CC BY
183
ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БРАССИНОЛИДА В СВЕТОВОМ РАЗВИТИИ ПРОРОСТКОВ ARABIDOPSIS THALIANA*
М.В. Ефимова
Кафедра физиологии растений и биотехнологии Томский государственный университет пр. Ленина, 36, Томск, Россия, 634050
Лаборатория экспрессии генома растений Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН ул. Ботаническая, 35, Москва, Россия, 127276
В статье рассказывается о проведении исследований регуляторной роли наиболее активного представителя семейства брассиностероидов — брассинолида — в развитии проростков в темноте. Изучены ростовые показатели и состав фотосинтетических пигментов проростков в зависимости от условий освещения. В качестве объекта исследований были выбраны растения арабидопсиса — Arabidopsis thaliana, отличающиеся по эндогенному уровню брассиностероидов — родительская линия экотипа Columbia и его мутант det2 с нарушенным синтезом брассинолида. Отмечена зависимость ростовых показателей проростков от концентрации брассинолида. Показана физиологическая активность зеленого света, наряду с синим, в регуляции развития растений A. thaliana на начальных этапах онтогенеза. Высказано предположение о тесной связи между выбором определенной программы развития растений — скотоморфогенезом или фотоморфогенезом — и эндогенным уровнем брассиностероидов.
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana L. (Heynh), брассиностероиды, брассинолид, фотоморфогенез, скотоморфогенез, фотосинтетические пигменты, синий свет, зеленый свет.
Развитие растений на начальных этапах онтогенеза в зависимости от влияния внутренних и внешних факторов может идти по двум программам — темнового (скотоморфогенез) или светового развития (фотоморфогенез). Свет, как внешний фактор, не только запускает фотосинтетические реакции, но и регулирует рост и развитие растений в зависимости от интенсивности и спектрального состава. Начальные признаки активации светового развития проростков — укорочение осевых органов, увеличение размеров семядолей и синтез фотосинтетических пигментов. В то же самое время в управление фотоморфогенезом могут быть включены эндогенные регуляторы — фитогормоны. Фитогормоны могут выступать или в качестве вторичных посредников между регуляторным пигментом (фоторецептором) и определенным физиологическим ответом, или самостоятельно запускать реакции фотоморфогенеза в темноте [1—5]. Особое место в ходе этого процесса отводится сравнительно новому классу фитогормонов — брассиностероидам (БС). Физиологическая роль БС проявляется при очень низких их концентрациях. Основные сферы применения БС в сельском хозяйстве — стимуляция роста и развития растений, повышение их продуктивности и устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды. Положительное влияние брассиностероидов на рост и развитие, скорее всего, связано со способностью изменять гормональный баланс
* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг. (мероприятие 1.3.1) (Государственный контракт № П 1369 от 2 сентября 2009 г.) и РФФИ.
растений [4]. В свою очередь, эндогенный уровень брассиностероидов и чувствительность к ним растений находятся под непосредственным контролем фоторецепторов красного и синего света — фито- и криптохромов [5; 6]. В связи с тем что многие исследователи рассматривают зеленую область спектра в качестве неактивного участка ФАР [2; 7], ее роль в реализации регуляторной функции брасси-ностероидов не изучали.
Чтобы оценить роль брассиностероидов (брассинолида) в темновом развитии растений и значение брассиностероидов в формировании ответной реакции растений на синий и зеленый свет, мы изучали влияние различных концентраций брассинолида на морфогенез этиолированных проростков и селективного света на морфогенез и пигментный состав проростков Arabidopsis thaliana, отличающихся по эндогенному уровню брассиностероидов.
Объект и методики исследования. Работа выполнена на модельном растении Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (сем. крестоцветные) экотипа Columbia и его мутанта (det2) с нарушениями светового развития за счет недостаточного синтеза брассиностероидов. Семена A. thaliana стерилизовали 3%-й Н2О2 и высевали в чашки Петри на модифицированную жидкую среду Мурасиге-Скуга (MS) с половинным составом солей. Для стимуляции и синхронизации прорастания семена арабидопсиса выдерживали в течение 3 дней при температуре 4—6 °С и предосве-щали белым светом (люминесцентные лампы ЛД-40, 3 часа, 3700 люкс). После чего семена проращивали на постоянном синем или зеленом свету (цветные лампы фирмы «Philips», A^ax = 460 нм или 545 нм; плотность потока падающих квантов составляла 160 мкмоль/м • с) при фотопериоде 16 ч/8 ч и температуре воздуха 22 ± 2 °С. В качестве контроля использовали 7-дневные проростки, выращенные в темноте.
Для изучения влияния брассинолида на морфогенез проростков Arabidopsis
в питательную среду 1/2 MS до стратификации семян добавляли разные концентра_12 _6
ции брассинолида (10 —10 М). Синтетический аналог брассиностероидов (брас-синолид) любезно предоставлен чл.-корр. НАН Беларуси В.А. Хрипачем (лаборатория химии стероидов Института биоорганической химии НАН Беларуси, Минск).
Для оценки уровня фотосинтетических пигментов определенное количество проростков растирали в 96% этаноле и центрифугировали (10 мин. при 8 тыс. об./мин., центрифуга многофункциональная Eppendorf 5804R). Оптическую плотность пробы определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-1650. Концентрацию пигментов в спиртовой вытяжке рассчитывали согласно H.K. Lichtenthaler [8].
Длину гипокотилей проростков A. thaliana измеряли под лупой БМ-51-2, а площадь семядолей — под микроскопом Micros МС 100 (Австрия) с помощью цифровой камеры Moticam 2000 (Испания) и программы Motic Images Plus 2.0. Для каждого варианта измеряли по 35—50 проростков в каждой из трех биологических повторностей. Результаты экспериментов представлены на рис. 2—4 как средние арифметические и их стандартные ошибки. Для сравнения независимых выборок, подчиняющихся закону нормального распределения, использовали параметрический критерий Стьюдента. Значения t-критерия находили для 95%-го уровня значимости (р < 0,05).
Результаты и обсуждение. В настоящее время активно обсуждается, положительную или отрицательную роль выполняют брассиностероиды в световом развитии растений. Для исследования этой проблемы изучали ответную реакцию растений на экзогенный брассинолид и специфику ответной реакции проростков на селективный свет в зависимости от эндогенного уровня брассиностероидов. Нарушение гена DET2, кодирующего стероид-5а-редуктазу (рис. 1), приводит к значительному уменьшению эндогенного уровня брассиностероидов в растениях АгаЫёор$18 и позволяет анализировать реакцию проростков на экзогенные факторы в зависимости от содержания брассиностероидов.
кампестерол кампестенол орассинолвд
Рис. 1. Этап в биосинтезе брассиностероидов, контролируемый геном DET2
Проявление мутации заключалось в укорочении зародышевого стебля (гипо-котиля), увеличении площади семядолей и повышении уровня фотосинтетических пигментов (хлорофилла b) в темноте относительно проростков экотипа Columbia (Col) с конститутивным уровнем брассиностероидов (рис. 2, 3). Это может свидетельствовать о том, что продукт гена DET2 может быть отрицательным регулятором светового развития проростков, так как его отсутствие вызывало проявление светового фенотипа проростков в условиях темноты. В соответствии с этим экзогенные брассиностероиды в темноте не могут запускать реакции фотоморфогенеза.
Однако результаты наших исследований отражают способность брассиностероидов индуцировать световое развитие в условиях темноты. Ранее было показано, что один из брассиностероидов — эпибрассинолид — способен вызывать не только синтез фотосинтетических пигментов, но и формирование светового фенотипа у проростов — укороченных гипокотилей и крупных семядолей [9; 10].
Экзогенный брассинолид в широком диапазоне концентраций вызывал аналогичные морфологические изменения проростков дикого типа Col (рис. 2). При этом
укорочение гипокотилей наблюдалось под действием брассинолида в концент-—12 —6
рации 10 —10 М, тогда как стимулирующее влияние на рост семядолей брасси-
—8 —6
нолид оказывал при более высоких концентрациях —10 —10 М. Фенотип проростков мутанта det2 под влиянием экзогенного брассинолида в концентрации 10-12—10-6 М частично восстанавливался до фенотипа проростков дикого типа. Нарушенное за счет недостаточного синтеза брассинолида удлинение клеток осевых органов восстанавливалось под действием экзогенного брассинолида, что про-
водило к удлинению гипокотиля (рис. 2) и корня (данные не показаны). Таким образом, можно предположить, что существует тесная связь между выбором определенной программы развития растений — скотоморфогенез (развитие в темноте) или фотоморфогенез — и эндогенным уровнем брассиностероидов.
Рис. 2. Влияние брассинолида на морфогенез этиолированных проростков Arabidopsis thaliana
Рис. 3. Содержание фотосинтетических пигментов в проростках Arabidopsis thaliana, растущих в темноте (Т) и на селективном свету (СС — синий свет, ЗС — зеленый свет)
Для изучения роли брассиностероидов в реализации световой программы растений в зависимости от качественного состава света (синяя или зеленая область спектра) и разновидности активируемого им фоторецептора мы оценивали ростовые показатели и пигментный состав растений, отличающихся по эндогенному уровню брассиностероидов в зависимости от условий освещения. Контролем служили 7-суточные этиолированные проростки.
Ежедневное освещение проростков Arabidopsis селективным светом запускало программу светового развития у проростков родительской линий Col и его мутанта det2 (рис. 4). Чувствительность проростков к свету зависела от эндогенного
уровня брассиностероидов и качественного состава света. Наибольшая ответная реакция у проростков с достаточным уровнем БС отмечена при ежедневном освещении синим светом. При этом длина гипокотиля на синем свету в сравнении с контролем уменьшалась в 7,5 раз, а площадь семядолей увеличивалась примерно в 5 раз (рис. 4). Аналогичные показатели на зеленом свету изменялись в два раза.
Рис. 4. Влияние селективного света на морфогенез проростков Arabidopsis thaliana экотипа Columbia (Col) и его мутанта с нарушенным синтезом брассинолида (det2):
Т — темнота (контроль), СС — синий свет, ЗС — зеленый свет; * — различия достоверны при р < 0,05
Меньшая активность зеленого света в отношении гипокотилей и проростков арабидопсис может быть объяснена тем, что зеленый свет усиливает растяжение гипокотилей на начальных этапах развития, в то время как другие участки ФАР интенсивно подавляют рост осевых органов [11—19]. Уровень фотосинтетических пигментов на селективном свету значительно увеличивался (рис. 3). Наибольшая ответная реакция была достигнута также на синем свету, суммарный уровень хло-рофиллов по сравнению с контролем (темнота) увеличивался в 16 раз (в основном за счет хлорофилла а) и каротиноидов — в 12,5 раз; на зеленом свету различия составляли 7 и 4,5 раз соответственно.
Ответная реакция осевых органов проростков арабидопсиса с пониженным уровнем брассиностероидов на действие селективного света была более выраженной по сравнению с ответом родительской линии. Различия ростовых показателей для гипокотилей родительской и мутантной линий увеличивались с 1,5 раз в темноте до 3,7 на синем и 5,8 раз на зеленом свету (рис. 4). При этом наблюдалось значительное подавление роста корневой системы — примерно в 8 раз по сравнению с реакцией проростков родительской линии. Изменения площади семядолей были незначительными, наибольшее увеличение размеров семядолей отмечено у проростков, постоянно растущих на зеленом свету. Отмечено снижение чувствительности фотосинтетических частей проростков к действию селективного света. Ответная реакция пигментной системы мутантных проростков в сравнении с диким типом также ослаблена, причем в значительной степени на синем свету (рис. 3).
На основании сходной реакции пигментной системы проростков, отличающихся по эндогенному уровню брассиностероидов, на зеленый свет, можно предположить, что для реализации программы светового развития, инициированного зеленым светом, брассиностероиды являются альтернативными посредниками.
Рис. 5. Модель активации программы фотоморфогенеза у этиолированных проростков ЛгаЫёорз'13 ^аИапа
Таким образом, нами показана физиологическая активность зеленого света наряду с синим в регуляции морфогенеза и пигментного состава проростков Ara-bidopsis thaliana. На основании полученных результатов по действию селективного света на морфогенез проростков Arabidopsis и инициации светового развития у проростков det2 в темноте можно предположить наличие связи между выбором определенной программы развития растений — скотоморфогенез или фотоморфогенез — и эндогенным уровнем брассиностероидов (рис. 5). В свою очередь, реализация регуляторной роли брассиностероидов зависит от селективного состава света.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Li J., Nagpal P., Vitart V., McNorris Т.О., Chory J. A role for brassinosteroids in light-dependent development in Arabidopsis // Science. — 1996. — Vol. 272. — P. 398—401.
[2] Chory J., Reinecke D., Tim S., Wasburn T., Brenner M. A role for cytokinins in de-etiolation in Arabidopsis // Plant Physiol. — 1994. — Vol. 104. — P. 339—347.
[3] Kravtsov A.K., Zubo Y.O., Yamburenko M.V., Kulaeva O.N., Kusnetsov V.V. Cytokinin and abscisic acid control plastid gene transcription during barley seedling de-etiolation // Plant Growth Regulation. — 2011. — DOI 10.1007/s10725-010-9553-y.
[4] Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Karnachuk R.A. Chemical probes in biology / Science at the interface of brassinosteroids: a new role of steroids as biosignaling molecules. — 2003. — M.P. Schneider. Ed. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. — Vol. 129. — P. 153—167 (NATO Science Series).
[5] Neff M.M., Nguyen S.M., Malancharuvil E.J., Fujioka S., Noguchi T., Seto H., Tsubuki M., Honda T., Takatsuto S., Yoshida S., Chory J. BAS1: a gene regulating brassinosteroid levels and light responsiveness in Arabidopsis // PNAS. — 1999. — Vol. 96. — P. 15316—15323.
[6] Symons G.M., Reid J.B. Brassinosteroids do not undergo long-distance transport in pea. Implications for the regulation of endogenous brassinosteroid levels // Plant Physiol. — 2004. — Vol. 135. — P. 2196—2206.
[7] Pédron J., Agnes C., Simond-Côte E., Costa C., Lobstein E., Kraepiel Y. Polar auxin transport is required for the inhibition by blue light of the elongation-related LeXT tomato gene // Plant Growth Regulation. — 2004. — Vol. 42. — P. 113—123.
[8] Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes // Methods in Enzymology. — 1987. — № 148. — P. 350—382.
[9] Ефимова М.В., Елисеева М.А. Регуляция эпибрассинолидом морфогенеза и содержания фотосинтетических пигментов в проростках Arabidopsis thaliana (L.) // Труды Томского государственного университета. Серия биологическая. — 2010. — Т. 275. — С. 267—271.
[10] Карначук Р.А., Головацкая И.Ф., Ефимова М.В., Хрипач В.А. Действие 24-эпибрассинолида на морфогенез и соотношение гормонов у проростков Arabidopsis на зеленом свету // Физиология растений. — 2002. — Т. 49. — № 4. — С. 591—595.
[11] Карначук Р.А. Регуляторное влияние зеленого света на рост и фотосинтез листьев // Физиология растений. — 1987. — Т. 34. — № 4. — С. 765—773.
[12] Folta K.M. Green light stimulates early stem elongation, antagonizing light-mediated growth inhibition // Plant Physiology. — 2004. — Vol. 135. — P. 1407—1416.
[13] Dhingra A., Bies D.H., Lehner K.R., Folta K.M. Green light adjusts the plastid transcriptome during early photomorphogenic development // Plant Physiology. — 2006. — Vol. 142. — P. 1256—1266.
[14] Folta K.M., Maruhnich S.A. Green light: a signal to slow down or stop // Journal of Experimental Botany. — 2007. — Vol. 58. — № 12. — P. 3099—3111.
[15] Ефимова М.В. Роль света и брассиностероидов в регуляции морфогенеза Arabidopsis thaliana (L.) Heynh: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. — М., 2006.
[16] Минич А.С., Минич И.Б., Зеленчукова Н.С., Карначук Р.А., Головацкая И.Ф., Ефимова М.В., Райда В.С. Роль красного люминесцентного излучения низкой интенсивности в регуляции морфогенеза и гормонального баланса Arabidopsis thaliana // Физиология растений. — 2006. — Т. 53. — № 6. — С. 863—868.
[17] Карначук Р.А., Большакова М.А., Ефимова М.В., Головацкая И.Ф. Интеграция сигналов синего света и жасмоновой кислоты в морфогенезе Arabidopsis thaliana (L.) Heynh // Физиология растений. — 2008. — Т. 54. — № 5. — С. 665—670.
[18] Карначук Р.А., Гвоздева Е.С., Ефимова М.В. Светорегуляция морфогенеза трансгенных растений табака in vivo и in vitro // Физиология растений. — 2008. — Т 55. — Вып. 4. — С. 560—564.
[19] Ефимова М.В. Физиологическая роль брассиностероидов в развитии проростков Arabidopsis thaliana L. (Heynh) на селективном свету // Вестник Томского государственного университета. Биология. — 2010. — № 4 (12). — С. 106—116.
PHYSIOLOGICAL ROLE OF BRASSINOLIDE IN THE LIGHT DEVELOPMENT OF ARABIDOPSIS THALIANA SEEDLING
M.V. Efimova
Department of botany, plant physiology and agrobiotechnology Russian People's Friendship University
Miklukho-Maklaya str., 8/2, Moscow, Russia, 117198
Timirjazev Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Science Botanicheskaya str., 35, Moscow, Russia, 127276
The regulatory role of more active brassinosteroids — brassinolide in seedling development in darkness was studied. The growth parameters and photo synthetic pigment content of Arabidopsis thaliana seedlings under differ light conditions were investigated. The plant model to study regulatory role of selective light and brassinosteroids are Arabidopsis thaliana. A. thaliana ecotype Columbia (Col) and det2 mutant with disturbed synthesis of brassinolide were used. The plant grow parameters depending on the brass-inolide concentration. Physiological activity of green light also blue light in the regulation of Arabidopsis seedling development was noted. The interaction between plant development program — skoto- or pho-tomorphogenesis and endogenous level of brassinosteroids has been shown.
Key words: Arabidopsis thaliana L. (Heynh), brassinosteroids, brassinolide, photomorphogene-sis, skotomorphogenes, pigment content, blue light, green light.
