена (%) m Отношение I/III типов коллагена
Группа В (однократное введение экзогенных фибробластов на 7 сутки)
ПГОО
10 сут. 50,64 49,36 ±0,557 1,02
З0 сут. 64,61* 35,36* ±1,144 1,82
60 сут. 74,56* 25,43* ±0,682 2,93
ПТФЭ
10 сут. 50,19 49,81 ±0,659 1
З0 сут. 60,06* 39,94* ±0,578 1,5
60 сут 69,45* 30,55* ±0,697 2,27
ПВДФ
10 сут. 51,12 48,88 ±0,462 1,04
З0 сут. 68,85* 31,15* ±0,7З9 2,21
60 сут. 81,9* 18,1* ±0,772 4,5
Примечание: * р<0,01 (при сравнении между эндопротезами на одном сроке исследования после протезирования)
В группе В соединительнотканые волокна разрежены вокруг нитей эндопротеза, микроскопическая картина не отличается от препаратов группы А. К 30-м суткам при использовании протеза ПВДФ отмечается достоверное повышение соотношения ТК. При использовании материалов ПТФЭ и ППРО данный показатель достоверно ниже. Наименьшие значения ТК отмечены для ПТФЭ, что связано с его нетканой пористой структурой. Однако необходимо отметить, что
показатели соотношения ТК при использовании протеза ПТФЭ к 30 суткам в группе В сопоставимы с результатами для этого же материала к 60 суткам в группе А.
При использовании протезов ППРО и ПВДФ в группе В данная тенденция более выражена. В отличие от результатов группы А, отсутствует «синхронность» показателей в соотношении ТК для материалов ППРО и ПТФЭ к 30 суткам исследования, а к 60 суткам данный показатель для
протеза ППРО в 1,3 превышает показатель при использовании ПТФЭ. Соотношение ТК при имплантации ПВДФ достигает к 60 суткам 4,5, в 1,5 раза превышая показатель для ППРО и в 2 раза превышая показатель для ПТФЭ.
Соединительнотканая капсула вокруг протеза у животных в группе В к 30 м суткам представляет собой структурированное образование, надежно отграничивающее протез от окружающих тканей. Однако при использовании поляризационной микроскопии определяется неоднородность тканей капсулы, выражающаяся в чередовании участков разного цвета и интенсивности окрашивания коллагеновых волокон. При однократном введении экзогенных фибробластов показатель содержания коллагена I типа на 30 сутки в группе В сопоставим с результатами на 60 сутки в группе А. По сравнению с группой А к 60 суткам в группе В отмечается достоверное увеличение соотношение ТК при использовании всех материалов.
Структурные особенности коллагеновых волокон при поляризационной микроскопии в группе В к 60 суткам показывают больший процент тканей с превалированием коллагена I типа, что свидетельствует о развитии более прочной соединительной ткани в области имплантации в группе В с однократным введением фибробластов (рис. 2).
Группа С (двукратное введение фибробластов на 7 и 10 сутки)
Соотношение ТК в группе С, так же как и в предыдущих сериях, к 10 суткам стремится к 1. Ни однократное, ни двукратное введение фибробластов на столь коротком временном промежутке не влияет на соотношение типов коллагена (табл. 3).
Разреженность соединительной ткани вокруг эндопротеза на 10 сутки исследования, характерная для группы А, не наблюдается в группе С. Капсула вокруг нитей протеза в группе С значительно толще, что указывает на выраженную стимулирующую роль двукратного введения экзогенных фибробластов в формировании соединительной ткани (рис. 3).
К 30 суткам эксперимента отмечается увеличение содержание коллагена I типа, при этом результаты для материалов ППРО и ПВДФ достоверно не отличаются. Показатели ТК у животных с имплантацией материала ПТФЭ (группа С) сопоставимы со значениями для эндопротеза ПТФЭ в группе В. Только значения соотношения ТК для протеза ППРО достоверно больше в группе С, чем аналогичные показатели для этого же материала в группе В, т.е. эффект от двукратного введения фибробластов на 30 сутки, по сравнению группой В, отсутствует, за исключением случаев использования материала ППРО.
Pra. 2. Структура паратрансплантатного о пространства, эндопротез ПВДФ, 60 сут., однократное введение фибробластов. Участки капсулы с превалированием коллагена I типа. Поляризационная микроскопия. Окраска Sirius Red. Объектив х 25. Окуляр х 10.
Таблица 3
Динамика изменения содержания I и III типа коллагена в месте имплантации протеза (группа С)
Материал/ Срок I тип коллагена (%) III тип коллагена (%) m Отношение I/III типов коллагена
Группа С (двукратное введение экзогенных фибробластов на 7 и 1 0 сутки)
ПГОО
10 сут. 50,67 49,33 ±0,488 1,02
30 сут. 69,52* 30,48* ±0,467 2,28
60 сут. 79,46* 20,53* ±0,526 3,87
ПТФЭ
10 сут. 50,66 49,34 ±0,412 1,02
30 сут. 61,64* 38,36* ±0,53 1,6
60 сут. 71,48* 28,52* ±0,488 2,5
ПВДФ
10 сут. 49,8 50,2 ±0,093 0,99
30 сут. 69,15* 30,85* ±0,764 2,24
60 сут. 86,89* 13,11* ±0,516 6,4
Примечание: * р<0,01 (при сравнении между эндопротезами на одном сроке исследования после протезирования)
P^. 3. Структура паратрансплантатного пространства, эндопротез ПІШО, 10 сут., двукратное введение фибробластов. Капсула вокруг нитей эндопротеза. Поляризационная микроскопия. Окраска Sirius Red. Объектив х 25. Окуляр х 10.
К 60 суткам в группе С показатели соотношения ТК с превалированием коллагена I типа достигают максимумов. Повышение соотношения для протеза ПТФЭ минимально. Анализ показателей при имплантации материалов ППРО и ПВДФ указывает на резкий рост содержания I типа коллагена и снижение III типа: к 60 суткам соотношение ТК для ППРО в группе С в 1,3 раза больше, чем в группе В на аналогичном сроке. Для материала ПВДФ превышение еще больше -
в 1,4 раза. На этом сроке подлежащие ткани плотно фиксированы к парапротезной капсуле, ее толщина максимальна (рис. 4).
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Исследование динамики коллагенового обмена с использованием поляризационной микроскопии позволяет достоверно определять структурные особенности соединительнотканой капсулы.
P^. 4. Структура паратрансплантатного пространства, эндопротез ПВДФ, 60 сут., двукратное введение фибробластов. Выраженная, многослойная капсула вокруг нитей эндопротеза. Поляризационная микроскопия. Окраска Sirius Red. Объектив х 25, Окуляр х 10.
2. Соотношение ТК стремится к 1 при использовании всех материалов на ранних сроках эксперимента (до 30 суток) во всех группах.
3. Применение экзогенных культуральных фибробластов модифицирует созревание соединительной ткани, повышая содержание коллагена I типа в зависимости от кратности введения.
4. При использовании материала ППРО двукратное введение фибробластов достоверно увеличивает содержание коллагена I типа по сравнению с однократным введением.
5. Минимальные значения соотношения ТК с превалированием I типа коллагена отмечаются при использовании материала ПТФЭ, максимальные - при использовании материала ПВДФ на 60 сутки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдурахманов Ю.Х., Попович В.К., Добровольский С.Р. Качество жизни больных послеоперационной вентральной грыжей в отдаленном периоде Хирургия // Журнал им. Н.И. Пирогова. - 2010. -№ 7. - С. 32-36.
2. Велигоцкий Н.Н., Комарчук В.В., Комарчук Е.В., Касумба К. Хирургическое лечение грыж на фоне дисплазии соединительной ткани // Украинский Хирургический Журнал. - 2011. - № 3. -С. 236-239.
3. Кактурский Л.В. Поляризационная микроскопия. Микроскопическая техника. - М.: Медицина, 1996. - 96 с.
4. Смирнов С.В. Современные методы клеточной терапии при лечении ожогов // Хирургия. - 2003. -№ 12. - С. 58-62.
5. Тимошин А.Д., Юрасов А.В., Шестаков А.Л. Хирургическое лечение паховых и послеоперационных грыж брюшной стенки. - М.: Триада -Х, 2003.
- 144с.
6. Hebda P.A., Dohar J.E. Transplanted fetal fibroblasts: survival and distribution over time in normal adult dermis compared with autogenic, allogenic, and xeno-genic adult fibroblasts // Otolaryngol. Head Neck Surg. - 1999. - Vol. 121, N 3. - P. 245-251.
7. Henriksen N.A., Yadete D.H., Sorensen L.T., Agren M.S., Jorgensen L.N. Connective tissue alteration in abdominal wall hernia // Br J Surg. - 2011. - Vol. 2, N 98. - P. 210-9.
8. Monteiro A., Berger E., Monteiro O. Jr., Alonso P., Stavale J.,. Gongalves M. Quantitative and qualitative analysis of collagen types in the fascia transversalis of inguinal hernia patients // Arq. Gastroenterol. - 2007.
- Vol. 44, N 3. -P. 112-16.
9. Rosch R., Junge K., Knops M., Lynen P., Klinge U., Schumpelick V. Analysis of collagen-interacting proteins in patients with incisional hernias, // Langenbeck's archives of surgery. - 2003. - Vol. 387, N 11-12. - P. 427-432.
10. Scales J. T. Discussion on metals and synthetic materials in relation to soft tissues: tissue reaction to synthetic materials // Proc R Soc Med. - 1953. -N 46. - P. 647.
