CC BY
125
Вестник Томского государственного университета. Биология
2010 № 1 (9)
УДК 581.143:581.132
И.Ф. Головацкая, Р.А. Карначук
Биологический институт Томского государственного университета (г. Томск) E-mail: golovatskaya@mail.tomsknet.ru
РОЛЬ БРАССИНОЛИДА В РЕГУЛЯЦИИ РОСТА И ГОРМОНАЛЬНОГО БАЛАНСА ARABIDOPSIS THALIANA (L.) HEYNH. НА ЗЕЛЕНОМ СВЕТУ
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (грант 08-04-90042-Bel_a) и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (Государственный контракт № П283 от 23.07.2009)
Аннотация. Изучено влияние брассинолида и зеленого света на содержание эндогенных фитогормонов (ИУК, цитокининов и АБК) и морфогенез 7-дневных проростков Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. дикого типа (Col) и мутантной формы (det2), у которых нарушен синтез брассиностероидов. У проростков формы det2 в темноте обнаружено значительно меньшее содержание свободной ИУК и обеих форм АБК и большее содержание цитокининов (зеатина и рибозида зеатина) и связанной ИУК, чем у проростков формы Col. Совместное действие изучаемых факторов синергически увеличивало уровень свободной АБК и площадь семядолей у мутантой формы проростков. Сделан вывод о связи между световым и гормональными сигналами в регуляции роста семядолей A. thaliana.
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.; фотоморфогенез; зеленый свет; фитогормоны; брассинолид; индолил-3-уксусная кислота; зеатин; рибозид зеатина; абсцизовая кислота.
В связи с прикрепленным образом жизни растения вынуждены быть особенно пластичными в ответах на воздействия окружающей среды. Свет, как наиболее важный внешний фактор, является не только источником энергии для фотосинтеза, но и сигналом, изменяющим программу развития растения. Особый интерес представляет роль зеленого света (ЗС) в жизнедеятельности растений [1]. Его регулирующее действие на растения осуществляется через ряд фоторецепторов [2-4] с участием системы вторичных мессенджеров. Согласно мнению ряда исследователей, в эту систему регуляции вовлечены гормоны. Показано, что гормональный статус растений меняется в зависимости от селективного света [5-7]. Известно, что цитокинины (ЦК) участвуют в регуляции ското- и фотоморфогенеза, но в отношении участия брассиностероидов (БР) в светорегуляции морфогенеза данных недостаточно [7, 8]. В настоящее время показано, что наиболее активный представитель брасси-ностероидов - брассинолид - регулирует многие процессы в растении от активности протонного насоса, роста клетки, стебля, дифференциации ксилемы, положения листьев, биосинтеза этилена и пигментов, мужской плодови-
тости и до регуляции фотосинтеза, реакций стресса и фотоморфогенеза [912]. В связи с этим целью работы являлось изучение роли брассинолида в регуляции уровня фитогормонов (ауксинов, цитокининов и абсцизинов) в процессе роста растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. на ранних этапах онтогенеза на зеленом свету.
Объект и методики исследования
Объектами исследования служили растения двух линий Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. экотипа Columbia (Col) и его мутантная форма det2 с нарушенным биосинтезом брассиностероидов [13].
Стерильные семена Arabidopsis высевали в чашки Петри на жидкую питательную среду / МС [14] с добавлением 10-7 М брассинолида (БЛ). Брасси-ностероиды любезно предоставлены профессором В.А. Хрипачом (Институт биоорганической химии НАН Беларуси, г. Минск). В контроле использовали среду без добавления гормона. Для синхронизации прорастания семена выдерживали в течение 3 сут в темноте при +6°С, затем 3 ч освещали с помощью люминесцентных ламп ЛД-40 (33 Вт/м2) и помещали в темноту, где экспонировали 7 сут в условиях полной темноты или ежедневного кратковременного (60 мин) освещения ЗС (X = 543 нм, плотность потока квантов 3,0 мкмоль/(м2с)). Длину гипокотилей и площадь семядолей измеряли у ста проростков каждого варианта.
Количественное определение ИУК, АБК и цитокининов (зеатина и рибо-зида зеатина - РЗ) проводили с помощью твердофазного иммуноферментного метода [15], используя моноклональные антитела к свободным формам ИУК, АБК и зеатину и антивидовые антитела, меченные пероксидазой («Фармхим-инвест», Россия). Измерение плотности растворов определяли на микрофотометре «Specord M-40» при длине волны 492 нм.
Далее на рис. 1, 2 приведены данные в виде средних арифметических со стандартными ошибками.
Результаты и обсуждение
Моделью для изучения фотоморфогенеза были выбраны растения араби-допсис мутантной формы, имеющие многие характеристики светового фенотипа при выращивании в темноте [16]. Световой фенотип растущих в темноте мутантных форм det2 проявлялся в коротких и утолщенных гипокотилях, открытых и расширенных семядолях, раскрытых первичных зародышевых листьях. Гипокотиль у таких проростков был короче и толще дикого типа, а семядоли - крупнее, чем Col (рис. 1).
Преждевременное прекращение роста осевого органа и развитие семядолей в темноте показывают, что в растениях без видимой необходимости происходит экспрессия генов, обычно регулируемых светом. Кроме того, нарушается метаболизм БР, т.к. нарушены реакции преобразования 2Н-кампестерола в 2Н-кампестанол. Растения формы det2 накапливают только 8-15% уровня кам-пестанола и меньше 10% других брассиностероидов по сравнению с растения-
ми дикого типа. Такие фенотипические и метаболические различия между мутантным det2 и диким типами арабидопсис позволяют предполагать важную роль DET2 в развитии этих растений.
Данные, представленные на рис. 1, показывают участие БЛ в регуляции морфогенеза линий Col и det2, различающихся по содержанию эндогенных БР, в темноте и на ЗС. Действие 10-7 М БЛ в темноте было малоэффективно в отношении растяжения семядолей обеих линий. Тогда как растяжение гипо-котилей проростков дефицитного по БР мутанта det2 увеличилось (на 27%), частично восстанавливая этиолированный фенотип гипокотилей исходной линии. Действие экзогенного БЛ на рост корня зависело от уровня эндогенных БР: при их недостатке (det2) растяжение увеличивалось, тогда как при норме (Col) - тормозилось. Аналогичная ростовая реакция растений дикого типа отмечена и другими авторами [17, 18].
Рис. 1. Влияние брассинолида (БЛ, 10-7 М) на морфогенез 7-дневных проростков арабидопсиса в темноте (Т) и при деэтиоляции на зеленом свету (ЗС, 543 нм, 3 мкМквант/(м2с), 60 мин)
Деэтиоляция на ЗС низкой интенсивности (543 нм, 3 мкМквант/(м2с)) была малоэффективна в отношении ингибирования роста гипокотилей у обеих линий, но существенно увеличила размеры семядолей (на 17 и 25% соответственно у det2 и Col). Из полученных данных видно, что чувствительность ростовых реакций к ЗС у мутантного типа арабидопсис была меньше, чем у дикого типа. Возможно, недостаток БР, выступающих в качестве трансдукто-ров светового сигнала, снижал ответные реакции растений типа det2 на свет.
Обработка БЛ (10-7 М) повысила ростовой ответ семядолей на действие ЗС. При этом был отмечен аддитивный эффект совместного действия ЗС и экзогенного гормона на рост семядолей дикого типа и синергический эффект - на рост семядолей мутантного типа (см. рис. 1). Последняя ростовая реакция была аналогична реакции, отмеченной нами для линий экотипа Landsberg erecta (Ler) при совместном действии ЗС и другого брассиносте-роида 24-эпибрассинолида (ЭБЛ) [19]. Кроме того, экзогенный БЛ восстанавливал ростовую реакцию корня растений мутантного типа на ЗС до уровня дикого типа.
Различия в морфогенезе проростков Col и det2 были обусловлены изменениями их гормонального статуса (рис. 2). В темноте деэтиолированные проростки фенотипа det2 характеризовались повышенным уровнем ЦК (зеатина и РЗ) и связанной ИУК, пониженным уровнем свободной ИУК и обеих форм АБК по сравнению с этиолированными проростками фенотипа Col. Подобную динамику гормонов отмечали для выращенных на свету растений и другие авторы [7]. Результаты анализа гормонального баланса показали, что мутация гена DET2 сопряжена с 7-кратным снижением отношения ИУК свобод-ная/зеатин и 2-кратным увеличением отношения свободных форм ИУК/АБК по сравнению с нормой.
Деэтиоляция на ЗС уменьшила содержание обеих форм ИУК в растениях мутантного фенотипа и только свободной формы гормона в проростках дикого типа. Светозависимое снижение активности ауксинов после облучения красным светом показано другими авторами [20, 21]. ЗС повысил уровень зеатина у дикого типа за счет высвобождения из связанных форм, а у мутантного типа снизил уровень обеих форм ЦК. В деэтиолированных проростках обеих линий уменьшилось содержание свободной и связанной АБК по сравнению с этиолированными проростками.
Обработка 10-7 М БЛ проростков мутантного фенотипа в темноте по уровню ИУК и ЦК частично напоминала их деэтиоляцию на ЗС. Оба фактора, гормон и свет, действующие по отдельности, устанавливали одинаковый уровень ингибитора роста АБК у обеих линий растений.
Совместное действие факторов (БЛ+ЗС) на проростки арабидопсиса снизило уровень РЗ у обеих линий и синергически увеличило уровень свободной АБК в проростках мутантного типа (рис. 2), что показано нами ранее для Ler при действии ЭБЛ на ЗС [19]. Регуляция БЛ гормонального баланса арабидопсиса, вероятно, зависела от светорегулируемого изменения уровня эндогенных гормонов, в том числе и БР [22, 23].
Со1
□ АБК свободная В АБК связанная
Темнота (Т) Т + БЛ
Т+ЗС Т + ЗС + БЛ
Рис. 2. Влияние брассинолида (БЛ, 10 7 М) на содержание фитогормонов в 7-дневных проростках арабидопсиса в темноте (Т) и при деэтиоляции на зеленом свету (ЗС, 543 нм, 3 мкМ-квантам2 с), 60 мин)
Таким образом, впервые показано, что брассинолид участвует в регуляции морфогенеза на начальных этапах онтогенеза A. thaliana в темноте и при де-этиоляции на зеленом свету. Брассинолид изменяет баланс эндогенных фитогормонов. Аддитивный или синергический характер совместного действия брассинолида и зеленого света с длиной волны 543 нм на рост семядолей разных линий арабидопсиса проявляется через изменение уровня эндогенных фитогормонов, в том числе и уровня АБК (det2).
Полученные данные позволяют предполагать участие брассиностероидов в трансдукции сигнала зеленого света при регуляции фотоморфогенеза растений арабидопсиса.
Авторы выражают благодарность М.В. Ефимовой за помощь в проведении ряда экспериментов.
Литература
1. Карначук Р.А. Регуляторное влияние зеленого света на рост и фотосинтез листьев //
Физиология растений. 1987. Т. 34, вып. 4. С. 765-773.
2. Карначук Р.А., Постовалова В.М., Беленькая Е.В., Жуланова С.Г. Фитохромный кон-
троль метаболизма 14С-углеводов в растениях // Физиология растений. 1978. Т. 25. С. 268-271.
3. Головацкая И.Ф. Роль криптохрома 1 и фитохромов в регуляции фотоморфогенетиче-
ских реакций растений на зеленом свету // Физиология растений. 2005. Т. 52. С. 822829.
4. Головацкая И.Ф., Карначук Р.А., Ефимова М.В. и др. Роль криптохрома 1 и фитохромов
А-Е в регуляции роста арабидопсиса на зеленом свету // Вестник Томского государственного университета. 2007. № 297. С. 184-187.
5. Карначук Р.А., Негрецкий В.А., Головацкая И.Ф. Гормональный баланс листа растений
на свету разного спектрального состава // Физиология растений. 1990. Т. 37, вып. 3. С. 527-534.
6. Карначук Р.А., Головацкая И.Ф. Гормональный статус, рост и фотосинтез растений,
выращенных на свету разного спектрального состава // Физиология растений. 1998. Т. 45, вып. 6. С. 925-934.
7. Chory J., Reinecke D., Sim S. et al. A role for cytokinins in de-etiolation in Arabidopsis: det
mutants have an altered response to cytokinins // Plant Physiol. 1994. Vol. 104. P. 339-347.
8. Neff M., Nguyen S.M., Malancharuvil E.J. et al. BAS1: A gene regulating brassinosteroid lev-
els and light responsiveness in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 96. P. 15316-15323.
9. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. Минск: Наука и техника,
1993. 287 с.
10. Прусакова Л.Д., Чижова С.И. Роль брассиностероидов в росте, устойчивости и продуктивности растений // Агрохимия. 1996. № 11. С. 137-150.
11. Cbuse S.D., Sasse J.M. Brassinosteroids: Essential Regulators of Plant Growth and Development // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. Vol. 49. P. 427-451.
12. Головацкая И.Ф., Никонорова Н.М. Рост и продуктивность растений в зависимости от их чувствительности к свету и способа обработки брассинолидом // Агрохимия. 2008. № 1. С. 46-51.
13. Koorneef M., RolffE., Spruit C.J.P. Genetic control of light-inhibited hypocotyl elongation in Arabidopsis thaliana L. Heynh // Z. Pflanzenphysiol. 1980. Vol. 100. P. 147-160.
14. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 473-497.
15. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н. и др. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. 1990. Т. 37. С. 193-199.
16. Chory J, Peto C., Feinbaum R., Pratt L., Ausubel F. Arabidopsis thaliana mutant that develops as a light-grown plant in the absence oflight // Cell. 1989. Vol. 58. P. 991-999.
17. Clouse S.D., Langford M., Hall A.F. et al. Physiological and molecular effects of brassinos-teroids on Arabidopsis thaliana // Plant Growth Regul. 1993. Vol. 12. P. 61-66.
18. Schumacher K., Chory J. Brassinosteroid signal transduction: still casting the actors // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. Vol. 3. P. 79-84.
19. Карначук Р.А., Головацкая И.Ф., Ефимова М.В., Хрипач В.А. Действие эпибрассиноли-да на морфогенез и соотношение гормонов у проростков Arabidopsis на зеленом свету // Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 591-595.
20. Briggs W.R. Red light, auxin relationships and the phototropic responses of corn and oat col-eoptiles // Am. J. Bot. 1963. Vol. 50. P. 196-207.
21. Muir R.M., Zhu L. Effeet of light in the control or growth by auxin and its inhibitor(s) in the sunflower // Physiol. Plant. 1983. Vol. 57. P. 407-410.
22. Clouse S.D. Integration of light and brassinosteroid signals in etiolated seedling growth // Trends Plant Sci. 2001. Vol. 6. P. 443-445.
23. Li J., Nagpal P., Vitart V. et al. A Role for brassinosteroids in light-dependent development in Arabidopsis // Science. 1996. Vol. 272. P. 398-401.
Поступила в редакцию 03.12.2009 г.
Irina F. Golovatskaya, Raisa A. Karnachuk
Biological Institute of Tomsk State University, Tomsk, Russia E-mail: golovatskaya@mail.tomsknet.ru
THE EFFECT OF BRASSINOLIDE ON ARABIDOPSIS SEEDLINGS GROWTH AND HORMONAL BALANCE UNDER GREEN LIGHT
Summary. Studied the effects of brassinolide (BL) and green light (GL) on the content of endogenous phytohormones (IAA, cytokinins, and ABA) and morphogenesis of 7-day-old Arabidopsis thaliana (L.) Heynh seedlings of wild type (Col) and its det2 mutant with disturbed synthesis of brassinosteroids. In darkness the mutant det2 contained considerably less free IAA and both forms of ABA, but much more cytokinins (zeatin and zeatin riboside) and bound IAA, as compared to the wild-type seedlings. Level of free ABA and area of cotyledon increased under action of factors GL+BL. The conclusion is that green light and brassinolide signals interact in the control of the cotyledon growth in A. thaliana seedlings.
Key words: Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.; photomorphogenesis; green light; brassinolide; IAA; zeatin; zeatin riboside; ABA.
Received December 03, 2009
