CC BY
20
CHEMOMETRIC ANALYSIS AT NEAR-INFRARED SPECTROPHOTOMETRY IDENTIFICATION OF PHARMACEUTICAL SUBSTANCES AND PREPARATIONS
T.E. Elizarova
Control-analytic Laboratory Pharmanalyse
Chermianskaya str., 2, Moscow, Russia, 127282
T.V. Pleteneva
The Department of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry Medical Faculty Peoples' FriendshipUniversity of Russia
M-Maklaya str., 8, Moscow, Russia, 117198
The NIR method is based on the combination of spectrometer and statistical methods of multifac-tor dependencies analysis. The potential of this method for the identification of drugs without violation of the packing opens good prospects of introducing it into the drug quality control system. Key words: Near-infrared spectrophotometry (NIR), identification of drugs.
РОЛЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ
В ПАТОГЕНЕЗЕ ЖЕНСКОГО БЕСПЛОДИЯ НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКИХ ГИНЕКОЛОГИЧЕСКИХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Г.Г. Энукидзе
Институт общей и клинической патологии КДО РАЕН ул. Н. Масловка, 19, Москва, Россия, 125124
Впервые изучена динамика изменения интегральных показателей концентрации бактериальных липополисахаридов и активности антиэндотоксинового иммунитета в сыворотке крови у 66 пациенток с женским бесплодием (первичное — 20, вторичное — 28 и привычное невынашивание — 18) репродуктивного возраста (от 20 до 45 лет) на фоне хронических воспалительных гинекологических заболеваний. В результате проведенного исследования было обнаружено участие хронической эндотоксиновой агрессии (кишечного происхождения) в патогенезе изучаемой патологии. Использование скрининговых эндотоксин-тест-систем дает возможность разработать «антиэндо-токсиновую составляющую» в комплексной терапии больных, что позволит значительно повысить эффективность лечения женского бесплодия хронического воспаления и может свидетельствовать о важной роли бактериальных липополисахаридов в патогенезе изучаемой патологии.
Последние десятилетия характеризуются устойчивой тенденцией роста числа хронических воспалительных гинекологических заболеваний (ХВГЗ) и обусловленных ими женским бесплодием, которым страдают до 25% женщин детородного возраста [1, 2, 3]. Причиной развития вышеперечисленной патологии, в том числе ХВГЗ, гестозов, эклампсии, внутриутробной гибели плода и, возможно, неразвивающейся беременности может быть эндотоксиновая агрессия (ЭА) [6, 9]. Доказано участие кишечного эндотоксина (ЭТ), представляющего из себя липополи-сахарид (ЛПС) грамотрицательных бактерий, в патогенезе гестозов и эклампсии [4, 6, 7, 8]. Кроме того, установлена прямая зависимость между концентрацией кишечного ЛПС в общем кровотоке новорожденных детей и недостаточностью антиэндотоксинового иммунитета (АЭИ), с одной стороны, и развитием ранних реакций адаптации, антифосфолипидного синдрома и септических состояний у новорожденных детей — с другой [4, 8].
Цель работы — определить возможную роль бактериальных липополисахаридов в патогенезе бесплодия на фоне ХВГЗ.
Материалы и методы исследования. Для определения концентрации ЛПС ^^мл) в системном кровотоке использован Микро-ЛАЛ-тест (в адаптированной к клиническим условиям модификации), который основан на способности гемолимфы рачка Limulus polyphemus коагулировать при контакте с ЛПС любого происхождения.
Оценка антиэндотоксинового иммунитета (АЭИ) состояла из определения гранулоцитарного звена — ЛПС-тест-ИФА — выявления в мазках крови ЭТ акцептированного ПЯЛ при помощи антител (АТ) к наиболее общей антигенной детерминанте ЛПС-ГЛП (норма от 3 до 8%).
Гуморальное звено антиэндотоксинового иммунитета определяли по титрам (АТ) к ГЛП — «СОИС-ИФА» (в условных единицах оптической плотности). Титры АТ к ГЛП колеблются в интервале от 190 до 210 [5].
Основой данной работы являются результаты исследования 112 гинекологических больных с женским бесплодием неспецифического воспалительного генеза. Среди наблюдаемых пациенток было 20 с первичным бесплодием, 28 с вторичным бесплодием, 18 с привычным невынашиванием и 46 с хроническими воспалительными гинекологическими заболеваниями, но с сохраненной репродуктивной функцией, поэтому эту группу назвали «фертильный контроль». Кроме того, было обследовано 30 практически здоровых женщин репродуктивного возраста без акушерско-гинекологических заболеваний (средний возраст — 28,3 ± 1,7 лет), их показатели были приняты за физиологическую норму. Среди исследуемых групп значимые различия в возрасте отсутствовали. Возрастной состав больных с женским бесплодием составлял от 19 до 40 лет (средний возраст пациенток — 28,4 ± 1,1 лет).
Результаты и их обсуждение. В результате проведенного (при помощи Мик-ро-ЛАЛ-теста) исследования были получены следующие результаты (табл. 1).
Таблица 1
Концентрация ЛПС в общем кровотоке у женщин с бесплодием и в фертильной группе
Исследуемые группы Концентрация эндотоксина, EU/мл
первичное бесплодие, п = 20 вторичное бесплодие, п = 28 привычное невынашивание, п = 18 фертильный контроль, п = 46
Беременные 3,14 ± 0,31* 2,69 ± 0,40 1,29 ± 0,12* 3,99 ± 0,25*
Небеременные 6,6 ± 0,80 3,2 ± 0,3 2,5 ± 0,20
Средние концентрации 3,66 ± 0,39 2,79 ± 0,33 1,56 ± 0,16
Нормативные показатели концентрации эндотоксина: 0,19 ± 0,03** EU/мл
Примечание: * значимые показатели по сравнению с показателями нормы (р < 0,001); ** значимые показатели по сравнению с показателями нормы (р < 0,001).
У пациенток с первичным бесплодием средние концентрации ЛПС в 19,2 раза превышали показатели группы условно здоровых волонтеров. У 8 (40%) женщин концентрация ЛПС составила от 2,0 до 2,5 EU/мл, у 6 (30%) — 3,0 EU/мл, у 3 (15%) от 5,0 до 5,6 EU/мл, у 3 (15%) — от 5,0 до 8,2 EU/мл. В этой группе нами были выделены 17 пациенток, у которых после проведения антиэндотоксино-вой составляющей реабилитации наступила долгожданная беременность и у 3 — не наступила беременность. У небеременных пациенток концентрация ЛПС была в 2 раза значимо выше, чем у беременных женщин.
Среди пациенток с вторичным бесплодием концентрация ЛПС в общем кровотоке соответствовала показателям физиологической нормы у 2 (7,1%), у 11 (39,2%) женщин — от 1,25 до 1,5 EU/мл, у 5 (17,9%) — от 2,0 до 2,5 EU/мл, у 3 (10,7%) от 3,0 до 3,5 EU/мл, у 5 (17,9%) от 4,0 до 5,5 EU/мл и у 2 (7,1%) — от 6,0 до 6,4 EU/мл. Средние показатели концентрации ЛПС у больных с вторичным бесплодием в 15,5 раза превышают показатели физиологической нормы. Среди 28 пациенток с вторичным бесплодием после проведения реабилитации у 23 (82,1%) наступила беременность, а у 5 (17,9%) не наступила. Концентрации ЛПС у небеременных женщин была повышена на 20% выше, чем у беременных.
Среди пациенток с привычным невынашиванием концентрация ЛПС в общем кровотоке соответствовала показателям физиологической нормы у 4 (22,2%), у 8 (44,4%) женщин — от 1,25 до 1,5 EU/мл, у 5 (27,8%) — от 1,75 до 2,5 EU/мл, у 1 (5,6%) — 3,0 EU/мл. Средние показатели концентрации ЛПС у больных с привычным невынашиванием в 8,2 раза превышают показатели физиологической нормы. Среди 18 пациенток с привычным невынашиванием после проведения реабилитации у 14 (77,8%) наступила беременность, а у 4 (22,2%) не наступила. Средние концентрации ЛПС у небеременных были в 2 раза выше у женщин с наступившей беременностью.
Среди 46 пациенток фертильной группы ни у одной не было выявлено показателей концентрации ЛПС, которые соответствовали показателям нормы. У 1 пациентки концентрация ЛПС была 1,25 EU/мл, у 9 (19,6%) женщин — 2,0
до 2,5 EU/мл, у 13 (28,3%) — 2,6—3,2 EU/мл, у 8 (17,4%) — 3,6—4,5 EU/мл и у 15 (32,5%) — 5,0—8,2 EU/мл. Средние показатели концентрации ЛПС у пациенток группы фертильного контроля в 21 раз превышали показатели физиологической нормы.
Результаты исследования интегральных показателей гуморального звена АЭИ у больных женским бесплодием и фертильного контроля на фоне ХВГЗ представлены в табл. 2.
Таблица 2
Титры антиэндотоксиновых антител у больных женским бесплодием и в фертильной группе на фоне ХВГЗ
Исследуемые группы Титры антиэндотоксиновых антител, у.е.О.П.
первичное бесплодие, п = 20 вторичное бесплодие, п = 28 привычное невынашивание, п = 18 фертильный контроль, п = 46
Беременные 128,35 ± 4,58 128,85 ± 4,75 164,7 ± 8,97* 124,51 ± 1,33
Небеременные 130 ± 2,88 148 ± 5,14 120,0 ± 2,77
Средине концентрации 128,6 ± 3,9 132,5 ± 4,20 154,7 ± 9,29
Нормативные титры антиэндотоксиновых антител, у.е.О.П.: 198,87 ± 0,60**
Примечание: * значимые показатели по сравнению с группами бесплодия и фертильного контроля (р < 0,001); ** значимые показатели по сравнению с показателями нормы (р < 0,001).
В группе первичного бесплодия отмечено снижение антигликолипидных АТ на 36% по сравнению с показателями пациенток группы сравнения и свидетельствует об отсутствии реакции иммунной системы на избыток ЛПС, что может быть следствием либо истощения иммунитета, либо развития эндотоксиновой толерантности, что особенно значимо выражено у 3 небеременных женщин.
Титры антиэндотоксиновых АТ у женщин с вторичным бесплодием с наступившей беременностью были на 15% ниже, чем у небеременных. Полученные результаты свидетельствуют о сниженной способности реакции иммунной системы на избыток ЛПС у беременных, что может быть следствием истощения иммунитета. У небеременных женщин на фоне высоких концентраций ЛПС титры анти-гликолипидных антител были выше, но недостаточными для купирования патогенных свойств ЛПС, что указывает на развитие эндотоксиновой толерантности.
Титры антигликолипидных АТ у женщин с привычным невынашиванием с наступившей беременностью были на 27% выше, чем у небеременных. У небеременных пациенток концентрация ЛПС была значимо выше, чем у беременных женщин из этой группы. Титры антигликолипидных антител были снижены у небеременных на 40%, у беременных на 18% по сравнению с показателями контрольной группы. Это свидетельствует о сохраненной способности реакции иммунной системы на избыток ЛПС у беременных. У небеременных женщин на фоне высоких концентраций ЛПС титры антигликолипидных антител были ниже, этого недостаточно для купирования патогенных свойств ЛПС, что указывает на развитие истощения АЭИ в виде эндотоксиновой толерантности.
Средние показатели титров антигликолипидных антител у женщин фертиль-ной группы характеризовались значимо низкими по сравнению с показателями контрольной группы (на 38%). Эти данные свидетельствуют о сохраненной способности реакции иммунной системы на избыток ЛПС у пациенток из группы фертильного контроля.
В табл. 3 приведены результаты исследования гранулоцитарного звена АЭИ, которые свидетельствуют об угнетении и этого звена АЭИ.
Таблица 3
Показатели гранулоцитарного звена антиэндотоксинового иммунитета у женщин с бесплодием и фертильного контроля на фоне ХВГЗ
Исследуемые группы Содержание ЛПС-позитивных гранулоцитов, % Резервы связывания ЭТ гранулоцитами, %
т vivo т vivo + т vitro
Первичное бесплодие, п = 20: беременные, п = 17 небеременные, п = 3 1,55 ± 0,35* 1,47 ± 0,41 2,0 ± 0,5 1,17 ± 0,22* 1,14 ± 0,26 1,33 ± 0,16 0,4 ± 0,16* 0,38 ± 0,19 0,66 ± 0,34
Вторичное бесплодие, п = 28: беременные, п = 23 небеременные, п = 5 1,58 ± 0,7* 1,54 ± 0,06 1,8 ± 0,12 1,58 ± 0,05* 1,58 ± 0,06 1,6 ± 0,1 0,14 ± 0,04* 0,13 ± 0,05 0,2 ± 0,09
Привычное невынашивание, п = 18: беременные, п = 14 небеременные, п = 4 6,47 ± 0,77 7,75 ± 0,65 2 ± 0,4 3,69 ± 0,41 4,25 ± 0,42 1,75 ± 0,25 2,38 ± 0,37 3 ± 0,44 0,25 ± 0,21
Фертильный контроль, п = 46 1,63 ± 0,07 1,88 ± 0,12 0,23 ± 0,07
Условно здоровые волонтеры, п = 30 3,5 ± 0,4 8,6 ± 0,5 5,1 ± 0,3
Примечание: * значимые различия показателей между исследуемыми группами (р < 0,05); ** значимые различия показателей между исследуемыми группами и условно здоровыми волонтерами (р < 0,05).
Изучение показателей гранулоцитарного звена АЭИ у пациенток с первичным бесплодием до реабилитации показало, что гранулоциты до нагрузки Re-ГЛП были снижены в 6,8; гранулоциты после нагрузки Re-ГЛП — в 3,9 и резервы связывания — в 6,3 раз, по сравнению с показателями нормы, что указывает на зта-чительное угнетение этого звена иммунитета к ЛПС.
У женщин с вторичным бесплодием отмечаются выраженные признаки ослабления гранулоцитарного звена АЭИ: до нагрузки содержание гранулоцитов, способных связывать Re-ГЛП, было значимо снижено в 5, а после нагрузки — в 3,8 и резервы связывания — в 17,9 раз по сравнению с показателями нормы, что указывает на резкое угнетение этого звена иммунитета к ЛПС.
У пациенток с наступившей беременностью с привычным невынашиванием отмечено значимое на 30% снижение способности гранулоцитов связывать ЛПС после нагрузки Re-ГЛП.
Остальные показатели состояния гранулоцитарного звена соответствовали (гранулоциты до нагрузки Re-ГЛП и резервы связывания ЛПС) показателям группы сравнения, что указывает на незначительное ослабление этого звена АЭИ. При изучении показателей гранулоцитарного звена АЭИ у пациенток с не наступившей беременностью с привычным невынашиванием до реабилитации было установлено, что гранулоциты до нагрузки Re-ГЛП были значимо снижены —
в 3,8, гранулоциты после нагрузки Re-ГЛП — в 2,5 и резервы связывания в 12 раз, что указывает на значительное угнетение этого звена иммунитета к ЛПС.
У пациенток фертильного контроля отмечено значимое в 4,9 раз снижение гранулоцитов in vivo, в 3,2 in vitro+ in vivo и в 10,9 раз уменьшены резервы связывания гранулоцитов ЛПС по сравнению с показателями группы контроля, что указывает на значительное ослабление этого звена АЭИ.
В результате проведенных исследований выявлено, что у больных бесплодием и фертильного контроля на фоне ХВГЗ имеет место эндотоксиновая агрессия (характеризуется избыточной концентрацией бактериальных липополисахаридов грамотрицательной кишечной микрофлоры в общей гемоциркуляции и недостаточностью антиэндотоксинового иммунитета), которая, как правило, носит хронический характер, более выражена у пациенток с первичным и вторичным бесплодием и может быть непосредственной причиной развития изучаемой патологии. Последнее указывает патогенетический путь улучшения качества лечебного процесса бесплодия на фоне ХВГЗ и мотивирует разработку «антиэндотоксино-вого» направления терапии.
Таким образом, хроническая ЭА является важным звеном патогенеза женского бесплодия (как первичного, вторичного, так и привычного невынашивания) на фоне ХГВЗ.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Бухарин О.В., Константинова О.Д., Черкасов С.В., Кремлева E.A. Факторы персистен-ции микрофлоры при воспалительных заболеваниях внутренних женских половых органов // Вестник Российской Ассоциации Акушеров-Гинекологов. — 1998. — № 3. — С. 45—51.
[2] Кисена В.И., Буянова С.Н., Канисеева В.Ю. Клинико-микробиологические и морфологические особенности нижних и верхних отделов половой системы у женщин с хроническими заболеваниями органов малого таза // Рос. вестник акушерства и гинекологии. — 2002. — № 5. — С. 7—12.
[3] Краснопольский В.И., Буянова С.Н., Щукина H.A. Гнойная гинекология (практическое руководство). — М.: Медпресс, 2001. — 282 с.
[4] Лазарева С.И., Aниxовская ИЛ., Марачев A.A. и др. Кишечный липополисахарид в патогенезе антифосфолипидного синдрома у матерей и их новорожденных детей // Бюлл. ВНЦ РАМН. — 2005. — № 1. — С. 22—23.
[5] Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю., Aполлонин A.B. и др. Способ оценки состояния антиэндо-токсинового иммунитета в отношении грамотрицательных бактерий («ЛПС-тест-ИФА»). Патент РФ № 2088936.
[6] Серов В.Н., Бондаренко Е.В., Яковлев М.Ю. и др. Иммуноморфологическая диагностика эндотоксинемии в акушерско-гинекологической практике // Сб. трудов НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР. — 1987. — С. 128—131.
[7] Яковлев М.Ю. Эндотоксиновый шок // Казанский медицинский журнал. — 1987. — № 3. — С. 207—211.
[8] Яковлев М.Ю. Системная эндотоксинемия в физиологии и патологии человека // Авто-реф. дисс. ... д-ра мед. наук. — М., 1993. — 55 с.
[9] Endotoxin in Health and Diseas // Eds.: Brade H., Opal S.M., Vogel S.N., Morrison D.C. New York-Basel, 1999. — 950 p.
THE ROLE OF BACTERIAL LIPOPOLISACCHARIDES IN THE PATHOGENESIS OF FEMALE INFERTILITY CONNECTED WITH CHRONIC GYNECOLOGICAL INFLAMMATORY DISEASES
G.G. Enukidze
Institute of General and Clinical pathology CDO RAEN
N. Maslovka, 19, Moscow, Russia, 125124
For the first time the dynamics of changes of integral indexes of concentration of bacterial lipopo-lisaccharides and activity of antiendotoxin immunity in the blood serum was studied among 66 female infertility patients (primary — 20, secondary — 28, usual infertility — 18) of reproductive age (from 20 to 45 years old) connected with chronic gynecological inflammatory diseases. As a result of the exploring the involving of endotoxin chronic aggression (of intestinal genesis) in the pathogenesis of the pathology under study was revealed. Using of screening endotoxin test-systems allows developing of «antiendotoxin component» in complex therapy of patients, it will allow increasing considerably the efficiency of treatment of female infertility connected with chronic inflammatory diseases and it can give evidence about the important role of bacterial lipopolisaccharides in the pathogenesis of the pathology under study.
Key words: antiendotoxin immunity, female infertility, endotoxin chronic aggression by endotox-ins, bacterial lipopolysaccharides, infertile primarily, secondarily.
АНТИЭНДОТОКСИНОВАЯ СОСТАВЛЯЮЩАЯ ПРОГРАММЫ РЕАБИЛИТАЦИИ ЖЕНСКОГО БЕСПЛОДИЯ НА ФОНЕ ЭНДОТОКСИНОВОЙ АГРЕССИИ
Г.Г. Энукидзе
Институт общей и клинической патологии КДО РАЕН ул. Н. Масловка, 19, Москва, Россия, 125124
В работе представлена авторская тест-система серологической диагностики этиологии эндо-токсиновой агрессии и повышенной проницаемости кишечной стенки (недостаточность кишечной стенки) у 112 гинекологических больных с различными формами женского бесплодия (первичного, вторичного бесплодия и привычного невынашивания), основанная на определении (в ИФА) концентрации (в мкг/мл) антител к пяти грамотрицательным бактериям (бактероидам, кишечной и синегнойной палочкам, клебсиелле и протею). На основании полученных данных разработана программа реабилитации женского бесплодия с эффективностью в 80% случаев.
В настоящее время в России бесплодие наблюдается более чем у 15% супружеских пар детородного возраста, что, по данным ВОЗ, является критическим уровнем, которое наблюдается у 4—5 млн женщин. В США бесплодие встреча-
