CC BY
43
УДК: 613.817:614.2
РОЛЬ БИОМАРКЕРА CDT В ОБЕСПЕЧЕНИИ БЕЗОПАСНОСТИ
ДОРОЖНОГО ДВИЖЕНИЯ
А.В. Михайлова, А.В. Хапкина, Л.А. Желткова, О.Н. Понаморева
В настоящее время растет количество водителей, регулярно употребляющих спиртные напитки, что приводит к увеличению дорожно-транспортных происшествий (ДТП). В связи обязательным станет анализ на выявление хронического алкоголизма с использованием маркера - карборгидрат-дефицитного трансферрина (углевод-дефицитный трансферрин, carbogidrate-deficient transferin, CDT) для получения водительских прав и их восстановления после лишения. В данной работе на основе результатов выполненных исследований по определению содержания этилового спирта и CDT в биологических жидкостях водителей, попавших в ДТП в Тульской области, обосновывается необходимость внедрения в практику дорожной медицины анализа по определению CDT в крови, выполняемого с использованием метода капиллярного электрофореза.
Ключевые слова: алкоголизм, биомаркер, дорожно-транспортные происшествия, ДТП, карборгидрат-дефицитный трансферрин, CDT
Введение
Приказом Министерства здравоохранения № 344н в 2019 году внесены изменения в порядок проведения обязательного медицинского освидетельствования водителей: с 1 июля 2020 года обязательным становится анализ крови на содержание биологического маркера хронического алкоголизма - карборгидрат-дефицитного трансферрина [1]. Трансферрин - белок сыворотки крови, является основным переносчиком железа и представляет собой гликозилированный протеин, в котором пептидная цепь связана с двумя разветвленными углеводными цепочками, содержащими до восьми остатков сиаловых кислот на концах. В зависимости от числа остатков сиаловых кислот в молекуле белка различают несколько изоформ трансферина [2,3].
У здоровых людей, не злоупотребляющих алкоголем, преобладает тетра- и пентасиалотрансферин (около 95%). Этанол и его метаболит -ацетальдегид ингибируют активность ферментов, участвующих в гликозилировании трансферина [4,5]. Хроническое злоупотребление алкоголя (40-60 г и больше ежедневно на протяжении нескольких дней) изменяет нормальное соотношение изоформ трансферрина в сыворотке и приводит к повышению уровня низкосиалированных форм, называемых также карбогидрат-дефицитными, к которым относятся дисиало, моносиало- и асиало- трансферрины [4]. В норме карборгидрат-дефицитный трансферрин (CDT) не превышает 1,3%, тогда как при регулярном употреблении алкоголя уровень CDT может возрастать в 10-15
раз [6]. Таким образом, определяя количество карбогидрат-дефицитных форм трансферрина, можно выявить людей, злоупотребляющих алкоголем.
Для определения уровня CDT в крови разработан широкий спектр методов, среди которых практическое применение нашли методы непрямой и прямой иммунонефелометрии, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез. Разделение изоформ трансферрина методом капиллярного электрофореза основано на разнице их электрического заряда, величина которого прямо пропорциональна количеству остатков сиаловой кислоты [7]. Этот метод обладает следующими преимуществами - высокой разрешающей способностью, чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, производительностью, возможностью полной автоматизации процесса [8].
В настоящее время увеличивается роль данного анализа в связи с ростом количества водителей, регулярно употребляющих спиртные напитки. На территории России в 2019 году зарегистрировано свыше 14 тысяч дорожно-транспортных происшествий (ДТП) с участием водителей, находившихся за рулем в состоянии опьянения. Конечно, для установления факта употребления водителем спиртных напитков проводят определение содержания этилового спирта в биологических жидкостях или в выдыхаемом воздухе. Однако лишь 5% этанола выводится в неизменном виде с мочой, потом и выдыхаемым воздухом, где он может быть детектирован в течение только нескольких часов (менее 12 часов) после употребления. Большая часть (90-95%) всосавшегося алкоголя окисляется в печени под действием ферментов, активность которых выше у людей, регулярно употребляющих алкоголь, так как этанол является индуктором микросомальных ферментов печени [7,8,9]. Это приводит к увеличению скорости его расщепления в организме до промежуточных токсичных соединений, и это может помешать выявлению факта употребления алкоголя водителем перед поездкой.
Определение CDT выполняется на дорогостоящем оборудовании квалифицированным медицинским персоналом и является достаточно трудоемким, что отражается на стоимости анализа, поэтому в обществе возникает вопрос: так ли необходимо это исследование для освидетельствования водителей и, тем более, для получения водителями прав по управлению транспортным средством?
В данной работе на основе результатов выполненных исследований по определению содержания этилового спирта и CDT в биологических жидкостях водителей, попавших в ДТП в Тульской области, обосновывается необходимость внедрения в практику дорожной медицины анализа по определению CDT в крови методом капиллярного электрофореза.
Материалы и методы исследования
На базе ГУЗ ТОНД №1 «Тульский областной наркологический диспансер» с января по декабрь 2019 года проведено исследование среди водителей, попавших в ДТП на дорогах Тульской области, на выявление употребления алкоголя и мониторинга регулярного потребления ими спиртных напитков.
Содержания этанола в биологических жидкостях (крови и моче) определяли алкилнитритным методом газовой хроматографии согласно аттестованной методике «Методика измерений массовой концентрации этанола в крови, моче и слюне» [10]. Анализ осуществляли на газовом хроматографе Agilent 6850 Series II с детектором по теплопроводности, с пассивным термостатом и пределом детектирования по этанолу 2*10-8 г/см3 (с металлической набивной колонкой 2м*3мм, заполненной ПЭГ-1500 (20% на инзенском кирпиче 600, модифицированном серебром; газ носитель-Не). Методика устанавливает процедуру измерений массовой концентрации этанола в крови и моче в диапазоне от 0,03 до 12,00 г/дм3. Абсолютная погрешность метода - 0,07 г/дм3.
Определение CDT в крови проводили методом капиллярного электрофореза на автоматической капиллярной системе Capillarys (Sebia, Франция) и с использованием специфических регентов для определения CDT (Sebia, Франция) в соответствии с описанием [11]. За результат показателя уровня CDT в крови принимается суммарное значение асиало-и моносиало- изоформ трансферрина по отношению к общему содержанию всех изоформ трансферина. Предельно допустимое значение составляет 1,3%. Результаты качественной и количественной оценки импортируются в протокол исследования, служащий приложением к заключению о результатах анализа.
Результаты исследования и их обсуждение
После дорожно-транспортного происшествия в обязательном порядке проводится освидетельствование водителей на употребление спиртных напитков. Для этого определяют содержание этанола в крови водителей методом газовой хроматографии. Если значение этанола более 0,06 г/дм3, то это свидетельствует о факте потребления алкоголя в ближайшие сутки.
Из общего числа водителей, обследованных на содержание алкоголя в биологических жидкостях в лаборатории Тульского областного наркологического диспансера с января по декабрь 2019 г. (всего 2611 человек), у 1074 человек (41%) выявлено превышение массовой доли этанола в крови. Данная статистика сама по себе является неутешительной и свидетельствует о значительном количестве водителей, находящихся в состоянии алкогольного опьянения за рулем, что негативно сказывается на
ситуации на дорогах. Именно поэтому водители, попавшие в ДТП в состоянии опьянения в Тульской области (1074 человека), были обследованы дополнительно на выявление факта регулярного употребления алкоголя. Для этого проводили определение уровня СДТ в крови методом капиллярного электрофореза.
Методика анализа с использованием автоматической капиллярной системе СарШа^ ^еЫа, Франция) и специфических реактивов не требует предварительной обработки образцов и позволяет осуществлять как качественную, так и количественную оценку фракций трансферрина. Система СарШа^ обеспечивает полную автоматизацию аналитического этапа, имеет 8 встроенных капилляров, функционирующих параллельно, что позволяет выполнять 8 анализов по определению уровня CDT одновременно, пропускная способность - 38 образцов в час [12]. Разделение изоформ трансферрина методом капиллярного электрофореза основано на разнице их электрического заряда, величина которого прямо пропорциональна количеству остатков сиаловой кислоты. Аналитический этап на системе СарШа^ полностью автоматизирован и включает в себя разведение образца и его инъекцию в анодную часть капилляра. Под действием высокого напряжения образец, мигрируя по всей длине капилляра, разделяется на фракции, каждая из которых, достигая катодной части капилляра, последовательно регистрируется путем измерения поглощения пептидных связей, определяемого при 200 нм. Детекция изоформ трансферрина осуществляется в следующем порядке: асиало-, дисиало-, трисиало-, тетрасиало- и пентасиалотрансферрин. Пики на электрофореграмме обрабатываются программным обеспечением прибора и отображаются на экране монитора в виде процентного содержания фракций (количественный анализ) и денситометрической кривой (качественный анализ).
Клинические испытания теста, проведенные в 2011-2013 г.г. в МНПЦ наркологии, показали, что верхнее референсное значение концентрации карбогидратдефицитного трансферина (CDT) составляет 1,3%. Пороговое значение, основанное на приведенном выше значении CDT с учетом погрешности измерений, составляет 1,6 %. Таким образом, в отсутствии интерферирующих факторов, значение CDT 1,6 % следует расценивать как показатель хронического алкогольного злоупотребления (положительный результат). Значение CDT < 1,6 % при отсутствии интерферирующих помех на профиле электрофореграмме следует расценивать как отрицательный результат. При получении значений в диапазоне 1,3% < CDT < 1,6% («серая зона») рекомендуется провести повторное исследование спустя 3-4 недели.
На рисунке А-В приведены примеры электрофореграмм с разными значениями показателя CDT, полученные в ходе исследования крови водителей.
А
4- sialol
40 SO ВО 100 120 140 160 180 200 220
В
Электрофореграммы образов крови при определении СОТ (система капиллярного электрофореза Capillarys2, Sebia). А) Значение CDT в пределах референтных значений (CDT 0,4): 5-asialo -11,3 %; 4-asialo - 85,3 %; 3-asialo - 3,0 %; 2-asialo= 0,4 %). Б) Патологическое значение CDT (CDT >2,0): 5-asialo -10,1 %; 4-asialo - 84,8 %; 3-asialo -3,1 %; 2-asialo= 2,0 %. В) Патологическое значение CDT (CDT >7,3): 5-asialo - 9,4 %; 4-asialo - 79,2 %; 3-asialo - 4,1 %; 2-asialo - 6,2 %;
0-asialo -1,1 %)
Уровень CDT оценивают в относительных единицах (% CDT), поскольку в крови разных людей абсолютные значения содержания трансфферинов значительно различаются в зависимости от индивидуальных особенностей и состояния организма, что наглядно проиллюстрировано на рисунке 1 (А-В). Абсолютные значения содержания всех форм трансферрина (в том числе, высококарбонилированных трансферринов) в крови человека, регулярно употребляющего спиртные напитки (значение дисиало- 2,0%) (рис. 1Б), выше, чем в крови у человека с нормальным уровнем CDT (рис. 1А). На электрофореграмме (рис. 1В) крови человека, злоупотребляющего алкоголем, увеличивается пик, соответствующий дисиало- производному, и идентифицируется асиалотрансферин. В этом случае уровень CDT определяется суммарным содержанием дисиало- и асиало- трасферринов (CDT 7,3%). Таким образом, метод капиллярного электрофореза является высокоспецифичным и чувствительным и однозначно позволяет выявлять людей, злоупотребляющих алкоголем.
В результате проведенных анализов по определению уровня CDT выявлено 730 человек (68%) с превышающим показателем (1,4 - 6,0%), что указывает на регулярное употребление этими людьми алкогольных напитков. Согласно данным МВД более 40% лиц, лишенных водительских прав по причине управления транспортным средством в состоянии алкогольного опьянения, совершают данное правонарушение повторно. Поэтому, лица, лишенные водительских прав по причине управления транспортным средством в состоянии алкогольного опьянения, обязаны не реже 1 раза в 3 месяца на протяжении всего срока лишения прав проходит анализ на CDT. На основе результатов исследований, выполненных в ГУЗ ТОНД №1 «Тульский областной наркологический диспансер» с января по декабрь 2019 года, из 730 человек состоящих на учете, у 612 человек (84%) через 3 месяца контроля показатель CDT приходит в норму, что свидетельствует об отказе от спиртных напитков и о скорейшем восстановлении в правах управления транспортным средством. Таким образом, важнейшей задачей этого тестирования является не только выявление раннего и скрытого злоупотребления алкоголем у водителей, но и эффективным средством профилактики повторных правонарушений и снижения аварийности и смертности на дорогах.
Заключение
Метод капиллярного электрофореза для определения уровня специфического маркера CDT является высокоспецифичным и чувствительным, однозначно позволяет выявлять людей, злоупотребляющих алкоголем. Учитывая неутешительную статистику по
количеству пьяных водителей на дорогах России, несмотря на высокую стоимость анализа по определению CDT, существует острая необходимость в обязательном тестировании водителей при получении прав по управлению транспортным средством. Кроме того, это исследование для освидетельствования водителей является эффективным средством профилактики повторных правонарушений и снижения аварийности и смертности на дорогах.
Список литературы
1. О внесении изменения в приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 15 июня 2015 г. № 344н "О проведении обязательного медицинского освидетельствования водителей транспортных средств (кандидатов в водители транспортных средств) [Электронный ресурс] : приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 20.11.2019 № 942н. Доступ из справ.-правовой системы «Консультант Плюс».
2. Arndt T. Carbohydrate-deficient transferrinasamarkerof chronic alcohol abuse: a critical review of preanalysis, analysis, and interpretation. // Clin Chem 2001. Vol.47. P.13-27.
3. Carbohydrate-deficient transferrin - a contemporary biomarker in comparison with traditional laboratory markers of chronic alcohol abuse. / Maksic N., Vodnik T., Stankovic M. [et al] // JMB. 2010. Vol. 29. P. 95-101.
4. Toward standardization of carbohydrate-deficient transferrin (CDT) measurements: III. Performance of native serum and serum spiked with disialotransferrin proves that harmonization of CDT assays is possible. / Jeppsson J-O., Siebelder C., Whitfield J.B. [et al] // Clin Chem Lab Med. 2013. Vol. 51. N 5. P. 991-996.
5. Helander A. Chromatographic measurement of transferring glycoforms for detecting alcohol abuse and congenital disorders of glycosylation. // Chromatographic methods in clinical chemistry and toxicology. 2007. P. 87-97.
6. Schellenberg F., Wielders J.P.M. Evaluation of capillary electrophoresis assay for CDT on SEBIA's Capillarys System: Intra and inter laboratory precision, reference interval and cut-off. // Clinica Chimica Acta. 2010. Vol. 411. P. 1888-1893.
7. Определение маркеров хронического злоупотребления алкоголем методом капилярного электрофореза / М.А. Мягкова, В.В. Пушкина, С.Н. Петроченко [и др.] // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2015. № 12-9. С. 1640-1643.
8. Современные лабораторные маркеры употребления алкоголя / О.И. Тарасова, П.П. Огурцов, Н.В. Мазурчик [и др.] // Клиническая фармакология и терапия. 2007. № 16(1). С.1-5.
9. The Role of Biomarkers in the Treatment of Alcohol Use Disorders. Substance abuse treatment advisory. News for the treatment fields. U.S. Department of Health and Human Services Administration. 2006. V. 5(4). 8 p.
10. Методика измерений массовой концентрации этанола в крови, моче и слюне. Москва. 2012. Аттестованная методика ФГУП «ВНИИМС» (свидетельство об аттестации № 01.00225/205-42-12 от 14.07.2012), зарегистрирована в Федеральном информационном фонде по обеспечению единстваизмерений под номером ФР1.39.2012.12815
11. Инструкция пользователя к системе капиллярного электрофореза модельного ряда Minicap, Sebia.
12. Comparative performance of biomarkers of alcohol consumtion in a population sample of working-aged men in Russia: the Izhevsk family study. McDonald H., Borinskaya S., Kiryanov N. [et al] // Addiction. 2013. P. 1-11.
Михайлова Анна Викторовна, магистрант, m ikhailow any ura@ yandex. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Желткова Лада Александровна, зав. лабораторией, tond1.tula@,gmail.com, ГУЗ "Тульский областной наркологический диспансер № 1".
Хапкина Анна Владиславовна, канд. биол. наук, доц., khapkina-av@ya.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Понаморева Ольга Николаевна, д-р хим. наук, зав. кафедрой, olgaponamoreva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
THE ROLE OF CDT ASSAY IN THE TRAFFIC SAFETY
A.V. Mikhailov, L.A. ZheltkovaA.V. Khapkina, O.N. Ponamoreva
Currently, the number of drivers who regularly drink alcohol is growing, which leads to an increase in road traffic accidents. In this connection, an analysis will be required to identify chronic alcoholism using a marker - carbhydrate-deficient transferrin (CDT) to obtain a driver's license and restore them after deprivation. This work substantiates the need to introduce CDT analysis into the practice of road medicine, based on the results of studies on the determination of ethanol and CDT in the biological fluids of drivers who have crashed in the Tula region.
Key words: alcoholism, biomarker, traffic accidents, carbhydrate-deficient transferrin, CDT
Mikhailova Anna Viktorovna, graduate student, mikhailowanyura@yandex. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Zheltkova Lada Aleksandrovna, head of laboratory, tond1.tula@,gmail.com, State Health Institution "Tula Regional Narcological Dispensary No. 1",
Hapkina Anna Vladislavovna, candidate of biological sciences, associate professor, khapkina-av@ya.ru, Tula, Tula State University,
Ponamoreva Olga Nikolaevna, doctor of chemical sciences, manager of kathedra, olgaponamoreva@mail.ru, Russia, Tula, Tula State University
