CC BY-ND
18
ноябрь №11 (204) ЗНиСО
19
УДК 616.98:579.881.11-036.2:57.083.1(571.13)
РЕЗУЛЬТАТЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В СОЧЕТАННОМ ОЧАГЕ КЛЕЩЕВЫХ РИККЕТСИОЗОВ В ОМСКОЙ ОБЛАСТИ
И.Е. Самойленко1, Т.А. Решетникова1, Я.П. Иголкина3, Н.А. Околелова1, А.Н. Коломеец1, Е.В. Шаламова4, А.К. Танцев1, С.В. Штрек1,2, Н.В. Рудаков1,2
1ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, г. Омск, Россия
2ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава России,
г. Омск, Россия
3ФГБУ «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН,
г. Новосибирск, Россия
4БУЗОО «Называевская центральная больница», г. Называевск, Россия
В Называевском районе Омской области установлено наличие природного очага риккетсиозов группы КПЛ с циркуляцией двух видов патогенных риккетсий - R. sibirica и R. raoultii. Циркуляция классического патогена R. sibirica подтверждена сероконверсией сывороток крови пациентов и зараженных 10 %-ми суспензиями клещей рода Dermacentor морских свинок в РСК с антигеном R. sibirica, а также идентификацией этого вида риккетсий в органах биопробных животных. Амплифицированы и секвенированы фрагменты генов цитратсинтазы (gltA), 16S rRNA, поверхностного белка rOmpB. Все полученные образцы имели 100 % гомологии с R. sibirica. Нуклеотидные последовательности фрагментов гена поверхностного белка rOmpA, полученные из клещей, снятых с людей, демонстрировали 100 % гомологии с R. raoultii. Изолированный штамм R. sibirica отличается низкой иммуногенностью и вирулентностью, что характерно для штаммов, циркулирующих на периферии нозоареал СКТ.
Ключевые слова: сочетанный природный очаг риккетсиозов; иксодовые клещи; R. sibirica; R. raoultii.
I.E. Samoylenko, T.A. Reshetnikova, Ya.P. Igolkina, N.A. Okolelova, A.N. Kolomeyetz, E.V. Shalamova, A.K. Tantsev, S.V. Shtreck, N.V. Rudakov □ RESUILTS OF MICROBIOLOGICAL AND GENETIC STUDIES OF MIXED NATURAL FOCUS OF TICK-BORNE RICKETTSIOSES IN OMSK REGION □ Omsk Research Institute of Natural Focal Infections of Rospotrebnadzor, Omsk, Russia; Omsk State Medical University of the Ministry of Health of Russia, Omsk, Russia; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Novosibirsk, Russia; Nazivaevsk Central District Hospital, Nazyvayevsk, Russia.
The existance of a natural focus of SFG rickettsiae with two pathogenic species - R. sibirica and R. raoultii was revealed in Omsk region (Western Siberia). Circulation of classical pathogen R.sibirica was confirmed by seroconversion in blood samples of patients and infected by 10 °% suspensions of Dermacentor ticks animals using complement fixation test with R.sibirica antigen and by identification of this Rickettsia species in organs of infected animals. The fragments citrate synthase (gltA), 16S rRNA and rOmpB surface protein genes were amplified and sequenced. All samples demonstrated 100 °% homology with R.sibirica. The nucleotide sequence of the surface protein rOmpA gene fragments, derived from ticks, which were removed from humans, showed 100 °% homology with R. raoultii. The isolated strain R. sibirica has low immunogenicity and virulence, which is typical for the strains circulating in the periphery nosological area of tick-borne rickettsioses. Key words: combined natural focus of rickettsial diseases; ticks; R. sibirica; R. raoultii.
В современный период продолжается фор- низкой вирулентностью для морских свинок [9].
мирование ареалов риккетсий группы клеще- Для периферийных участков нозоареала СКТ
вой пятнистой лихорадки (КПЛ) - этиологичес- характерно распространение штаммов риккет-
ких агентов клещевых риккетсиозов (КР), в том сий, отличающихся низкими иммуногенностью
числе Rickettsia sibirica, с которой связана за- и вирулентностью [2].
болеваемость сибирским клещевым тифом В Омской области до недавнего времени
(СКТ). Это проявляется, наряду с уменьшением случаи СКТ не регистрировали, однако, начи-
эпидемической активности и даже угасанием ная с 2003 г. в Называевском районе наблюда-
отдельных очагов СКТ, процессом возникнове- ются случаи заболеваний после присасывания
ния новых эпидемически активных очагов по клещей с характерными для СКТ клинически-
границам нозоареала этой инфекции [4]. В ка- ми проявлениями (первичный аффект на месте
честве примеров этого процесса можно рас- присасывания клеща, лихорадка, головная боль,
сматривать очаги СКТ, изученные сотрудника- слабость, розеолезная или розеолезно-петехи-
ми Омского НИИ природно-очаговых инфек- альная сыпь).
ций в 80-90-х гг. в Тогучинском и Сузунском Начиная с 2006 г. пациенты с подобной районах Новосибирской области [3, 5] и Слад- симптоматикой регистрируются ежегодно [7]. ковском районе Тюменской области [6]. Всего за период 2003-2015 гг. из 13 населен-Штаммы Rickettsia sibirica могут быть раз- ных пунктов Называевского района в ЦРБ поделены на три группы — с высокой, умеренной и ступило 154 пациента с характерной для КР
20
ЗНиСО ноябрь №11 (204)
клинической картиной. В 2009 г. впервые серологически в реакции связывания комплемента (РСК) с антигеном R. sibirica лабораторно подтвержден случай СКТ. С 2013 г. у пациентов инфекционного отделения ЦРБ ежегодно выявляют сероконверсию к R. sibirica [8].
В исследованных полевых сборах клещей Dermacentor marginatus и D. ШюиШш, собранных в Называевском районе, выявляли фрагменты генов цитратсинтазы и поверхностного белка ошрЛ риккетсий [7].
Цель исследования - видовая идентификация риккетсий, циркулирующих в природном очаге Называевского района Омской области.
Материалы и методы. С 2011 по 2015 гг. методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров ЯР877р и ЯР1258и, амплифицирующих фрагменты гена цитратсинтазы ^ЬЛ) риккетсий [12], исследовано 18 биоптатов от пациентов (струп с места присасывания клеща).
В 2014 г. на наличие ДНК риккетсий исследованы 32 экземпляра иксодовых клещей, снятых с людей постоянно проживающих в Назы-ваевском районе. Для выявления риккетсий использовали однораундовую ПЦР с праймерами 190.180 и 190.701 [12], амплифицирующими фрагменты гена поверхностного белка ошрЛ, с последующим определением нуклеотидных последовательностей ампликонов.
В биопробах на морских свинках исследовано 547 (497 экземпляров D. marginatus и 50 экземпляров D. геЫсиШш) экземпляров иксо-довых клещей, собранных в окрестностях населенных пунктов Князево, Дурбет и Кисляки, из которых поступало наибольшее количество заболевших. Биопробы выполняли по стандартной методике [1].
ДНК риккетсий в органах биопробных животных выявляли методом двухраундовой ПЦР с праймерами из области гена gltЛ (праймеры glt1 и для первого раунда и glt3 и glt4 - для второго раунда). Для последующего секвени-рования для положительных образцов были дополнительно амплифицированы фрагменты генов 16Б гКЫЛ (праймеры 16Б1 и 16Б2 для первого раунда и 16Б3 и 16Б4 - для второго раунда) и отрВ (праймеры В1 и В2 для первого раунда и В3 и В4 - для второго раунда) [11].
ПЦР продукты очищали с использованием колонок, их нуклеотидные последовательности определяли с использованием генетических анализаторов, затем анализировали при помощи ВЬЛБТИ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLЛST) и CLUSTЛLW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ index.html) программ. Уровень гомологии последовательностей определяли с использованием GenBank в соответствии с рекомендуемыми критериями оценки [10].
Результаты исследования. С 2013 г. у пациентов инфекционного отделения ЦРБ с клиническими проявлениями СКТ сероконверсию к риккетсиям выявляют ежегодно, общее число пациентов с сероконверсией к Я. sibirica в РСК - 28 человек. Для этого вновь выявленного
очага характерно преобладание комплементс-вязывающих антител в низких титрах (1 : 201 : 40 - 21 человек, 1 : 80-1 : 320 - 7 человек). При исследовании 18 биоптатов от пациентов ДНК риккетсий выявлена в 3 образцах.
Из 32 экземпляров клещей рода Dermacen-tor, снятых с людей и исследованных молеку-лярно-биологическими методами, в двух образцах (№ 1515 и 1777) удалось амплифициро-вать и секвенировать фрагменты гена поверхностного белка ompA. Для образца № 1515 полученная нуклеотидная последовательность гена белка наружной мембраны риккетсий (OmpA) длиной 495 пар оснований имела 100 % гомологии с R. raoultii (депонент GenBank под номером AF120022 Rickettsia sp. RpA4 OmpA (ompA) gene). Для образца № 1777 полученная нуклеотидная последовательность гена OmpA длиной 631 пар оснований имела 99,8 % гомологии с тем же депонентом AF120022.
При внутрибрюшинном заражении самцов морских свинок в 6 из 11 биопроб у инфицированных животных отмечалась умеренная лихорадочная реакция с максимальным подъемом температуры на 2,5 °С и длительностью от 1 до 6 дней, в 3 случаях наблюдалась двухволновая лихорадка. При вскрытии наблюдалось преобладание слабовыраженной патолого-анатоми-ческой картины, только в 2 биопробах - выраженная, характерная для СКТ, и в 2 - умеренно выраженная. Сероконверсия в РСК с антигеном R. sibirica в невысоких титрах - 1 : 20-1 : 40 установлена также в 6 из 11 биопроб.
При исследовании органов зараженных животных в ПЦР с праймерами, амплифицирующими фрагмент гена gltA, ДНК риккетсий выявлена в 5 биопробах. Чаще в ПЦР положительно реагировали образцы яичек и лимфоузлов.
В пробе клещей D. marginatus из окрестностей села Кисляки при первичном заражении и исследовании в 3 пассажах на морских свинках идентифицирована R. sibirica. Лихорадочная реакция наблюдалась на 5-8-й день после заражения с максимальным повышением температуры на 1,7 °С от исходной, скротальный феномен максимально проявлялся во II и III пассажах (до ++) на 11-й день. Патолого-анато-мическая картина была слабо или умеренно выраженной в зависимости от пассажа. Начиная с первого пассажа, сыворотки крови морских свинок положительно реагировали в РСК с антигеном R. sibirica в титре 1 : 20. ДНК рик-кетсий выявляли во всех пассажах, преимущественно в образцах из яичек и лимфатических узлов.
В образце яичка морской свинки № 63 (II пассаж) молекулярно-биологическими методами (ПЦР + секвенирование) идентифицирована R. sibirica. Полученная нуклеотидная последовательность гена цитратсинтазы (gltA) длиной 550 пар оснований имела 100 % гомологии с депонентом GenBank под номером KM288711. Последовательность гена 16S rRNA длиной 628 пар оснований имела 100 % гомо-
ноябрь №1 (284) ЗНиСО
21
логии с депонентом GenBank под номером NR036846. Нуклеотидная последовательность гена ompB длиной 751 пар оснований имела 100 % гомологии с депонентом GenBank под номером JG582806.
Выводы. В Называевском районе Омской области установлено наличие природного очага риккетсиозов группы КПЛ с циркуляцией двух видов патогенных риккетсий - R. sibirica и R. raoultii. Циркуляция классического патогена R. sibirica подтверждена сероконверсией сывороток крови пациентов и биопробных животных в РСК с антигеном R. sibirica и идентификацией этого вида риккетсий в органах биопробных животных молекулярно-биологичес-кими методами. Присутствие в очаге R. raoultii установлено при исследовании методом ПЦР с последующим секвенированием ампликонов ДНК риккетсий из иксодовых клещей, снятых с людей.
Трудности изоляции штаммов R. sibirica, а также преобладание у пациентов и биопробных животных сероконверсии в невысоких титрах подтверждают предположение о преобладании на периферии нозоареала СКТ штаммов рик-кетсий, отличающихся низкой иммуногенно-стью и вирулентностью [2].
Работа частично поддержана грантом Минобрнауки, проект ¥1.55.1.1 (анализ риккетсий в органах биопробных животных).
ЛИТЕРАТУРА
1. Здродовский П. Ф. и др. Учение о риккетсиях и риккет-сиозах: 3-е изд., перераб. и доп. / П.Ф. Здродовский, Е.М. Голиневич. М.: Медицина, 1972. 496 с.
2. Рудаков Н.В. и др. Клещевой риккетсиоз / Н.В. Рудаков, А.С. Оберт. Омск: ОмГМА, 2001. 120 с.
3. Рудаков Н.В. и др. Новые данные о клещевом риккетсио-зе в Новосибирской области / Н.В. Рудаков, Т.П. Малых, Ю.К. Бурцева [и др.] // Мед. паразитология и парази-тар. болезни. 1990. № 3. С. 54-55.
4. Рудаков Н. В. и др. Риккетсии и риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки в Сибири / Н.В. Руда-
ков, С.Н. Шпынов, И.Е. Самойленко [и др.]. Омск: ИЦ «Омский научный вестник», 2012. 288с.
5. Рудаков Н.В. и др. Современное состояние очагов клещевого риккетсиоза в Тогучинском районе Новосибирской области / Н.В. Рудаков, И.И. Богданов, Т.П. Малых // Журн. микробиол. 1991. № 10. С. 81.
6. Рудаков Н.В. и др. Эпидемиологическая активность очагов клещевого риккетсиоза на территориях различной степени хозяйственного освоения / Н. В. Рудаков, Н.С. Горбунов, Т.В. Юханова [и др.] // Природнооча-говые болезни человека. Омск, 1991. С. 118-124.
7. Самойленко И.Е. и др. Выявление нового очага клещевого риккетсиоза в Западной Сибири / И.Е. Самойленко, Т.А. Решетникова, Е.В. Шаламова [и др.] // ЗНиСО. 2012. № 1. С. 14-15.
8. Самойленко И. Е. и др. Результаты серологического исследования на наличие антител к риккетсиям сывороток крови пациентов в Омской области РФ и Западно-Казахстанской области республики Казахстан / И.Е. Самойленко, Н.В. Рудаков, Т.А. Решетникова [и др.] // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2015. № 1(80). С. 36-38.
9. Balaeva N.M. et al. Biological and genetic characterisation of Rickettsia sibirica strains in the endemic area of the North asian tick typhus / N.M. Balaeva, M.E. Eremeeva, V.F. Ignatovich [et al.] // Am.J.Trop.Med.Hyg. 1996. 55(6). P. 685-692.
10. Fournier P.-E. et al. Gene Sequence-Based Criteria for Identification of New Rickettsia Isolates and Description of Rickettsia heilongjiangensis sp.nov. / P.-E. Fournier, J.S. Dumler, G. Greub [et al.] // J.Clin.Microbiol. 2003. V. 41. 12. P. 5456-5465.
11. Igolkina Y.P. et al. Genetic variability of Rickettsia spp. in Ixodes persulcatus / Ixodes trianguliceps sympatric areas from Western Siberia, Russia: Identification of a new Can-didatus Rickettsia species / Y.P. Igolkina, V.A. Rar, V.V. Yakimenko [et al.] // Infect Genet Evol. 2015. 34:88-93.
12. Raoult D. et al. Rickettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases / D. Raoult, V. Roux // Clin Microbiol Reviews. 1997. Vol. 10. № 4. P. 694-719.
Контактная информация:
Самойленко Ирина Евгеньевна, тел.: +7 (381-2) 65-14-77,
e-mail: [email protected] Contact information: Samoylenko Irina, phone: +7 (381-2) 65-14-77, e-mail: [email protected]
