CC BY
51
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РОЛЬ БЕЛКА CRABP1В ФОРМИРОВАНИИ... 37
УДК 576.385.5:616-092.9-033.2:577.112 Я А. Каинов, И А. Фаворская, Е.Е. Антошина, Т.Г. Горькова, А.В. Комельков, ЕМ. Чевкина РОЛЬ БЕЛКА CRABP1 В ФОРМИРОВАНИИ ВЫСОКОМЕТАСТАЗНОГО ФЕНОТИПА RSV-ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ СИРИЙСКОГО ХОМЯКА
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация
Чевкина Елена Максимовна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза
адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)324-17-64; e-mail: [email protected]
Статья поступила: 16.01.2011, принята к печати 18.03.2011.
Резюме
Работа посвящена исследованию значения белка, связывающего ретиноевую кислоту (CRABP1) в регуляции метастатической активности трансформированных клеток in vivo. До настоящего времени в литературе отсутствовали экспериментальные данные об участии CRABP1 в регуляции процессов метастазирования и стимуляции опухолевой прогрессии. В данной работе на модельной системе впервые показана корреляция между экспрессией данного белка и уровнем спонтанной метастатической активности трансформированных клеток. Также впервые показано, что суперэкспрессия белка CRABP1 в низкометастазной клеточной линии приводит к увеличению, а подавление экспрессии в высокометастазной линии - к значительному снижению туморогенности и метастатической активности клеток.
Ключевые слова: опухолевая прогрессия, метастазирование, СМА, туморогенность, CRABP1, малые шпилечные РНК.
Ya.A. Kainov, I.A. Favorskaya, E.E. Antoshina, T.G. Gor'kova, A.V. Komelkov, E.M. Chevkina CRABP1 PARTICIPATES IN THE PROGRESSION OF SYRIAN HAMSTER RSV-TRANSFORMED FIBROBLASTS TO MORE AGGRESSIVE PHENOTYPE
N.N Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
In this study we have examined the role of CRABP1 (Cellular Retinoic Acid Binding Protein) in the regulation of transformed fibroblasts metastatic activity in vivo. Up to date there are no experimental evidence on CRABP1 participation in metastasis stimulation and tumor progression. In present study manufactured on the animal model system we first have shown the correlation between expression of CRABPI protein and the level of transformed cells metastatic activity. We have also shown that CRABP1 overexpression increased the tumorigenecity and metastatic activity while CRABP1 supression in high-metastatic cell line results in significant reduction of mentioned above cells properties.
Key words: Tumor progression, metastasis, SMA, tumorigenecity, CRABP1, shRNA.
Введение
Причиной большинства летальных исходов при злокачественных заболеваниях является не сама первичная опухоль, а формирование метастазов и генерализация опухолевого процесса. Несмотря на появление новых методов диагностики, многие опухоли часто обнаруживают уже в ходе процесса метастазирования. Очевидно, что предотвратить это клинически значимое явление невозможно без понимания базовых механизмов, определяющих процесс метастазирования на молекулярном и клеточном уровнях.
Процессы, приводящие к формированию метастатического фенотипа трансформированных клеток, очень разнообразны и одновременно взаимосвязаны. Они затрагивают самые разные аспекты клеточной жизнедеятельности. Несмотря на достижения последних лет, касающиеся роли отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, картина событий, происходящих в процессе малигнизации, достаточно противоречива и фрагментарна.
Идентификация и функциональный анализ ключевых белков и сигнальных каскадов, задействованных в регуляции опухолевой прогрессии и мета-
стазирования, безусловно, является одной из важнейших фундаментальных задач молекулярной биологии и экспериментальной онкологии.
Работа посвящена исследованию роли белка СКДБР1 в формировании метастатического фенотипа опухолевых клеток. СКДБР1 - белок с молекулярной массой 15,5 кДа, специфически связывающий ретиноевую кислоту. Хорошо известно, что ретиноевая кислота играет важную роль в процессах эмбриогенеза и способна стимулировать дифференцировку широкого спектра клеток различного гистогенеза. Несмотря на то, что СКДБР1 локализуется преимущественно в цитоплазме, он способен проникать в ядро, т. к. несет в своей структуре последовательность ядерной локализации [3], а также обнаруживается в митохондриях [11] и перинуклеарном пространстве [8]. Основной функцией данного белка является негативная регуляция внутриклеточной концентрации РК посредством усиления ее ферментативной деградации или же секвестрирования в цитоплазме.
СЫДВР1 экспрессируется в широком спектре нормальных тканей организма. Но при этом везде, за исключением сетчатки глаза, уровень его экспрессии достаточно низок.
38
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РОЛЬ БЕЛКА CRABP1В ФОРМИРОВАНИИ..
Несмотря на то, что изменение экспрессии CRABP1 характерно для гемобластозов и солидных опухолей разнообразного происхождения, его участие в процессах канцерогенеза крайне слабо охарактеризовано. Имеющиеся данные противоречивы и свидетельствуют о двойственной роли CRABP1. Некоторые из них позволяют судить о схожести его функций с близкородственным белком CRABP2, т.к. повышенная экспрессия CRABP1, как и CRABP2, в клеточных линиях и тканях экспериментальных животных приводит к усилению эффекта РК [4; 14]. Результаты других исследований свидетельствуют о негативной регуляции РК CRABP1, в частности - об активном усилении катаболизма РК и нивелировании ее эффекта в присутствии CRABP1 [1; 2]. Эта неоднозначная ситуация, а также обнаружение изменения экспрессии данного белка при различных онкозаболеваниях, делают исследования CRABP1 в контексте канцерогенеза чрезвычайно актуальными. Литературные данные о роли этого белка в процессе метастазирования на сегодняшний день отсутствуют. В данной работе впервые показано влияние экспрессии CRABP1 на усиление туморогенности и спонтанной метастатической активности трансформированных клеток in vivo.
Материалы и методы
Культивирование клеток
Трансфекция
В качестве экспериментальной модели для данного исследования использовались эмбриональные фибробласты сирийского хомяка (Mesocricetus auratus), трансформированные вирусом саркомы Рауса штамма Шмидт-Руппин D: HET-SR, HET-SR-1, HET-SR-8 и HET-SR-2SC (рис. 1А). Для получения ретро- и ленти-вирусных частиц использовались линии эпителиальных клеток GP293 (Clonetech, Япония) и 293FT (Invi-trogen, США) (производные линии HEK-293 - линии эмбриональных клеток почки человека). Все эукариотические линии культивировались в ^^инкубаторе (при 37 °C, в атмосфере 5 %-ного COJ. В качестве среды для культивирования использовалась DMEM с добавлением 0,294 мг/мл L-глутамина и 10 %-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (PAA Laboratories, Австрия), 0,1 мг/мл стрептомицина, 100 ЕД./мл пенициллина. Подсчет клеток производился с помощью камеры Горяева.
Для получения псевдоретровирусных частиц клетки GP293 наращивались до 70 %-ной конфлюент-ности. Для трансфекции брали 2 мкг ДНК - ретровирусный вектор pLXSN (Clontech, Япония) с целевым геном и плазмиду pVSV-G (Clontech, Япония), кодирующую белок оболочки вируса везикулярного стоматита, необходимый для сборки вируса и увеличения тропности вирусных частиц к клеткам хомяка. Плазмиды смешивались в эквимолярном соотношении. Трансфекцию проводили с использованием липофек-тамина 2000 (Lipofectamine 2000™ Reagent, Invitrogen, США) согласно протоколу производителя. Среду собирали через 24; 48 и 72 часа, центрифугировали 10 мин при 1500 g для удаления клеточного дебриса и использовали для инфекции. Для получения псевдо-лентивирусных частиц использовали клеточную линию 293FT. Для трансфекции брали 2 мкг плазмидной ДНК - лентивирусный вектор pLKO.1 puro (Addgene, США), несущий последовательность малой шпилечной РНК, pVSV-G и пакующую плазмиду pDeltaR8.2, кодирующую вирусные белки, в эквимолярном соотношении. В остальном процедура трансфекции не отличалась от таковой в случае GP-293.
Инфекция псевдовирусными частицами
Среду клеткам-мишеням заменяли на смесь вирусного супернатанта и обычной среды в соотношении 1:1 с добавлением полибрена (Sigma, США) до конечной концентрации 8 мкг/мл. Использовались 24, 48 и 72-часовые инокуляты вируса. Для контроля селекции рассевали неинфицированные клетки. В случае ретровирусной инфекции селекция проводилась на G418 (1200 мкг/мл, Sigma, США) в течение 8-9 дней. В случае лентивирусной инфекции отбор проводился с добавлением пуромицина (4,5 мкг/мл, Sigma, США) в течение 5 дней. Для дальнейших экспериментов использовали свежеразмороженные аликвоты полученных клеточных линий.
Выделение РНК, OT-ПЦР
Выделение РНК из клеточных линий проводилось с использованием реагента Trizol (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя. Для получения одноцепочечных кДНК в реакцию брали 2 мкг суммарной РНК, предварительно обработанной ДНКазой I, согласно протоколу производителя (1ед на 1 мкг РНК) (Fermentas, Канада). В качестве затравки использовали праймер random9. Обратную транскрипцию проводили с использованием ревертазы M-МLV (Promega, США).
В работе использовались следующие праймеры: СRABP1 F - 5’GCAGCGAGAATTTCGACGAG3’, CRABP1 R - 5 ’TCCGACCTTGAAGTTGATCT3 ’, RPLP0 F - 5’ GGGCGACCTGGAAGTCCAAC3’, RPLP0 R - 5’GTTCTTGCCCATCAGCACCAC3’.
Праймеры на рибосомальный белок RPLP0, являющийся геном «домашнего хозяйства», использовали для выравнивания кДНК. Поскольку геном сирийского хомяка не секвенирован, праймеры подбирали на консервативные последовательности исследуемых мРНК человека, крысы и мыши. Выравнивание мРНК и подбор праймеров осуществляли в программе VectorNTI (Invitrogen, США). Температура отжига коротких праймеров рассчитывалась по стандартной методике: +4 °С для G- и C- нуклеотидов, и 2 °С для А- и Т- нуклеотидов. Количество циклов, при котором происходила амплификация каждого из фрагментов, подбирали экспериментально.
Иммуноблоттинг
Клеточные лизаты получали из субконфлю-ентного монослоя клеток с использованием буфера RIPA, содержащего смесь ингибиторов протеаз (25х protease cocktail inhibitor, Roche, Швейцария). Полученные лизаты нормализовали по количеству белка, используя метод Бредфорд, на гель наносили 20 мкг белка.
Белки разделяли в 15% SDS-полиакриламидном геле, после чего переносили на PVDF мембрану (Milli-pore, США) методом мокрого переноса по стандартному протоколу (прибор Mini Trans-Blot, Bio-Rad Laboratories Inc., США). Мембрану инкубировали в
0,5%-ном р-ре молока (Bio-Rad Laboratories Inc., США) в течение 1 ч. Затем мембрану инкубировали в течение 10 ч с соответствующими первичными антителами при +4 °С, с последующей стандартной отмывкой. После чего мембрану 1-1,5 часа при комнатной температуре инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. После стандартной отмывки мембрану проявляли с помощью реагента для хемилюминесцентной реакции ECL (Milipore, США). Хемилюминесцентную реакцию регистрировали на приборе Kodak GelLogic 2200 Imaging system с последующей обработкой с помощью программы Kodak Molecular Imaging Software SE ver. 5.0.1.27.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РОЛЬ БЕЛКА CRABP1В ФОРМИРОВАНИИ... 39
Для идентификации белка CRABP1 использовались антитела anti-CRABP1 ab2816 (Abcam, Великобритания), в качестве контроля использовали антитела к в-актину ab8227 (Abcam, Великобритания).
Получение экспрессирующих векторов Кодирующая последовательность мРНК CRABP1 хомяка была клонирована в ретровирусный вектор pLXSN по сайтам XhoI и BamHI. Для этого использовали праймеры, подобранные на консенсусные последовательности, фланкирующие кодирующую область мРНК CRABP1 у мыши и крысы:
- CRABP1 cloning F
- 5’TATCTCGAGACCATGCCCAACTTC3’ и CRABP1 cloning R
- 5’TAAGGATCCGGCCACCTTTACTCC3’ (рестриктные сайты выделены курсивом, части, комплементарные мРНК, подчеркнуты). В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК из линии HET-SR-1, т.к. мРНК СRABP1 экспрессируется там на высоком уровне.
Амплификацию проводили в присутствии высокоточной полимеразы PFX (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя. Очистку продукта ПЦР и выделение рестриктных фрагментов из агарозного геля проводили с использованием QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу производителя. Для секвенирова-ния использовали праймер:
pLXSN F - 5’CTTTATCCAGCCCTCAC3’. Поскольку кодирующая последовательность мРНК CRABP1 сирийского хомяка была неизвестна, все манипуляции проводили в двух независимых повторах и осуществляли секвенирование каждого повтора. Полученнаякодирующая последовательность CRABP1 сирийского хомяка была зарегистрирована в базе данных GenBank под номером GQ 139546.1. Предшественники малых шпилечных РНК к кодирующей последовательности СRABP1 были клонированы в лентивирусный вектор pLKO.1 puro по сайтам AgeI и EcoRI. В данной работе использовались следующие последовательности shRNA:
shA 5’ TCTATATCAAGACATCCACCACTCGAGTGGTGGATGTCTTGATATAGATTTT^’, ShB 5’ CGGACGCAAGTGCAGGAGTTTCTCGAGAAACTCCTGCACTTGCGTCCGTTTTTG З’, shC 5’ CACAAGAATTTATGTCCGGGACTCGAGTCCCGGACATAAATTCTTGTGTTTTTG З’
(смысловая и антисмысловая последовательности подчеркнуты). Для клонирования каждого конструкта синтезировали олигонуклеотиды (Р и Ы для каждой конструкции), модифицированные липкими концами для соответствующих рестриктных сайтов. Полученные конструкции проверялись секве-нированием.
Анализ туморогенности
Суспензия клеток прививалась подкожно по 4 дозы каждому животному: 2x10', 2x10 , 2х103 и 2х104 клеток соответственно.
В эксперименте использовалось по 10 животных в группе, которой прививались клетки каждой линии.
Оценка прививаемости проводилась по прошествии 45 дней после инъекции клеток. Каждый эксперимент проводился в трех независимых повторах.
Анализ спонтанной
метастатической активности
Суспензия клеток в количестве 2х104 вводилась подкожно 10 экспериментальным животным. По прошествии 60 дней с момента инъекции животных усыпляли и проводили подсчет метастазов в легких (рис. 1Б).
Легкие фиксировали в спиртовом растворе формалина (10 %-ный формалин и 63 %-ный этанол), после чего получали парафиновые блоки, с которых готовили серийные ультратонкие срезы на стеклах. Срезы окрашивали гематоксилином-эозином. Количество метастатических узлов верифицировали гистологически. Каждый эксперимент проводился в трех независимых повторах.
Статистическая обработка результатов Все эксперименты выполнялись в трех независимых повторах.
Для определения значимых различий по СМА и туморогенности в случае сравнения двух выборок применялся двухсторонний критерий Манна-Уитни. Расчеты производились с помощью программы GraphPad Ртш ver. 5.02.
Результаты
Экспрессия эндогенного CRABP1 коррелирует с уровнем спонтанной метастатической активности RSV-трансформированных фибробластов хомяка.
Для исследований in vivo была использована ранее полученная экспериментальная модель, включающая панель стабильных клеточных линий единого происхождения - эмбриональных фибробластов сирийского хомяка, трансформированных вирусом саркомы Рауса (см. рис. 1А). Все эти линии характеризуются равно высоким уровнем туморогенности и метастазирования в легкие при внутривенном введении животным, но принципиально различным уровнем органоспецифического метастазирования в легкие в тесте на спонтанную метастатическую активность (СМА) при подкожном введении клеток (рис. 2 А). В тесте на СМА исследуемые клетки проходят все этапы процесса метастазирования от формирования подкожной опухоли до образования очагов вторичного роста в легких.
Таким образом, используемая модель позволяет исследовать спонтанную метастатическую активность клеток на иммунокомпетентных животных, что наиболее адекватно отражает процесс метастазирова-ния, происходящий в естественных условиях.
В данной работе использовались низкомета-стазная (Н/М) линия HET-SR, исходно высокомета-стазные (В/М) линии HET-SR-1 и HET-SR-8 и В/М линия HET-SR-2SC, полученная в ходе селекции клеток HET-SR in vivo (после 2 последовательных подкожных введений животным и последующего отбора из метастазов в лимфоузлы). Представленная панель линий получена в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН, ранее подробно охарактеризована и многократно использовалась в работах российских ученых и зарубежных коллег, посвященных исследованию процесса метаста-зирования [6; 7; 15]. Ранее при сравнении профилей экспрессии белков в высоко- и низкометастазных линиях методом двумерного гель-электрофореза было обнаружено отсутствие продукции CRABPl в Н/М линии HET-SR и высокий уровень данного белка в В/М линии HET-SR-1 (Э.Ш. Зуева, Institut Curie, Париж, Франция; персональное сообщение).
40 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РОЛЬ БЕЛКА СЯАБР1В ФОРМИРОВАНИИ...
Рис. 1. Схема получения исходных линий и теста на спонтанную метастатическую активность:
А: панель исходных клеточных линий К8У-трансформированных фибробластов сирийского хомяка с разным уровнем СМА;
Б: тест на спонтанную метастатическую активность.
Рис. 2. Экспрессия эндогенного СЫЛБР1 коррелирует с уровнем спонтанной метастатической активности:
А: уровень СМА клеточных линий; белый цвет - Н/М линия, серый цвет - В/М линия;
Б: сравнение продукции эндогенного белка СИЛБР1 в исходных линиях с различным уровнем СМА методом иммуноблоттинга.
Этот факт поставил вопрос о возможной роли СЫЛБР1 в формировании высокометастазного фенотипа клеток. Проведенное методом ОТ-ПЦР сравнение уровней мРНК СКЛЕРІ подтвердило, что данный ген экспрессируется на высоком уровне в В/М линии НЕТ-БЫ-1 и практически не экспрессируется в Н/М линии НЕТ-БЫ. Далее был проведен сравнительный анализ белковой продукции СЫЛБР1 в клетках с различным уровнем СМА, включая как исходно В/М линии (НЕТ-БЫ-1, НЕТ-БЫ-8), так и В/М производную линию НЕТ-БК-2БС. Как видно из рис. 2Б, все высокометастазные линии отличались значительно более высоким уровнем белка СЫЛБР1 по сравнению с Н/М линией НЕТ-БЫ. Таким образом, в рамках данной экспериментальной модели мы наблюдали прямую корреляцию между уровнем СМА и экспрессией белка СЫЛБР1. Экспрессия экзогенного СЫЛБР1 приводит к усилению тумо-рогенности и метастатической активности низкомета-стазной линии НЕТ-БЫ. Для определения роли СЫЛБР1 в формировании высокометастазного фенотипа клеток данный белок экспрессировали в Н/М линии НЕТ-БЫ. Для этого кодирующая последовательность гена СКЛЕРІ хомяка была клонирована в ретровирусный вектор рЬХБЫ. Линия НЕТ-БЫ, стабильно экспрессирующая СЫЛБР1, была получена методом ретровирусной инфекции. Проверка экспрессии экзогенного белка СЫЛБР1 проводилась методом имму-ноблоттинга. На рис. ЗА представлены результаты анализа экспрессии белка в полученной клеточной линии НЕТЖСКЛБР1 и в контрольной линии НЕТ-БЫ-рЬХБЫ, содержащей «пустой» вектор. Анализ туморо-генности полученной линии проводился с помощью трансплантационного теста на сингенных животных (сирийский хомяк, ЫвгоспсвШ аигаґид). Представле-ные на рис. ЗБ результаты трансплантационного теста показывают, что экспрессия СЫЛБР1 статистически значимо увеличивает туморогенность (уменьшает минимальную прививочную дозу) клеток НЕТ-БЫ (р<0,05). Исследование влияния экспрессии белка СЫЛБР1 на метастатическую активность клеток проводилось с помощью теста на СМА. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что экспрессия белка СЫЛБР1 статистически значимо увеличивает СМА клеток линии НЕТ-БЫ (рис. ЗВ). Таким образом, введение в низкометастазную клеточную линию экзогенного белка СЫЛБР1 вызывает статистически достоверное увеличение как туморогенности, так и метастатической активности клеток.
Подавление экспрессии экзогенного СЫЛБР1 снижает туморогенность и метастатическую активность высокометастазной линии клеток НЕТ-БЫ-1. Для дальнейшего подтверждения значения экспрессии белка СКЛБР1 в усилении и поддержании высокометастазно-го клеточного фенотипа было осуществлено подавление его экспрессии в высокометастазной линии. Для данного исследования была выбрана линия НЕТ-БЫ-1, отличающаяся наиболее высоким уровнем СМА и наиболее высокой экспрессией белка СЫЛБР1 (см. рис. 1А-В). Подавление экспрессии эндогенного СЫЛБР1 проводили с помощью экспрессии малых интерферирующих РНК. Для этого были подобраны три последовательности, кодирующие малые шпилечные РНК (зЬКЫЛ) к мРНК СКЛЕРІ сирийского хомяка. Последовательности были клонированы в лентивирусный вектор рЬКО.1 и введены в клетки с помощью лентивирусной инфекции. В качестве контроля использовали последовательность, кодирующую зЬКЫЛ к мРНК зеленого флуоресцентного белка СЕР. В полученных после отбора стабильных клеточных линиях НЕТ-БК-1-зИЛ, НЕТ-БК-1-зИБ, НЕТ-БК-1-зИС и НЕТ-БК-1-зЮЕР был проведен анализ экспрессии эндогенного СЫЛБР1 методом иммуноблот-
тинга. Как видно на рис. 4А, во всех 3 линиях, где были экспрессированы шпилечные РНК к мРНК CRABP1, уровень продукции соответствующего белка был снижен по сравнению с контрольной линией. При этом шпилечная структура shB наиболее эффективно подавляла экспрессию белка CRABP1. Поэтому далее для экспериментов in vivo была выбрана линия HET-SR-1-shB (далее HET-SR-1-shCRABP1). Результаты трансплантационного теста показали достоверное (р<0,05) снижение туморогенности клеток линии HET-SR-1-shCRABP1 по сравнению с контрольной линией (рис. 4Б). Анализ метастатической активности in vivo проводили с помощью теста на СМА. Как видно из рис. 4В, уровень СМА линии HET-SR-1-shCRABP1 значительно снизился по сравнению с контрольной линией HET-SR-1-shGFP (р<0,05). Таким образом, подавление продукции эндогенного белка CRABP1 в высокометастазной линии HET-SR-1 приводит как к снижению тумороген-ности, так и к подавлению спонтанной метастатической активности. Дальнейшее исследование in vitro полученных клеточных линий с подавленным или гиперэкспрессией CRABP1 не выявило значимых различий в характеристиках, ассоциированных с опухолевой прогрессией. В частности, полученные линии не отличались от контролей по основным клеточным характеристикам, таким как скорость пролиферации, уровень миграции в тесте на «зарастание раны» in vitro, клоногенность и др. (данные не приводятся). Таким образом, вопрос о конкретных механизмах воздействия CRABP1 на метастатический фенотип клеток остается открытым. Основываясь на литературных данных, мы предполагаем, что экспрессия CRABP1 может приводить к уменьшению биодоступности РК за счет стимуляции ее метаболизма и/или секвестрирования в цитоплазме. Это может приводить к снижению клеточной дифференцировки, что является признаком агрессивности клеточных линий в экспериментальных моделях и одним из основных показателей опухолевой прогрессии и неблагоприятного прогноза в клинической практике. Низкий уровень клеточной дифференцировки, наряду с повышенной тумо-рогенностью и способностью к метастазированию, является одной из основных характеристик опухолевых стволовых клеток [9; 12; 18]. Также известно, что РК способна стимулировать дифференцировку нормальных стволовых клеток различного происхождения [5; 10; 16]. Показано, что РК стимулирует дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток человека [17] и экспериментальных животных [13]. Можно предположить, что в нашей системе гиперэкспрессия CRABP1 приводит к обогащению клеточной культуры опухолевыми стволовыми клетками, однако эта гипотеза требует дальнейшего экспериментального подтверждения.
Выводы
Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о важной роли CRABP1 в опухолевой прогрессии и формировании метастатического фенотипа клеток. В исследуемой модельной системе экспрессия данного белка коррелирует с уровнем спонтанной метастатической активности. Введение в низ-кометастазную линию экзогенного белка приводит к значительному повышению как туморогенности, так и метастатической активности клеток. И наоборот, подавление эндогенного CRABP1 в высокометастаз-ной линии ведет к снижению метастатической активности и туморогенности клеток. Дальнейшее исследование этого явления, а также идентификация молекулярных механизмов CRABP1-зависимой стимуляции прогрессии солидных опухолей открывают новые перспективы для генонаправленной терапии ЗНО.
42 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ РОЛЬ БЕЛКА СЯАБР1В ФОРМИРОВАНИИ...
Рис. 3. Экспрессия экзогенного CRABP1 приводит к усилению туморогенности и метастатической активности низкометастазной линии HET-SR:
А: проверка экспрессии экзогенного белка CRABP1 методом иммуноблоттинга в клетках НЕТ-8И; в качестве положительного контроля приведена линия HET-SR-1;
Б: сравнение туморогенности клеток HET-SR, экспрессирующих экзогенный CRABP1, с контрольной линией; столбики отражают количество животных в каждой группе: нет опухолей - ни одна доза не привилась; 1 - с одной привившейся дозой 2Ч104 клеток; 2 - с двумя привившимися дозами 2х104 и 2х103 клеток; 3 - с тремя привившимися дозами 2х104, 2х103 и 2х102 клеток;
В: сравнение уровня СМА клеток HET-SR, экспрессирующих экзогенный CRABP, с контрольной линией. В качестве иллюстрации приведены характерные образцы гистологических срезов легких, окрашенных гематоксилин-эозином, с наличием и отсутствием метастазов.
Рис. 4. Подавление экспрессии экзогенного CRABP1 снижает туморогенность и метастатическую активность высокометастазной линии клеток HET-SR-1:
А: проверка подавления экспрессии эндогенного белка CRABP1 методом иммуноблоттинга в клетках производных линии HET-SR-1, экспрессирующих малые шпилечные РНК к последовательности CRABP1;
Б: сравнение туморогенности клеток HET-SR-1, экспрессирующих малые шпилечные РНК к последовательности CRABP1, с контрольной линией; столбики отражают количество животных в каждой группе: нет опухолей - ни одна доза не привилась; 1 - с одной привившейся дозой 2х104 клеток; 2 - с двумя привившимися дозами 2х104 и 2х103 клеток; 3 - с тремя привившимися дозами 2х104, 2х103 и 2х102 клеток;
В: сравнение уровня СМА клеток HET-SR-1, экспрессирующих малые шпилечные РНК, к последовательности мРНК CRABP1 (справа), с контрольной линией (слева).
44
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РОЛЬ БЕЛКА CRABP1В ФОРМИРОВАНИИ..
Литература
1. Boylan JF, Gudas LJ. Overexpression of the cellular retinoic acid binding protein-I (CRABP-I) results in a
reduction in differentiation-specific gene expression in F9 teratocarcinoma cells. // J Cell Biol. - 1991. -Vol. 112. - P. 965-79.
2. Boylan JF, Gudas LJ. The level of CRABP-I expression influences the amounts and types of all-trans-retinoic
acid metabolites in F9 teratocarcinoma stem cells. // J Biol Chem. - 1992. - Vol. 267. - P. 21486-91.
3. Budhu A, Gillilan R Noy N. Localization of the RAR interaction domain of cellular retinoic acid binding
protein-II. // J Mol Biol. - 2001. - Vol. 305. - P. 939-49.
4. Chen AC, Yu K, Lane MA, Gudas LJ. Homozygous deletion of the CRABPI gene in AB1 embryonic stem cells results in increased CRABPII gene expression and decreased intracellular retinoic acid concentration. // Arch Biochem Biophys. - 2003. - Vol. 411. - P. 159-73.
5. Christie VB, Maltman DJ, Henderson AP, Whiting A, Marder TB, Lako M, et al. Retinoid supplementation
of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in
vitro. // J Neurosci Methods. - 2010. - Vol. 193. - P. 239-45.
6. Deichman GI, Kluchareva TE, Matveeva VA, Kushlinsky NE, Bassalyk LS, Vendrov EL. Clustering of discrete cell properties essential for tumorigenicity and metastasis. I. Studies of Syrian hamster embryo fibroblasts spontaneously transformed in vitro. // Int J Cancer. - 1989. - Vol. 44. - P. 904-7.
7. Deichman Gl, Kashleva HA, Kluchareva TE Matveeva VA. Clustering of discrete cell properties essential for tumorigenicity and metastasis. II. Studies of Syrian hamster embryo fibroblasts transformed by Rous sarcoma virus. // Int J Cancer. - 1989. - Vol. 44. - P. 908-10.
8. Levadoux-Martin M, Li Y, Blackburn A, Chabanon H, Hesketh JE. Perinuclear localisation of cellular retinoic acid binding protein I mRNA. // Biochem Biophys Res Commun. - 2006. - Vol. 340. - P. 326-31.
9. Liu H, Patel MR, Prescher JA, Patsialou A, Qian D, Lin J, et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. // Proc Natl Acad Sci U S A. -2010. - Vol. 107. - P. 18115-20.
10. Niu CS, Li MW, Ni YF, Chen JM, Mei JM, Li J, et al. Effect of all-trans retinoic acid on the proliferation and differentiation of brain tumor stem cells. // J Exp Clin Cancer Res. - 2010. - Vol. 29. - P. 113.
11. Ruff SJ, Ong DE. Cellular retinoic acid binding protein is associated with mitochondria. // FEBS Lett. -2000. - Vol. 487. - P. 282-6.
12. Shi MF, Jiao J, Lu WG, Ye F, Ma D, Dong QG, et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. // Cell Mol Life Sci. - 2010. - Vol. 67. - P. 3915-25.
13. Su ZY, Li Y, Zhao XL, ZhangM. All-trans retinoic acid promotes smooth muscle cell differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. // J Zhejiang Univ Sci B. - 2010. - Vol. 11. - P. 489-96.
14. Tang XH, Vivero M, Gudas LJ. Overexpression of CRABPI in suprabasal keratinocytes enhances the proliferation of epidermal basal keratinocytes in mouse skin topically treated with all-trans retinoic acid. // Exp Cell Res. - 2008. - Vol. 314. - P. 38-51.
15. Tchevkina E, Agapova L, Dyakova N, Martinjuk A, Komelkov A, Tatosyan A. The small G-protein RalA stimulates metastasis of transformed cells. // Oncogene. - 2005. - Vol. 24. - P. 329-35.
16. Yu C, Liu Y, Miao Z, Yin M, Lu W, Lv Y, et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. // Blood. - 2010. - Vol. 116. - P. 4786-94.
17. Zhang W, Deng ZL, Chen L, Zuo GW, Luo Q, Shi Q, et al. Retinoic acids potentiate BMP9-induced osteogenic differentiation of mesenchymal progenitor cells. // PLoS One. - 2010. - Vol. 5. - P. e11917.
18. Zhou S, Li F, Xiao J, Xiong W, Fang Z, Chen W, et al. Isolation and identification of cancer stem cells from human osteosarcom by serum-free three-dimensional culture combined with anticancer drugs. // J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. - 2010. - Vol. 30. - P. 81-4.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ, Н И. БЛОХИНА РАМН
