CC BY
28
Иванов С.В., Иванов В.П., Иванов И.С., Барт И.И. КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГРЫЖЕВОЙ БОЛЕЗНИ
КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГРЫЖЕВОЙ БОЛЕЗНИ
Иванов С.В., Иванов В.П., Иванов И.С., Барт И.И. УДК: 616-007.43-037
ГБОУ ВПО Курский государственный медицинский университет
Резюме
Современная герниология является инновационным направлением в хирургии. Среди причин развития грыж большую роль играет нарушение коллагенового обмена, вследствие чего происходит неравномерное созревание соединительной ткани, ухудшение ее структурных свойств. Исследование полиморфизма гена эпидермального фактора роста и коллагенового состава соединительной ткани в коже посредством поляризационной микроскопии делают возможным прогнозирование развития грыжевой болезни и уменьшение частоты осложнений в раннем послеоперационном и реабилитационном периодах.
Ключевые слова: коллаген, грыжа, грыжевая болезнь, поляризационная микроскопия, эпидермальный фактор роста.
CRITERIA FOR DISEASE PREDICTION HERNIA
Ivanov I.S., Ivanov V.P., Ivanov S.V., Bart I.I.
Modern herniology presents innovational field of surgery. Among the causes of hernia development the disturbance of collagen metabolism plays a great role, and leads to heterogeneous maturation of the connective tissue and disorder of its structural characteristics. Investigation of epidermal growth factor polymorphism and connective tissue collagen contents in skin with the help of polarization microscopy makes it possible to prognosis of hernia disease development and to decrease complications rate in early post operation and rehabilitation periods.
Keywords: collagen, hernia, hernia disease, polarization microscopy, epidermal growth factor.
Введение
Хирургическое лечение грыж передней брюшной стенки - актуальная проблема абдоминальной, реконструктивной и косметической хирургии. Грыжа передней брюшной стенки - это полиэтиологическое заболевание, влекущее за собой множественные расстройства в деятельности внутренних органов. Количество больных с послеоперационными грыжами продолжает увеличиваться, достигая уровня 20-22% [4].
Вентральные грыжи (ВГ) встречаются более чем у 5% взрослого населения, что составляет 50 на 10000 человек. В ЕС ежегодно выполняется более 400 тыс. грыжесечений, в США - более 700 тыс., в России около 200 тыс. операций. Увеличение количества хирургических вмешательств закономерно и пропорционально повышает число больных с ПОВГ. По данным литературы до 15% чревосечений заканчивается формированием послеоперационной грыжи, что особенно часто происходит при нагноении послеоперационной раны.
Образование рецидивов при ВГ является нерешенной проблемой и не имеет тенденции к снижению, рецидивы имеют место в 15-20%. Обоснованный поиск «радикального» метода лечения привел к созданию около трехсот различных вариантов оперативного вмешательства по поводу ВГ [2].
Операция при грыжах живота в подавляющем большинстве случаев производится в условиях патологических изменений тканей передней брюшной стенки (атрофически-дегенеративных, рубцовых), снижения их прочности, регенераторных возможностей, что диктует необходимость поиска вариантов решения этой проблемы [1, 3].
Анализ применения различных синтетических материалов дал результаты, указывающие на то, что грыжи (в том числе и рецидивные) связаны так же с патологией соединительной ткани, возникающей и под влиянием
протезов. Кроме того, была разработана гипотеза, получившая экспериментальное подтверждение об изменениях экстракорпоральной мембраны, как основной патофизиологической причине рецидивной грыжи. Согласно этой гипотезе в тканях брюшной стенки у больных с вентральными грыжами отмечено нарушение соотношения коллагена I типа и III типа, приводящее к снижению прочности соединительной ткани, и, следовательно, предрасположению к образованию грыж. Это открыло новые пути к исследованиям, направленным на увеличение прочности послеоперационного рубца [12].
В настоящее время выявлено, что основную роль в развитии грыжевой болезни имеют нарушения коллаге-нового обмена и формирования соединительной ткани, и как следствие ее физическая слабость к физическим нагрузкам. Нарушение коллагенового обмена и изменение соотношения коллагена I типа к III типу является важной причиной в возникновении нарушений структурной целостности и механической прочности соединительной ткани [11].
Нарушение соотношения коллагена I типа к III типу приводит к увеличению частоты возникновения и рецидивам ВГ. Механическая прочность ряда анатомических образований (ослабление поперечной фасции и задней стенки пахового канала при паховых грыжах, апоневроза и белой линии живота при ВГ) напрямую зависит от строения и соотношения типов коллагена, что необходимо учитывать при выборе метода и объема герниопластики [13, 14].
Нарушение синтеза коллагена, изменение соотношения I/III типов коллагена может возникать из-за недостатка определенных аминокислот и других компонентов в месте операционной травмы. Пространственную структуру соединительной ткани и соотношение I/III типов коллагена можно визуализировать при использовании окраски Sirius Red и поляризационной микроскопии [15].
Иванов С.В., Иванов В.П., Иванов И.С., Барт И.И. КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГРЫЖЕВОЙ БОЛЕЗНИ
В научных исследованиях последних лет появляются все более убедительные доказательства вовлеченности цитокинов в дегенеративно-дистрофические процессы [5, 6, 7]. В частности, эпидермальный фактор роста (EGF) представляет экспрессирующегося на поверхности как нормальных, так и трансформированных эпителиальных клеток и являющегося решающим трансмембранным тирозин-киназным рецептором в регуляции клеточного роста и дифференцировки [8, 9, 10].
Целью исследования являлось определение ассоциации между соотношением I и III типов коллагена в коже и полиморфизмом гена эпидермального фактора роста, в качестве критериев для прогнозирования развития вентральных грыж.
Материалы и методы
В работе использованы данные обследования и лечения больных с неосложненными вентральными грыжами находившихся в клинике хирургических болезней № 1 ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России на базе БМУ «КОКБ» с 2010 по 2012 гг.
В выборку для гистологического исследования было включено 95 пациента, которые были разделены на две группы: № 1и № 2. Мужчин было 30 (31,6%), женщин - 65 (68,4%).
В 1 группу вошло 46 пациентов, из них 37 (80,4%) больные с послеоперационными вентральными грыжами, из которых 7 (18,9%) с малыми размерами, средними - 19 (51,4%), большими - 7 (18,9%), гигантскими - 4 (10,8%). Оставшиеся 9 (19,6%) были с пупочными грыжами, среди которых 4 (44,4%) пациента были со средними размерами, а 5 (55,6%) - малыми. Мужчин - 11 (23,9%), средний возраст которых составил 54 ± 9,9 года. Женщин - 35 (76,1%), возраст - 56,8 ± 11,2 лет.
Группу № 2 составили 49 пациентов, не являющихся грыженосителями, и не имеющие других клинических проявлений слабости соединительнотканного аппарата. Из них мужчин было 19 (38,8%), средний возраст которых составил 62,8 ± 13,3года. Женщин - 30 (61,2%), средний возраст - 54,5 ± 13,8.
Для молекулярно-генетического анализа была сформирована выборка, составившая 281 пациента, представителей русской национальности, уроженцев курской области, находившихся на стационарном лечении в отделении общей хирургии курской областной клинической больницы. Забор материала проводился на месте.
Выборка для молекулярно-генетического анализа была подразделена на 2 группы: № 3 и № 4. Группа № 3 состоит из 134 пациентов с абдоминальными грыжами. Из них 108 женщин и 26 мужчин. Средний возраст больных составил 54,4 ± 10,9 года. Преобладающей возрастной группой были люди от 51 до 60 лет (55 человек). Вторыми по величине были возрастные группы 41-50 лет и 61-70 лет, по 18,2% и 23,7% соответственно. 9% и 7,3% составили больные в возрастах 31-40 лет и более 71 года соответственно.
Группа № 4 состоит из 157 человек. В нее вошли пациенты без грыжевой болезни, без тяжелых соматических патологий - таких, как онкологические заболевания, сахарный диабет, тяжелые формы ишемической болезни сердца (в том числе инфаркты миокарда), артериальной гипертензии и др., находившиеся на стационарном лечении в отделении общей хирургии. Из них 125 женщин и 32 мужчины. Средний возраст их составил 51,2 ± 12,6 года. Преобладающей возрастной группой, так же, как и в группе № 3, были лица 51-60 лет (49 человек).
В план обследования больных с ВГ было включено гистологическое исследование препаратов кожи, полученных интраоперационно. Всем больным интрао-перационно производилась биопсия кожи из области операционного доступа: после рассечения кожи, ее край фиксировали хирургическим пинцетом. Скальпелем иссекали один кожный фрагмент размерами 4,0 х 4,0 мм, глубиной на всю толщу кожи (без подкожной клетчатки). Полученные препараты помещали в приготовленный заранее стеклянный контейнер с 10% раствором форма лина, полно стью покрывающим препарат, и закрывали герметичной резиновой пробкой. После 24 часовой экспозиции в растворе формалина, биоптат заключали в парафиновый блок по схеме Меркулова. Полученный препарат нарезали на микротоме (сечение 5 |m), фиксировали на предметном стекле и окрашивали красителем Sirius Red (Сириус - красный). После чего, препарат исследовали в обычном и поляризованном свете с использованием поляризационного микроскопа Altami Polar 2, увеличении х100, х250 и х400, х630, а так же водной иммерсии. Применялась вставка в окуляр, ограничивающая поле зрения. Фотосъемка микропрепаратов осуществлялась с использованием цифровой окулярной камеры Altami 3 Mpx, выполнялась съемка 10 «полей зрения» при различном увеличении.
Оценка соотношения типов коллагена (ТК) основывалась на отличиях в цветовой гамме, характерной для каждого типа и переходных форм: I тип коллагена - красный, III тип коллагена - зеленый. Определение соотношения коллагена I и III типов осуществлялось с использованием программного комплекса Altami Studio 3.0 и ImageJ 1,47a, на основании изучения цветовой гистограммы выбранного участка в каждом «поле зрения». Выделение цветовых диапазонов проводилось на основе гистограммы каждого из цветов. Абсолютные значения красного и зеленого цветов спектра, получаемые посредством визуально-программных комплексов для каждого поля зрения, переводились в относительные с учетом стандартного отклонения. В последующем рассчитывалась величина соотношения ТК.
Для анализа полиморфизма +61 G/A гена EGF была произведена амплификация фрагментов про-моторной области данного гена с использованием следующих праймеров: прямой - 5'-AAGAGAAACTG-TTGGGAGAG-3', обратный праймер - : 5'-GGAAGCC-AGTAAGAAATACC-3'. Условия ПЦР были следующие:
Иванов С.В., Иванов В.П., Иванов И.С., Барт И.И. КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГРЫЖЕВОЙ БОЛЕЗНИ
5 минут денатурации при температуре 95° C, далее 35 циклов 95° C, 60 с, 65° C, 60 с, 72° C 60 с, заверщающий шаг 72° C в течение 15 минут. Продукты ПЦР-реакции были визулизированы в трансиллюминаторе под ультрафиолетовым светом после электрофореза на 3,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Для ПДРФ анализа была использована растриктаза Alu I. Рестрикция производилась при 60° C в течение 10 часов. Для разделения продуктов рестрикции производился электрофорез на 3,5% агарозном геле в течение 40 минут. Амплификация производилась методикой ПЦР-ПДРФ. Амплификацию проводили на многоканальном термо-циклере «Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Москва). С целью оптимизации ПЦР для каждой пары праймеров рассчитывали оптимальный температурно-временной режим отжига и подбирали соответствующую концентрацию MgCl2.
Для оценки соответствия распределений генотипов и для сравнения частот аллелей и генотипов в выборках больных и здоровых людей использовали критерий Хи-квадрат Пирсона с поправкой Йейтса на непрерывность. Ожидаемую гетерозиготность рассчитывали по Nei, также рассчитывали относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой. Для сравнения частот аллелей и генотипов между группами больных и здоровых людей также использовали критерий Хи-квадрат с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к послеоперационному образованию грыж судили по величине отношения шансов (OR). Во всех случаях уровень статистической значимости принимали за 95% (р < 0,05).0бработку результатов исследования проводили с помощью встроенных функций ЭВМ приложения Microsoft Exel-2010, Statistica 6.0.
Результаты собственных исследований
В ходе проведенного гистологического исследования с использованием поляризационной микроскопии получены результаты по процентному соотношению содержания коллагенов I и III типов в образцах кожи у больных с вентральными грыжами и у больных без них. В таблице 1 приведены значения процентного содержания обоих коллагенов в исследуемых группах.
При исследовании гистологических препаратов кожи у больных 1 группы было установлено, что среднее содержание коллагена I и III типа составляет 51,48 ± 1,83% и 48,52 ± 1,83% соответственно. Соотношение коллагена I и III типа в коже у больных 1 группы составляет 1,06 ± 0,1, в связи, с чем в спектре при поляризационной микроскопии превалирует зеленый цвет. Пример поляризационной микроскопии у больного с ВГ представлен на рисунке 1.
Исследование гистологического препарата кожи у больных 2 группы выявило содержание коллагена I типа 69,07 ± 2,66%, III типа 30,93 ± 2,66%. При этом, в спектре при поляризационной микроскопии превалируют красные и оранжевые цвета, характерные для коллагена
Табл. 1. Характеристика содержания коллагена I и III типа в коже у больных 1 и 2 групп
Коллаген I типа Коллаген III типа Соотношение коллагена I и III типа
1 группа 51,48 ± 1,83* 48,52 ± 1,83* 1,06 ± 0,1
(больные с ВГ)
N = 46
2 группа (больные без ВГ) N = 49 69,07 ± 2,66* 30,93 ± 2,66* 2,26 ±0,29
Примечание: * - различия достоверны, р < 0,05.
Рис. 1. Микроскопическая картина участка кожи у больного с ВГ. Поляризационная микроскопия. Окраска Sirius Red. Объектив х 400
I типа. Отмечается мелкая зернистость. Соотношение типов коллагена составляет 2,26 ± 0,29.
Пример поляризационной микроскопии у пациента без ВГ представлен на рисунке 2.
Таким образом, у больных с ВГ отмечается достоверное снижение соотношения типов коллагена в препарате кожи в сравнении с больными без грыж. У больных с ВГ грыжами малых размеров содержание коллагена в коже I типа составляет 51,46 ± 1,34%, III типа 48,531 ± 1,34%. При исследовании препаратов кожи у пациентов с обширными вентральными грыжами коллагена I типа - 50,7 ± 0,8%, а III типа 49,3 ± 0,83%. Также в исследуемую группу вошли 4 пациента с гигантскими вентральными грыжами, среднее содержание коллагена I и III типа равно 50,4 ± 0,82% и 49,6 ± 0,82% соответственно.
На рисунке 3 представлена диаграмма, отражающая соотношение I/III типов коллагена в коже (группы № 1 и № 2).
Исследуя соотношение типов коллагена в коже у больных без грыж и с грыжами, были выявлены достоверные отличия (р < 0,05) содержания коллагена. Соотношение типов коллагена у пациентов без ВГ со-
Иванов С.В., Иванов В.П., Иванов И.С., Барт И.И. КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГРЫЖЕВОЙ БОЛЕЗНИ
Табл. 2. Распределение частот генотипов и значения гетерозиготности по полиморфным вариантам генов в группе № 4
Рис. 2. Микроскопическая картина участка кожи у больного без ВГ. Поляризационная микроскопия. Окраска Sirius Red. Объектив х 400
Ген Полиморфизм генотип Распре- Уровеньгетеро- X2,
и его локали- деление зиготности (p)
зация в гене генотипов Ho He
EGF +61G/A 61 GG 75 51,4% 0,342 0,432 3,23
61 GA 50 34,2% (p > 0,05)
61 AA 21 14,4%
Примечание: Но - наблюдаемая, Не - ожидаемая гетерозиготность, X2 Пирсона и достигнутый уровень значимости для теста на РХВ ^ = 1).
Табл. 3. Распределение частот генотипов и значения гетерозиготности по полиморфным вариантам генов в группе больных группы № 3
Ген Полиморфизм генотип Распре- Уровеньгетеро- X2,
и его локали- деление зиготности (p)
зация в гене генотипов Ho He
EGF +61G/A 61 GG 51 37,5% 0,390 0,490 3,01
61 GA 53 39% (p > 0,05)
61 AA 32 23,5%
Примечание: Н0 - наблюдаемая, Не - ожидаемая гетерозиготность, X2 Пирсона и достигнутый уровень значимости для теста на РХВ ^ = 1).
Рис. 3.
кожа
больные без грыж
больные с грыжами
Табл. 4. Сравнительная характеристика частот аллелей и частот генотипов полиморфизма гена EGF +6ША в группах № 3 и № 4
Соотношение коллагена 1/Ш типа в коже у больных без вентральных грыж и с вентральными грыжами
Аллели Частоты аллелей Критерий различий х2, (p) OR
№ 3 № 4
61 G 0,570 0,678 8,00 0,61
61 A 0,430 0,322 (0,005)* 1,64
Генотипы Частоты генотипов Критерий различий х2, (p) OR
№ 3 № 4
61 GG 0,236 0,393 6,60 0,57
61 GA 0,444 0,368 (0,04)* 1,23
61 AA 0,319 0,239 1,83
ставило 2,26, а у больных с грыжами это соотношение достоверно ниже - 1,06.
Для поиска причин данного явления был проведен молекулярно-генетический анализ полиморфизма EGF +6Ш/А. Для молекулярно-генетического анализа была проведена проверка частот генотипов на популяци-онное равновесие Харди-Вайнберга. Анализ проводился раздельно в группах № 3 и 4. Результаты анализа представлены в таблицах 2 и 3.
Распределение генотипов соответствовало популя-ционному равновесию Харди-Вайнберга.
В группе больных с ВГ распределение частот генотипов, так же, как и в группе № 4, соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Далее был проведен сравнительный анализ частот аллелей и частот генотипов в обеих выборках и их сравнительный анализ между собой. Получены отношения шансов (OR). Результаты представлены в таблице 4.
Были найдены достоверные различия по частотам аллелей, х2 составил 8,0, отношение шансов для мутантно-го аллеля составило 1,64. По частотам генотипов х2 достиг уровня в 6,6 по мутантному генотипу отношение шансов для него превысило составило 1,83.
Обсуждение результатов
У больных с ВГ имело место достоверное и значительное снижение количества коллагена I типа и повышение содержания коллагена III типа в коже по сравнению с больными без грыж (р < 0,05). Соответственно наблюдалось значительное снижение коэффициента соотношения типов коллагена в группе больных с грыжами, у них соотношение коллагенов незначительно превышало 1, что говорит о примерно одинаковом количестве обоих коллагенов в коже. У лиц без ВГ отношение типов коллагенов составило 2,26, что говорит о значительном преобладании коллагенов I типа в их коже. Учитывая указанные,
Иванов С.В., Иванов В.П., Иванов И.С., Барт И.И. КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГРЫЖЕВОЙ БОЛЕЗНИ
значительные различия именно в кожных покровах было решено провести исследование полиморфизма гена эпи-дермального фактора роста.
По исследуемому полиморфизму были найдены значительные достоверные различия между группами № 3 и № 4. Таким образом, шанс развития грыжевой болезни был значительно выше у обладателей мутант-ного генотипа данного полиморфизма. Статистически достоверный уровень различия между двумя выборками подтверждается коэффициентом х2 - 6,6, что также свидетельствует о роли вклада данного полиморфизма в предрасположенность к абдоминальным грыжам. Как известно, все больше внимания уделяется роли цито-кинов в развитие ВГ, в частности, послеоперационных вентральных грыж, что находит свое подтверждение в настоящем исследовании.
11. Jansen P. L., Rosch R., Rezvani M., Mertens P. R., Junge K., Jansen M., Klinge U. Hernia fibroblasts lack ß-estradiol induced alterations of collagen gene expression, BMC Cell Biol. 2006; 10.1186/1471-2121-7-36
12. Junge K, Klinge U, Rosch R, Mertens P.R., Kirch J., Klosterhalfen B., Lynen P., Schumpelick V., Langenbecks Decreased collagen type I/III ratio in patients with recurring hernia after implantation of alloplastic prostheses Arch Surg. 2004 Feb; 389 (1): 17-22.
13. Rich L. Collagen and picrosirius red staining:a polarized light assessment of fibrillar hue and spatial distribution / L. Rich, Whittaker P. // Braz. J. morphol. Sci. (2005) 22(2), - P. 97-104
14. Rosch R. Analysis of collagen-interacting proteins in patients with incisional hernias / R. Rosch, K. Junge, M. Knops, Lynen P., Klinge U., Schumpelick V. // Langenbecks Arch. Surg. - 2003. - Vol. 387, N 11-12. - P. 427-432.
15. Rosch R. A role for the collagen I/III and MMP-1/-13 genes in primary inguinal hernia / Raphael Rosch; Uwe Klinge; Zhongyi Si; Karsten Junge; Bernd Klosterhalfen; Volker Schumpelick // BMC medical genetics 2002; 3: 2.
Выводы
1. У больных с ВГ определяется достоверное снижение соотношения коллагенов I /III типов, по сравнению с пациентами без ВГ.
2. Выявлена прямая корреляционная связь между наличием мутантного генотипа полиморфизма гена EGF +61G/A и снижением соотношения I/III типов коллагена у пациентов с ВГ.
3. Ассоциация наличия мутантного генотипа АА в полиморфизме гена EGF +61G/A и снижение соотношения коллагенов I/III типов в коже у больных с ВГ может служить объективным прогностическим критерием развития грыжевой болезни.
Литература
1. Велигоцкий Н.Н. Хирургическое лечение грыж на фоне дисплазии соединительной ткани / Велигоцкий Н.Н., Комарчук В.В, Комарчук Е.В., и др. // Украинский Хирургический Журнал, 2011, № 3 (12), - С. 236-239.
2. Ефимов Е.А. О вариабельности полноты регенерации кожи / Е.А.Ефимов // В кн.: Клеточные основы регенерации млекопитающих. - М.: Наука, 1984. - С. 78-80.
3. Селезнева И.И. Применение поляризационной термомикроскопии для регистрации процессов формирования и деградации коллагеновых фибрилл / Селезнева И.И., Кузьмин С.В., Николаева Т.И., Рочев Ю.А. Биофизика, 1996, Т. 41,
- С. 541-542.
4. Тимошин А.Д. Концепция хирургического лечения послеоперационных грыж передней брюшной стенки. / А.Д. Тимошин, А.В. Юрасов, А.Л. Шестаков // Гер-ниология. - 2004. - № 1. - С. 5-4.
5. Остеоартроз: современное состояние проблемы (аналитический обзор) / С.П. Миронов, Н.П. Омельяненко, А.К. Орлецкий и др. // Вестн. травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова.2001. - № 2. - С. 96-99.
6. Состояние интерферонового статуса у больных с дегенеративно_дистрофи-ческими заболеваниями коленного сустава / К.А. Новоселов, Н.Н. Корнилов, А.Л. Коваленко и др. // Заболевания и повреждения опорно_двигательного аппарата у взрослых: Тез. докл. 5 обл. науч._ практ.конф. - СПб., 1999. - 49 с.
7. Appleyard R. The relationship of the structure f articular cartilage to its resistance to compressive loading / R. Appleyard, P. Ghosh, M. Swain // J. Bone Jt. Surgery.
- 1996. - Vol. 78_B, Suppl. II & III. - P. 126-127.
8. Bridges A.J. The rationale and strategy used to develop a series of highly potent, irreversible, inhibitors of the epidermal growth factor receptor family of tyrosine kinases / A.J. Bridges // Curr. Med. Chem. - 1999. - Vol. 6. - P. 825-843.
9. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies / D.S. Salomon [et al] // Crit. Rev. Oncol. Hematol. - 1995. - Vol. 19. - P. 183-232.
10. Expression of chondrocyte interleukin_1 in human osteoarthritis (OA) / H.H. Hung, D.C. Mangham, B.W. Treadwell et al. // J. Bone Jt. Surgery. - 1996. - Vol. 78_B, Suppl. II & III. - P. 185-186.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Иванов Илья Сергеевич Тел.: +7 (904) 528-14-28 e-mail: ivanov.is@mail.ru
