CC BY
84
Результаты исследования характеристик костного мозга больных плоскоклеточным раком головы и шеи, их клиническое значение
Е.Г. Тимонина1, Н.Н. Тупицын1, С.О. Подвязников2, В.А. Спиридонова3, М.А. Френкель1, О.П. Колбацкая1, О.А. Чегринец1
1ФГБУ«РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 23; 2ГБОУДПО «РМАПО» Минздрава России; Россия, 125993, Москва, ул. Баррикадная, 2/1; 3Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; Россия, 119992, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40
Контакты: Елена Геннадьевна Тимонина helentim@mail.ru
В целях выявления особенностей гемопоэза у больных плоскоклеточным раком головы и шеи (ПРГШ) нами были проанализированы показатели 41 аспирата костного мозга в зависимости от клинико-морфологических характеристик опухоли и определяемых микрометастазов в костном мозге. Морфологическое и молекулярное исследования пунктатов проводили в лаборатории иммунологии гемопоэза РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Выявленные изменения клеточного состава костного мозга больных ПРГШ заключаются в увеличении относительного содержания сегментоядерных нейтрофилов, снижении уровня молодых форм гранулоцитарного ряда без изменения индекса созревания нейтрофилов и процента клеток гранулоцитарного ростка. Для низкодифференцированного ПРГШ характерной чертой является гипоклеточность костного мозга. Достоверное повышение лейко-эритробластического соотношения обусловлено редукцией эритроидного ряда; индекс созревания эритроидных клеток возрастает за счет увеличения процента оксифильных нормобластов в костном мозге больных с местно-распростра-ненным ПРГШ. Отработан высокочувствительный метод детекции матричной РНК специфического белка плоскоклеточного рака Е48 с использованием методов полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и Саузерн-блоттинга с последующим иммуноферментным анализом, позволяющим распознать микрометастазы в костный мозг у 35 % больных ПРГШ. У пациентов с выявленными микрометастазами в костный мозг определено достоверное снижение пропорции полихромато-фильных нормобластов и достоверное повышение уровня клеток гранулоцитарного ряда при нормальных показателях лимфоцитов и других клеточных элементов миелограмм. Установлено, что при наличии пораженных регионарных лимфатических узлов у больных ПРГШ достоверно чаще выявляют микрометастазы в костный мозг и прогрессирование опухоли происходит в сроки до 9 мес.
Ключевые слова: костный мозг, микрометастазы, плоскоклеточный рак головы и шеи, гемопоэз, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, амплифицированная комплементарная ДНКЕ48
DOI: 10.17650/2222-1468-2016-6-1-55-67
Results of investigating the characteristics of bone marrow in patients with squamous cell carcinoma
of the head and neck, their clinical value
E.G. Timonina1, N.N. Tupitsyn1, S.O. Podvyaznikov2, V.A. Spiridonova3, M.A. Frenkel", O.P. Kolbatskaya1, O.A. Chegrinets1
1N.N.. Blokhin Russian Cancer Research Center at the Ministry of Health of Russia; 23 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115478, Russia;
2Russian Medical Academy of Postgraduate Education at the Ministry of Health of Russia;
2/1 Barrikadnaya St., Moscow, 125993, Russia;
3A.N. Belozerskiy Research Institute of Physicochemical Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University;
Build. 40, 1 Leninskie Gory, 119992, Moscow, Russia
To reveal the specific features of hematopoiesis in patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), the authors analyzed the indicators of 41 bone marrow aspirates in relation to the clinical and morphological characteristics of the tumor and microme-tastases detected in bone marrow. Puncture samples were morphologically and molecularly examined at the Laboratory of Hematopoiesis Immunology, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center. The found changes in the bone marrow cell composition in HNSCC patients showed themselves as an increase in the relative count of segmented neutrophils and a decrease in the level of immature granulocytes with no alternations in the neutrophil maturation index and in the percentage of granulocyte lineage cells. Bone marrow hypo-cellularity is a characteristic feature of high-grade HNSCC. The significantly enhanced leuko-erythroblastic ratio was due to a reduction in red blood cells: the erythroid cell maturation index rose, by increasing the percentage of bone marrow oxyphilic normoblasts in patients with locally advanced HNSCC. A highly sensitive method for detecting mRNA of the specific squamous cell carcinoma protein
E48 was perfected using reverse-transcription polymerase chain reaction and Southern blotting, followed by an enzyme immunoassay that could recognize bone marrow micrometastases in 35 % of the patients with HNSCC. The patients with found bone marrow micro-metastases showed a significant decrease in the proportion of polychromatophilic normoblasts and a significant increase in granulocytes in the presence of normal values of lymphocytes and other cellular elements of myelograms. It was established that in the presence of regional lymph node involvement, bone marrow micrometastases were significantly more frequently in the patients with HNSCC and tumor progression over a period of up to 9 months.
Key words: bone marrow, micrometastases, head and neck squamous cell carcinoma, hematopoiesis, reverse-transcriptase polymerase chain reaction, amplified complementary DNA E48
Введение
Злокачественные опухоли головы и шеи составляют около 5 % всех неоплазий, при этом наиболее часто выявляется плоскоклеточный рак (до 80 %). Несмотря на высокий процент местно-распространенных форм, в последние годы благодаря новым современным методам отмечаются успехи в лечении плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ). В то же время отдаленные результаты остаются неудовлетворительными, что в первую очередь может говорить об особенностях клинического течения заболевания [1, 2].
Возникновение локальных рецидивов болезни, обнаружение регионарных и, в отдельных случаях, отдаленных метастазов подтолкнули клиницистов к изучению факторов прогноза при ПРГШ [3—5]. Ряд научных работ посвящен определению морфологических и биологических характеристик опухолевого процесса, популяционного состава и кинетических характеристик опухолевых клеток методом проточной ДНК-цитометрии, позволяющим оценивать биологические свойства опухолей [6—8]. Ведущими факторами прогноза остаются распространенность опухолевого процесса, размер опухоли, наличие метастазов в регионарные лимфатические узлы (ЛУ), а также локализация рака орофарингеальной зоны и степень дифферен-цировки клеток плоскоклеточного рака.
Ряд публикаций свидетельствуют о том, что более достоверная информация о распространенности опухолевого процесса может быть получена при исследовании костного мозга (КМ) больных ПРГШ [9, 10].
Роль КМ как возможной мишени гематогенного метастазирования доказана на многих опухолях эпителиальной природы. Наиболее детально изучено поражение КМ при раке молочной железы (47,0—62,5 % случаев) [11—14]. В публикациях описаны случаи КМ-микрометастазов при раке предстательной железы (до 54—85 %), немелкоклеточном раке легкого (32— 40 %), раке почки (28—40 %), колоректальном раке (8—13 %) [15—20]. Микрометастазирование в КМ при ПРГШ не изучалось вплоть до 1999 г., когда была опубликована научная работа Я.Ы. ВгакепИоГГ и соавт. [21]. В ней отмечено, что наличие небольших опухолевых кластеров или единичных опухолевых клеток в КМ больных различными типами эпителиальных опухолей
можно установить методами цитохимии и молекулярной биологии, а именно — посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Кроме того, наиболее часто используются тканеспеци-фичные маркерные антигены, такие как цитокерати-ны. Специфичной для выявления метастатических клеток ПРГШ является экспрессия гена Е48 на уровне матричной РНК (мРНК) в ОТ-ПЦР, которая позволяет обнаруживать метастатические клетки в КМ и периферической крови больных ПРГШ с высокой чувствительностью и специфичностью (1 опухолевая клетка на 10 млн миелокариоцитов).
В 2004 г. присутствие микрометастазов в КМ в качестве вероятного фактора прогноза ПРГШ было продемонстрировано D.R. Со1по1 и соавт. [9]. Ими была показана экспрессия гена Е48 клетками КМ-пунктата в 40 % случаев у больных ПРГШ. Отмечено, что обнаружение мРНК-транскриптов гена Е48 в КМ больных ПРГШ сопряжено с неблагоприятным прогнозом. Было установлено, что выживаемость больных ПРГШ с метастатическим поражением не менее 2 ЛУ достоверно снижается при наличии микрометастазов в КМ (р = 0,02). Эти данные указывают на возможность более точного стадирования опухолевого процесса и объективной оценки групп пациентов, нуждающихся в проведении дополнительных лечебных мероприятий.
Специфика роста гистогенетически различных опухолей приводит к разнообразным клиническим проявлениям в организме в целом, в том числе в системе кроветворения. Следует отметить, что гемопоэз у больных ПРГШ ранее детально не изучался, тем более в группах пациентов с наличием опухолевых клеток в КМ.
Вышеизложенное послужило основанием для проведения настоящего исследования, цель которого — изучение роли КМ-пунктата в выявлении микрометастазов в КМ для уточнения истинной распространенности опухолевого процесса, а также оценки показателей гемопоэза у больных ПРГШ.
Материалы и методы
Материалом для настоящего исследования послужили аспираты КМ 41 (38 (92,7 %) мужчин, 3 (7,3 %) женщины) больного ПРГШ, проходившего обследо-
Таблица 1. Распределение пациентов по стадии и локализации опухолевого процесса
Стадия Классификация TNM Локализация Всего, n (%)
слизистая оболоч-
ка полости рта гортаноглотка ротоглотка язык
II T2N0M0 1 1 2 5 9 (22,0)
T1-2N1M0 - 2 - 2 4 (9,8)
III T3N0M0 1 - 1 1 3 (7,3)
T3N1M0 1 - 1 4 6 (14,6)
T1-3N2M0 - 2 1 3 6 (14,6)
IVa T4aN0M0 2 - - - 2 (4,9)
T4aN1-2M0 1 - 4 2 7 (17,0)
IVb T(:ro6a.a)N3M0 2 2 - - 4 (9,8)
Всего, n (%) 8 (19,5) 7 (17,0) 9 (22,0) 17 (41,5) 41 (100)
■
вание и лечение в хирургическом отделении № 11 опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей (ОВДПП) РОНЦ им. Н.Н. Блохина в период с 2007 по 2014 г. Возраст пациентов варьировал от 33 до 75 лет, медиана — 54,4 года. Исследуемую группу составили первичные больные со II—IV стадиями заболевания.
Пациентам были проведены стандартные общеклинические и лабораторные исследования систем и органов, по результатам которых отдаленных метастазов не выявлено.
Рак языка определялся у 17 (41,5 %) больных, ротоглотки — у 9 (22 %), слизистой оболочки дна полости рта — у 8 (19,5 %), гортаноглотки — у 7 (17 %). Объем опухоли и степень распространенности процесса колебались значительно, наиболее часто определялась IV стадия заболевания — у 19 (46,3 %) пациентов (табл. 1).
При гистологическом исследовании биоптатов опухоли во всех случаях был определен плоскоклеточный рак с разной степенью дифференцировки опухолевых клеток (табл. 2).
Всем больным ПРГШ перед проведением специального лечения, применяемого в клинике ОВДПП РОНЦ им. Н.Н. Блохина с учетом локализации и распространенности опухолевого процесса, выполнялась пункционная биопсия КМ в области задней верхней ости подвздошной кости. Специальное лечение включало сочетание различных методов воздействия на опухоль. На 1-м этапе проводили 2 курса полихимиотерапии (ПХТ) в неоадъювантном режиме, после завершения которых оценивали степень регрессии опухоли. В зависимости от полученного эффекта выполняли хирургическое вмешательство, лучевую терапию (ЛТ) либо их комбинацию (табл. 3).
Химиолучевое лечение было выполнено 30 (73,2 %) больным. Комплексной терапии, включающей 2 курса неоадъювантной ПХТ по схеме PF (в 1—3-й дни 5-фторурацил 500 мг/м2 внутривенно струйно, в 4-й день цисплатин 100 мг/м2 внутривенно капельно на фоне антиэметиков, премедикации и водной нагрузки; 2-й курс — через 21 день), ЛТ на первичный очаг и зону
Таблица 2. Степень дифференцировки ПРГШ
Степень дифференцировки Стадия опухолевого процесса Всего, n (%)
II III IVa IVb
Высокодифференцированный 2 8 7 - 17(41,5)
Умеренно дифференцированный 7 5 4 2 18 (43,9)
Низкодифференцированный - - 4 2 6 (14,6)
Всего, n (%) 9 (22,0) 13 (31,7) 15 (36,6) 4 (9,8) 41 (100)
I
Таблица 3. Методы лечения пациентов с ПРГШ
Локализация опухоли Объем проведенного лечения Всего, n (%)
комплексное химиолучевое оперативное отказ от лечения
Слизистая оболочка 2 1 7 (17,1)
4 —
полости рта
Гортаноглотка 1 5 - 1 7 (17,1)
Ротоглотка 2 8 - - 10 (24,4)
Язык 4 13 - - 17(41,4)
Всего, п (%) 9 (22,0) 30 (73,2) 1 (2,4) 1 (2,4) 41 (100)
регионарных ЛУ шеи (разовая очаговая доза — 2 Гр, суммарная очаговая доза — 44—50 Гр) с последующим хирургическим вмешательством в дальнейшем подверглись 9 (22 %) пациентов. В эту же группу включили 2 больных, которым было выполнено комплексное лечение с включением таксанов по схеме: таксотер 75 мг/м2 и цисплатин 75 мг/м2 в 1-й день, 5-фторура-цил 750 мг/м2 каждые 24 ч в виде непрерывной внутривенной 120-часовой инфузии с дальнейшим проведением 5 циклов сочетанного химиолучевого лечения. Одному пациенту с раком слизистой оболочки полости рта (Т4К2М0) была выполнена радикальная операция на 1-м этапе лечения из-за выраженного болевого синдрома и угрозы распада опухоли. Еще 1 больному был проведен 1 курс ПХТ, от дальнейшего лечения он отказался.
В нашей работе период наблюдения составил от 3 до 9 мес. Из 41 пациента, получившего лечение, про-грессирование опухолевого процесса было отмечено у 12 (29,3 %). У 2 (4,9 %) больных при IV стадии рака орофарингеальной области прогрессирование опухолевого процесса привело к летальному исходу через
12%
3%
n = 41
12 %
68 %
Рецидив, n = 5
Продолжительный рост, n = 5
■ Живы, п = 28
Летальный исход, п = 2 В Отказ от лечения, п = 1
Рис. 1. Прослеженность больных ПРГШ после проведенного лечения
7—8 мес динамического наблюдения. Живы без про-грессирования опухолевого процесса в сроки наблюдения до 9 мес 28 (68,3 %) пациентов (рис. 1).
Забор аспирата КМ из верхней задней ости подвздошной кости (spina iliaca posterior superior) выполнялся по общепринятой методике иглой Jamshidi. При морфологическом исследовании пунктатов особое внимание обращали на качество забора КМ, стараясь брать не более 0,5 мл. Полученный материал помещали в пробирки «Вакутайнер» (1,0—1,5 мг К2ЭДТА), тщательно перемешивали, маркировали и направляли в лабораторию иммунологии гемопоэза РОНЦ им. Н.Н. Блохина.
Микроскопическое исследование выполнялось двумя экспертами-гемоцитологами, просматривали 6 препаратов КМ по следующим параметрам:
♦ поиск метастатических клеток в препаратах КМ;
♦ подсчет и описание миелограммы.
Для оценки КМ-кроветворения после подсчета КМ-элементов производился расчет индексов миело-граммы:
♦ индекс созревания эритрокариоцитов;
♦ индекс созревания нейтрофилов;
♦ соотношение лейкоцитов и эритроцитов (Л/Э).
Для оценки количественных значений аспиратов
КМ и периферической крови были использованы границы нормальных показателей В.В. Соколова и И.А. Грибовой (1972) [22]; эти расчетные значения соответствуют M ± 1,5с и включают 80—90 % наблюдений. Нормы расчетных индексов красной крови: средний объем эритроцитов (в фемтолитрах), среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците (в пикограммах), концентрация гемоглобина в эритро-цитарной массе (в граммах на литр), — рассчитывали по Ю.В. Кузнецову (2003) [15].
Молекулярный анализ аспирата проводили методом ОТ-ПЦР. Исследовали мРНК от 4 до 54 млн мие-локариоцитов.
Ведение культур эукариотических клеток. Клеточные линии RPMI 8226 и A431 культивировали во фла-
конах (25 и 75 см2) в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С и содержании СО2 5 %. Для ведения этих культур клеток использовали культуральную среду RPMI 1640 или DMEM с добавлением 10 % телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотика. Высевали клетки каждые 3—4 дня.
Техника проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
Выделение ДНК. К клеточной суспензии добавляли 0,1 % от объема раствора SDS и проводили разрушение мембран клеток посредством троекратного замораживания/размораживания. Далее добавляли равное по объему количество фенола, встряхивали содержимое пробирки на вортексе и центрифугировали при 13 400 об/мин в течение 10 мин. Затем верхнюю фазу переносили в пробирку с равным объемом смеси фенол + хлороформ + изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1, интенсивно встряхивали и центрифугировали при 13 400 об/мин в течение 10 мин. Отбирали верхнюю фазу, добавляли к ней равный объем хлороформа и снова центрифугировали при 13 400 об/мин в течение 10 мин. Далее снова отбирали верхнюю фазу, переносили ее в новую пробирку и добавляли 10 % от объема 3 М ацетата натрия (рН 5,0) и равное по объему количество изопропилового спирта и оставляли на ночь в морозильной камере при температуре —20 °С, на следующий день пробирку вновь центрифугировали при 13 400 об/мин в течение 10 мин. Осадок высушивали и ресуспендировали деи-онизованной водой.
Выделение РНК. К клеточной суспензии добавляли гуанидин-тиоцианатный буфер (4 М гуанидин тиоциа-нат, 25 мМ натрия цитрат рЫ 7,0, 0,5 % натрия К-лауроилсаркозинат, 0,1 % р-меркаптоэтанол), выдерживали 10 мин при комнатной температуре, добавляли 10 % от объема 3 М ацетата натрия (рН 5,0), интенсивно перемешивали содержимое пробирки, добавляли равный объем фенола, выдерживали 5 мин при комнатной температуре, добавляли смесь хлороформ + изоамиловый спирт в соотношении 24:1, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 13 400 об/мин в течение 10 мин. Далее отбирали верхнюю фазу, переносили ее в новую пробирку, повторяли экстракцию с фенолом и хлороформом. После этого отбирали водную фазу, добавляли 2,5 объема этилового спирта и оставляли на ночь в морозильной камере при температуре —20 °С, затем центрифугировали при 13 400 об/мин в течение 10 мин, осадок высушивали и ресуспендировали деионизован-ной водой.
ОТ. Реакцию проводили стандартно в объеме 40 мкл. К 20 мкл РНК добавляли 2 мкл политимиди-нового олигонуклеотида (18 звеньев) и на 5 мин помещали пробирку в термостат при температуре +70 °С. Добавляли 8 мкл 5-кратного буфера для ОТ, 4 мкл смеси дезоксирибонуклеотидов, 4 мкл ингибитора
рибонуклеазы и на 5 мин помещали пробирку в термостат при температуре +37 °С. После добавляли 2 мкл фермента MMulV ОТ и на 1 ч помещали пробирку в термостат при температуре +42 °С. Фермент инакти-вировали 10 мин при температуре +70 °С.
ПЦР проводилась на амплификаторе «Терцик» (Россия). В случае каждой пары праймеров использовалась индивидуальная программа. Для амплификации комплементарной ДНК (кДНК) Е48 использовали следующие пары праймеров: Е-48 forward: 5'-CAGAC GACATCAGAGATGAGGACAGC-3' и E48 reverse: 5'-GGGCAGACCACAGAATGCTTGC-3'.
Условия амплификации: денатурация при +90 °С (1 мин), отжиг праймеров при +65 °С, элонгация при +72 °С (1 мин). Цикл повторяли 40 раз. Продукт амплификации - 130 пар оснований (п. о.).
Контроль качества мРНК оценивали по амплификации мРНК ß-глобина. Использовали праймеры: ß-globin forward: 5' -CTGGGCAGGCTGCTGGTG-3' и ß-globin reverse: 5-GCTTGTCACAGTGCAGCTC-3'.
Условия амплификации: денатурация при +94 °С (45 с), отжиг праймеров при +60 °С, элонгация при +72 °С (30 с). Цикл повторяли 30 раз. Продукт амплификации - 210 п. о.
Амплификацию геномной ДНК Е48 осуществляли с теми же праймерами, что и амплификацию мРНК Е48, денатурация при +94 °С. Продукт амплификации - 908 п. о.
ПЦР с включением 32Р проводилась на амплификаторе «Терцик» (Россия). Для амплификации использовали следующие пары праймеров: Е-48 forward: 5'-CAGACGACATCAGAGATGAGGACAGC-3' и E-48 reverse: 5'-GGGCAGACCACAGAATGCTTGC-3'.
Реакцию проводили в объеме 50 мкл: к 20 мкл кДНК добавляли 5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР, 5 мкл хлорида магния, 1 мкл смеси dNTP (1 мкл dATP + 1 мкл dTTP + 1 мкл dGTP + 1 мкл ^-dCTP + 6 мкл воды), 16 мкл воды, 2 мкл праймеров Е48, 1 мкл TAG-полимеразы. Продукт амплификации - 130 п. о.
ПЦР с включением BrdUTP проводилась на ампли-фикаторе «Терцик» (Россия). Для амплификации использовали следующие пары праймеров: Е-48 forward: 5'-CAGACGACATCAGAGATGAGGACAGC-3' и E-48 reverse: 5'-GGGCAGACCACAGAATGCTTGC-3'.
Реакцию проводили в объеме 50 мкл: к 20 мкл кДНК добавляли 5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР, 5 мкл хлорида магния, 1 мкл смеси dNTP (1 мкл dATP + 1 мкл dCTP + 1 мкл dGTP + 1 мкл BrdUTP + 6 мкл воды), 16 мкл воды, 2 мкл праймеров Е48, 1 мкл TAG-полимеразы. Продукт амплификации -130 п. о.
Электрофорез. Для разделения ПЦР-продукта ам-плифицированных фрагментов использовали 1,5 % легкоплавкую агарозу на TBE-буфере с добавлением Ethidium bromide (Helicon, Россия) или SYRB Green
(Roche, Германия). Электрофорез проводили в элек-трофоретической камере Helicon (Россия) в течение 25—30 мин. Гель документировали на видеосистеме GI-2.
Саузерн-блоттинг. Проводили электрофоретиче-ский перенос на Criterion Blotter (Bio Rad) в течение 15 мин при 30 В. Мембрану предварительно инкубировали в TBE-буфере на протяжении 5 мин.
Ультрафиолетовая (УФ) фиксация. Фиксацию мембраны проводили в камере УФ-облучения CL-1000 Ultraviolet Crosslinker (БиоХимМак, Россия) в течение 10 мин в режиме 2000-4000.
Иммуноферментное окрашивание мембран Hybond-N+ Саузерн-блоттинга. Мембрану инкубировали в течение 5 мин в 0,1 Трис-NaCl (pH 7,5); 15 мин — в блокирующем буфере (0,1 Трис-NaCl, pH 7,5 + 5 % обезжиренного сухого молока); 45 мин — с анти-BrdU (в разведении 1:1000 в блокирующем буфере) при температуре +37 °С; затем производили 3 отмывки по 5 мин в Трис-NaCl.
Инкубацию с анти-мышиными антителами, меченными пероксидазой хрена (разведение 1:2000 в блокирующем буфере), проводили в течение 30 мин при температуре +37 °С; далее — 3 отмывки по 5 мин в Трис-NaCl. ECL добавляли на мембрану Amersham Hybond-N+ на 1 мин, затем экспонировали мембрану с пленкой Amersham Hyperfilm в течение 1 сут. Следующий этап — проявление в темной комнате: проявитель и фиксаж — по 5 мин, промывка водой и высушивание.
Иммунофлуоресцентное окрашивание. Мембрану предварительно инкубировали в 0,7 М гидроксида натрия в течение 10 мин; затем 5 мин в 0,1 Трис-NaCl (pH 7,5); 15 мин — в блокирующем буфере (0,1 Трис-NaCl, pH 7,5 + 5 % обезжиренного сухого молока); 45 мин — с анти-BrdU (в разведении 1:1000 в блокирующем буфере) при температуре +37 °С; после чего производили 3 отмывки по 5 мин в Трис-NaCl, инкубацию с анти-BrdU (+FITC) в течение 30 мин при температуре +37 °С, 3 отмывки по 5 мин в Трис-NaCl. Сканирование мембраны осуществляли на приборе Typhoon 9410 (ФГБНУ «НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Оре-ховича»).
Статистический анализ данньх
Статистическую обработку результатов исследования проводили методом математического анализа данных с применением пакета компьютерных программ Excel и SPSS.10 for Windows и использованием методической литературы [23, 24]: анализ ранговых корреляций, сравнение средних значений двух выборок и t-критерий для независимых выборок с оценкой по уровню значимости; подсчет распределения частот по категориям с непрерывными и дискретными переменными; критерий Сомерса для качественных переменных.
Результаты и обсуждение
Возможности использования нерадиоактивных методов молекулярной диагностики метастатического поражения костного мозга при плоскоклеточном раке головы и шеи При морфологическом исследовании образцов КМ 41 больного ПРГШ (по 6 мазков в каждом случае) метастатических клеток выявлено не было.
Нами проведено молекулярное исследование КМ у 41 больного ПРГШ различных стадий заболевания. РНК выделяли из 4,4—54,0 млн миелокариоцитов. У всех пациентов определяли экспрессию гена Е48 в стандартной ОТ-ПЦР с использованием для выявления продукта ПЦР красителя бромистого этидия, внесенного в агарозный гель. Ни в одном из изученных образцов КМ экспрессии гена Е48 на уровне мРНК не обнаружено.
В целях определения чувствительности обнаружения продукта ПЦР РНК выделяли из 100 тыс. клеток линии А431, которая постоянно экспрессирует белок Е48. Выделенную общую РНК разводили в 10, 100, 1000, 10 000 и 100 000 раз, проводили ОТ, затем ПЦР. Бромистый этидий выявлял продукт ПЦР, соответствующий мРНК Е48, выделенной из 100 клеток линии А431. Подобная чувствительность обнаружения продукта ПЦР не является достаточной для выявления микрометастазов ПРГШ в КМ больных.
Мы заменили ДНК-связывающий краситель бромистый этидий на более чувствительный — SYBR Green I. При проведении экспериментов на клеточной линии А431 SYBR Green I позволяет выявлять продукт
Рис. 2. Сравнение чувствительности SYBR Green I (а) и бромистого этидия (б) (титрование мРНК линии А431). Справа налево: маркер молекулярной массы, далее — последовательно продукты ПЦР, соответствующие мРНК линии А431, выделенной из 100000, 10000, 1000, 100, 10 и 1 клетки. Бромистый этидий выявляет мРНК из 100 клеток, SYBR Green I — мРНК из 10 клеток (слабая полоса). Продукт ПЦР соответствует 130 п. о. Верхняя полоса — несвязавшиеся праймеры, интенсивность этой полосы возрастает при уменьшении количества специфического продукта ПЦР
Рис. 3. Радиохроматография (а) и радиоавтография (б) агарозного геля с 32P-dCTP, включенным в кДНК Е48 (130 п. о.) линии А431 (радиоавтограф LB2722-2 (BERTHOLD, Германия) с проточным детектором LB6280 и системой обработки данных (интегратором) HP3396A)
амплифицированной мРНК Е48, выделенной из 10 клеток. Но в этом случае окрашивание амплифицированной кДНК в 130 п. о. является крайне слабым и не всегда воспроизводимым. При внесении 30 мкл продукта ПЦР в агарозный гель экспрессия мРНК Е48 выявляется в 10 клетках линии А431, однако этой чувствительности также недостаточно для обнаружения микрометастазов. Необходимый порог чувствительности должен соответствовать мРНК 1 клетки линии А431 (рис. 2).
Для повышения чувствительности обнаружения экспрессии Е48 нами была предпринята попытка повышения чувствительности обнаружения продукта ОТ-ПЦР за счет использования радиоизотопной метки (радиоактивно меченные нуклеотиды по 32Р). При замене холодного dCTP на радиоактивно меченный 32P-dCTP на этапе ПЦР нуклеотид включался в ДНК, что было установлено посредством как радиохроматографии, так и последующей радиоавтографии (рис. 3).
Рис. 4. Эффективность переноса амплифицированной кДНК Е48 (130 п. о.) методом Саузерн-блоттинга из агарозного геля на мембрану после электрофоретического разделения продуктов ПЦР: а — агарозный гель после разделения продуктов ПЦР; б — мембрана НуЪопё-Ы+ после переноса на нее продуктов ПЦР с геля. Справа налево: на 1-й дорожке маркеры молекулярной массы, 2-я дорожка пустая, 3-я дорожка — продукт амплификации кДНКЕ48, по молекулярной массе соответствует 130 п. о. Рисунок демонстрирует высокую эффективность электро-форетического переноса на мембрану
Рис. 5. Сравнение чувствительности выявления мРНК Е48 радиоактивным методом (а) и в обычной ПЦР (б). Справа налево: 1-я дорожка соответствует маркеру, вторая — геномной ДНК Е48 (908 п. о.), третья — кДНКЕ48 (130 п. о.). Рис. а: 1-я дорожка не видна, так как маркеры не являются радиомечеными. Рис. б: значительное усиление сигнала после радиоавтографии
Определение порога чувствительности радиоактивного мечения выполняли на линии А431. РНК, выделенную из 100 000 клеток А431, последовательно разводили и проводили ОТ. Радиоактивно меченный нуклеотид (32Р^СТР) добавляли на этапе ПЦР-амплификации кДНК, полностью замещая им холодный dCTP. Последующий электрофорез в агарозном геле проводили по стандартной методике.
Мы использовали электрофоретический Саузерн-блоттинг (см. рис. 3), который позволяет проводить реакцию в более короткое время и избежать диффузии, снижающей чувствительность метода. Это особенно ценно при определении мРНК единичных опухолевых клеток. Эффективность электрофоретического переноса продуктов ПЦР из агарозного геля на мембрану НуЪо^-К+ показана на рис. 4.
Использование радиоактивной метки и электрофоретического Саузерн-блоттинга повышает чувствительность обнаружения до 1 клетки линии А431. Это видно на примере как гена Е48, так и кДНК (рис. 5).
Однако применение радиоактивной метки имеет ряд ограничений из-за того, что радиоактивность — изотоп с короткой жизнью (период полураспада 32Р 2 нед) и требует регулярных поставок, объем которых невозможно заранее спланировать с учетом поступления больных. Поэтому необходимо вести поиск более чувствительных нерадиоактивных методов. Для этого потребовалось придание ДНК иммуногенности. В качестве иммуногена использовали ВМИТР При оценке эффективности видно его включение в продукты с различной молекулярной массой: 130 п. о. — кДНК Е48, 210 п. о. - кДНК р-глобина, 908 п. о. - ДНК гена Е48 с интроном (рис. 6).
б
б
а
Рис. 8. Иммунолюминесцентное проявление BrdU, включенного в кДНК Е48. Сканирование мембраны: а — после электрофоретического иммуно-блоттинга (справа налево): маркер молекулярной массы, геномная ДНК Е48(908п. о.), кДНКЕ48 (130 п. о.), бромистый этидий; б — фрагмент мембраны с полосой кДНК Е48 после окрашивания FITC-меченными антителами к BrdU, отмывок и проявления на приборе Typhoon 9440
Рис. 6. Включение BrdUTP (вместо dTTP) в продукт ПЦР: I - 908 п. о. - ген Е48; II - 210 п. о. - ß-глобин; III - 130 п. о. - кДНКЕ48
Рис. 7. Фиксация ДНК с включенным BrdUTP УФ-облучением: а — мембрана после блоттинга; б — УФ-фиксация (увеличенный фрагмент)
Таким образом, использование BrdUTP на этапе ПЦР позволяет эффективно выявлять ПЦР-продукты с различной молекулярной массой (130 п. о., 210 п. о., 908 п. о.). Однако в этих экспериментах не исключена возможность включения нуклеотидов (dTTP), применявшихся на этапах ОТ и синтеза кДНК Е48. Прямое подтверждение включения BrdUTP и иммуногенности продукта ПЦР может быть получено только иммуно-логически.
Поскольку любое иммунологическое проявление требует многократных отмывок от несвязавшихся антител, то необходима дополнительная фиксация ДНК к мембране, что в нашем случае было осуществлено с помощью УФ (рис. 7).
После отмывок и нанесения флуоресцирующих антител к BrdU в ФГБНУ «НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» проводили сканирование мембраны на приборе Typhoon 9440 (лазер 488 нм), детектировали излучение 532 нм (рис. 8).
Таким образом, продукт ПЦР с включенным BrdU выявляется с помощью флуоресцирующих антител прямым конъюгатом анти-BrdU-FITC (см. рис. 8).
По данным литературы [25], флуоресцентное окрашивание уступает иммуноферментному по чувствительности в несколько раз. Это хорошо известно как из иммуногистохимического опыта окрашивания
Рис. 9. Высокая чувствительность хемилюминесцентного проявления (линия А431): а — нейлоновая мембрана НуЪопё-Ы+ после непрямого иммуноферментного окрашивания и отмывок перенесенной Саузерн-блоттингом амплифицированной кДНК Е48 (окрашивание бромистым этидием); б — фотопленка после хемилюминесцентного проявления связавшихся с ДНК антител, меченных пероксидазой хрена (значительное усиление сигнала)
тканей, так и из использования иммуноферментного окрашивания продуктов ПЦР с хемилюминесцентной детекцией сигнала. Чувствительность иммунофермент-ного метода соответствует чувствительности метода детекции мРНК с радиоактивной гибридизацией (32Р^СТР). По этим причинам мы оценили возможность использования непрямого иммуноферментного метода для выявления ВМи-меченной кДНК Е48. В качестве субстрата в этих случаях стандартно применяли Е^ (рис. 9).
Проведение исследований на модельной системе — клетках линии А431 — с использованием разведений РНК и добавлением различных количеств клеток к нормальному КМ позволило установить, что данным методом возможно обнаруживать 1 клетку А431 среди 10 млн миелокариоцитов КМ. В 11 контрольных образцах КМ (здоровые лица или пациенты с гемоблас-тозом) сигнал Е48 не обнаружен (исследовали от 5 х 106 до 3 х 107 миелокариоцитов).
Иммуноферментное проявление ВМиТР, включенного в продукт ОТ-ПЦР после Саузерн-блоттинга с использованием в качестве субстрата Е^, значительно повышает чувствительность обнаружения метастатических клеток ПРГШ в КМ и позволяет выделять мРНК из 1 клетки.
б
Таким образом, нами разработан высокочувствительный нерадиоактивный метод детекции экспрессии мРНК Е48, включающий 16 этапов. Разумеется, данный метод является достаточно трудоемким.
1. Выделение общей РНК.
2. Выполнение ОТ.
3. Проведение ПЦР с включением ВгёИТР вместо <1ТТР.
4. Разделение продуктов ПЦР электрофорезом в агарозном геле.
5. Электрофоретический Саузерн-блоттинг, перенос продуктов ПЦР на нейлоновую мембрану.
6. Высушивание мембраны.
7. Фиксация ДНК к мембране УФ-облучением.
8. Блокирование неспецифического связывания антител.
9. Обработка мембраны антителами к ВгёИ.
10. Отмывки от несвязавшихся антител.
11. Нанесение вторичных антител, меченных пе-роксидазой хрена.
12. Отмывки от несвязавшихся антител.
13. Нанесение субстрата ECL.
14. Помещение мембраны в тонкую пленку (необходимо избегать контакта влажной мембраны с фотопленкой).
15. Экспозиция с высокочувствительной фотопленкой в специальных кассетах.
16. Проявка фотопленки.
Подводя итог этому разделу работы, можно отметить, что нами оценен ряд методов, позволяющих повысить чувствительность обнаружения амплифици-рованной кДНК Е48. Наиболее приемлемыми с точки зрения возможности обнаружения 1 метастатической клетки ПРГШ среди 10 млн миелокариоцитов явились радиоактивный метод и иммуноферментный метод с усилением хемилюминесцентного сигнала.
С использованием высокочувствительных методов исследование проведено у 19 больных ПРГШ (4,4 х х 106 — 5,4 х 107 миелокариоцитов). В 2 случаях из 19 было отмечено низкое качество РНК (не было сигнала мРНК р-глобина). Из 17 оставшихся пациентов у 6 (35,3 %) выявлен продукт экспрессии Е48, 130 п. о. (в позитивных случаях изучено 1,1 х 107 — 2,7 х 107 миело кариоцитов).
Характеристика гемопоэза у больных
плоскоклеточным раком головы и шеи
Возникновение опухоли и ее дальнейшее развитие приводят к разнообразным клиническим проявлениям в организме. Сложный комплекс биологически активных веществ, продуцируемых опухолью, оказывает влияние на системы и органы человека, в том числе на гемопоэз.
Анализ 41 аспирата КМ показал, что миелограммы больных независимо от количества миелокариоцитов характеризуются уменьшением содержания молодых
35 30 ■ 25 .20 15 10 5 - 0
.—In Ii. 1 1
Промиелоциты Миелоциты Метамиелоциты Сегментоядерные Палочкоядерные ■ Норма показателей аспирата ■ Нормальная клеточность аспирата
Сниженная клеточность аспирата
Рис. 10. Изменение клеточного состава гранулоцитарного ростка
.1.1
Норма показателей аспирата
Сниженная клеточность аспирата
Нормальная клеточность аспирата
■ Моноциты ■ Лимфоциты
Рис. 11. Уровень моноцитов и лимфоцитов в КМ больных ПРГШ
Базофильные Полихроматофильные Оксифильные
■ Сниженная клеточность I Норма показателей аспиратов
■ Нормальная клеточность
Рис. 12. Редукция клеток эритроидного ряда в КМ больных ПРГШ
форм и увеличением зрелых элементов нейтрофильно-го ряда (в сравнении с нормой) без изменения индекса созревания нейтрофилов и процента клеток грануло-цитарного ростка (рис. 10).
Количество моноцитов и лимфоцитов было достоверно выше нормы у пациентов с нормальной и сниженной клеточностью (р = 0,05) (рис. 11).
При сравнении с нормой показателей клеток эри-троидного ростка было выявлено снижение базофиль-ных и полихроматофильных нормобластов с одновременным повышением содержания оксифильных форм (р = 0,05), что привело к увеличению индекса созревания эритроидных клеток. При этом сумма клеток эритроидного ряда не выходила за пределы нормальных значений (рис. 12).
В группе больных с метастазами в КМ (МТС) отмечено достоверное повышение суммарного количества клеток гранулоцитарного ростка до 72 % в сравнении с пациентами без микрометастазов в КМ (МТС) за счет всех (зрелых и незрелых) морфологически распознаваемых форм (рис. 13).
Учитывая данные изменения, закономерным является снижение показателя индекса созревания ней-
p = 0,03
Сумма гранулоцитов MTC+ ■ MTC-
Норма
Рис. 13. Суммарное количество клеток гранулоцитарногоряда в 2группах больных ПРГШ
"83;?
а? 90 г § 80 . Ц 70 . I 60 .
50 . И 40 .
СС
=1 30 . ! 20 . = 10. ь 0
£ МТС+ мтс
■ Повышение ■ Норма
Рис. 14. Частота повышения уровня лимфоцитов в КМ2 групп больных ПРГШ
МТС-
МТС+
Снижение
Норма
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о существовании отличий в показателях КМ-кроветворения у больных ПРГШ по сравнению с нормой.
Взаимосвязь показателей гемопоэза с клиническими и морфологическими характеристиками опухоли Особенностей КМ-кроветворения в зависимости от пола и возраста больных не выявлено. Нами установлено, что локализация опухолевого процесса имела ограниченную связь с показателями миелограмм. При раке ротоглотки отмечено снижение уровня мие-лоцитов (р = 0,03) и повышение содержания лимфоцитов (р = 0,04). Следует отметить, что при проведении молекулярного исследования КМ наибольшую группу представляли больные раком языка. Нами были оценены 2 группы пациентов в зависимости от локализации опухоли: поражение языка (п = 8) и остальные локализации орофарингеальной зоны (п = 9) — ротоглотка (п = 2), гортаноглотка (п = 2), слизистая оболочка полости рта (п = 5) (табл. 3).
Наиболее часто микрометастазы в КМ выявляются при раке языка (в 2,5 раза чаще, чем при других локализациях), однако в нашем исследовании мы не получили корреляции между наличием микрометастазов в КМ и локализацией опухолевого процесса (р = 0,232).
В зависимости от размера первичной опухоли показано нарушение дифференцировки эритрокарио-цитов без изменения их процентного содержания (21,8 ± 2,9 %) в миелограмме при размере опухоли Т4
Таблица 3. Выявление микрометастазов в зависимости от локализации опухолевого процесса
Рис. 15. Частота снижения уровня полихроматофильных нормобластов в КМ 2 групп больных ПРГШ
трофилов (среднее значение нормы — 0,6). В обеих группах отмечено снижение индекса созревания ней-трофилов до 0,4 (р = 0,76). Уровень лимфоцитов у МТС+-пациентов был в пределах нормы, что отличает их от остальных больных ПРГШ и косвенно свидетельствует об отсутствии разбавления периферической кровью (рис. 14).
Суммарное количество клеток эритроидного ростка в КМ в 2 рассматриваемых группах пациентов (МТС+ и МТС) достоверно не различалось, отличия касались только полихроматофильных нормобластов (4,6 ± 1,2 и 8,0 ± 1,2 соответственно, р = 0,02). При выявлении микрометастазов процентное содержание этих клеток было достоверно снижено и не было зафиксировано ни одного случая, где бы количество полихро-матофильных нормобластов колебалось в нормальных пределах (рис. 15).
Локализация опухолево-
Микромета- го процесса х2 р
стазы язык, n (%) остальные, n (%)
Наличие Отсутствие
4 (50) 4 (50)
2 (22) 7 (78)
16 аг 14 | 12 | 10 § 8
I 6
II 4
О ^ 2
0
Базофильные Полихроматофильные Оксифильные
■ Т2 Т3 ■ Т4 ■ Норма
Рис. 16. Влияние размера первичной опухоли на эритроидный росток
Таблица 4. Взаимосвязь первичного объема опухоли и поражения КМ Таблица 6. Поражение регионарных ЛУ(N1—3) и микрометастазы в КМ
Размер первичной опухоли Микрометастазы X2 р
наличие, n (%) отсутствие, n (%)
Т2 3 (42,9) 4(57,1)
Т3 1 (16,7) 5(83,2) 1,466 0,481
Т4 2(50,0) 2(50,0)
■
■
Клеточность КМ Регионарные метастазы X2 р
N0, n (%) N1, n (%)
Сниженная 9 (64,3) 1 (9,1) 7,819 0,005
Нормальная 5 (35,7) 10 (90,9)
Микрометастазы в КМ Поражение регионарных ЛУ X2 р
нет, n (%) есть, n (%)
Наличие 0 (0) 4(100) 2,0 0,046
Отсутствие 3(37,5) 5 (62,5)
и изолированное повышение оксифильных нормо-бластов (11,5 %; р < 0,05) в этой группе, что достоверно отличается от содержания данных элементов в нормальном КМ и у больных с размером опухоли Т2 и Т3 (рис. 16).
Объем первичной опухоли не имел статистически значимой взаимосвязи с наличием микрометастазов ПРГШ в КМ (табл. 4).
Обращает на себя внимание тот факт, что микрометастазы в КМ могут обнаруживаться даже при опухолях небольшого размера (Т2).
Нами оценены аспираты КМ больных с поражением регионарных ЛУ и без. Существенных различий в показателях клеточного состава КМ не выявлено (р > 0,05). Различия определялись только в количестве миелокариоцитов (24,3 х 109/ли48,1 х 109/л в группах с поражением ЛУ и без соответственно; р = 0,01). В зависимости от размера и количества пораженных ЛУ отмечено снижение уровня миелокариоцитов при N0 - 24,3 ± 3,7 х 109/л против N1 - 46,5 ± 8,3 х 109/л и N2 - 47,6 ± 15,6 х 109/л (р < 0,05) (табл. 5).
При сравнении 2 групп больных — с положительным сигналом мРНК Е48 в КМ и при отсутствии мРНК Е48 — поражение регионарных ЛУ (N1—3) наблюдалось чаще у пациентов с микрометастазами в КМ (р = 0,046) (табл. 6).
Стадия опухолевого процесса в большей степени определяет прогноз течения заболевания, так как включает совокупность 2 критериев: локальное распространение и поражение зон регионарного мета-стазирования. При сопоставлении показателей миело-
Таблица 5. Клеточность КМ в зависимости от статуса ЛУ (N0 и N1)
грамм при различных стадиях (II, III, 1Уа, 1УЬ) опухолевого процесса статистически достоверных различий получено не было. Также нами не установлено взаимосвязи микрометастатического поражения КМ со стадией заболевания ПРГШ (р = 0,78).
Степень дифференцировки опухолевых клеток плоскоклеточного рака имеет достоверную взаимосвязь с особенностями КМ-кроветворения у больных ПРГШ. Так, для низкодифференцированных опухолей оказалось характерным резкое снижение клеточности КМ (14,5 х 103/мкл; р = 0,091) и изолированное снижение уровня метамиелоцитов (5,3 %; р = 0,049) в сравнении с умеренно дифференцированными опухолями (рис. 17).
Мы проанализировали миелограммы больных в зависимости от дальнейшего течения опухолевого процесса после проведенного лечения. Прогрессирование опухолевого процесса отмечено у 12 пациентов. Сравнение миелограмм в 2 группах (с прогрессированием опухоли, п = 12, и без такового, п = 28) выявило изменения в отдельных показателях аспиратов. В группе больных с прогрессированием опухолевого процесса определялось снижение клеточности КМ практически в 2 раза по сравнению с группой без прогрессирования (27,1 ± 5,2 и 46,0 ± 8,5 соответственно), однако статистически достоверных различий не получено (р = 0,17). Кроме того, уровень молодых клеток гранулоцитарно-го ростка - промиелоцитов у пациентов с прогресси-
50
40
30
20
10
Высокая
Низкая
Умеренная
■ Миелокариоциты
Степень дифференцировки опухолевых клеток
Рис. 17. Влияние степени дифференцировки первичной опухоли на показатели аспирата КМ
Таблица 7. Взаимосвязь прогрессирования опухолевого процесса и наличия микрометастазов в КМ пациентов
Микрометастазы в КМ Прогрессирование опухолевого процесса х2 р
нет, n (%) есть, n (%)
Наличие 3(50,0) 3(50,0) 3,61 0,057
Отсутствие 10 (90,9) 1 (9,1)
I
рованием опухоли был снижен и составил 0,017 ± 0,01, в то время как в группе без прогрессирования — 0,3 ± 0,06 (р = 0,016).
Молекулярный анализ аспиратов КМ показал, что в группе с положительным сигналом Е48 частота прогрессирования заболевания составила 50 %, у пациентов без поражения КМ — 9,1 % (р = 0,057) (табл. 7).
Выводы
Подводя итог вышеизложенному, стоит отметить, что изменения в миелограммах больных ПРГШ могут свидетельствовать о своего рода «реакции» КМ на опухолевый рост, что согласуется с современными представлениями о влиянии опухолевых клеток на КМ-кроветворение. В случаях с выявленными микрометастазами эти изменения носят более очерченный характер и заключаются в увеличении суммарного содержания клеток гранулоцитарного ростка и снижении полихроматофильных нормобластов при нормальном уровне лимфоцитов и ряда других клеток КМ. Патогенетической причиной этих изменений, возможно, является продукция опухолевыми клетками комплекса биологически активных веществ, которые влияют на КМ-кроветворение. Кроме того, эти изменения возможно расценивать как проявления местного иммунного ответа на присутствие чужеродного компонента в КМ больных ПРГШ.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2013 году. Под ред.: М.И. Давыдова, Е.М. Аксель. М., 2015. [Statistics
of malignant neoplasms in Russia and CIS countries in 2013. By eds.: M.I. Davydov, Е.М. Aksel'. Moscow, 2015. (In Russ.)].
2. Пачес А.И. Опухоли головы и шеи. М.: Медицина, 2000. С. 126-42; 320-40. [Paches A.I. Head and neck tumors. Moscow: Mеditsina, 2000. Pp. 126-42; 320-40.
(In Russ.)].
3. Матякин Е.Г. Клинические аспекты регионарного метастазирования рака языка и гортани. Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 1988. [Mаtyakin E.G. Clinical aspects of the regional tongue and pharynx metastases. Author's abstract of thesis ...
of doctor of medicine. Moscow, 1988. (In Russ.)].
4. Нуммаев Г.М. Рак гортаноглотки (современные методы диагностики, лечения и прогноза). Автореф. дис. ...
д-ра мед. наук. М., 1988. [Nummaev G.M. Hypopharynx cancer (modern diagnostics, treatment and forecast method). Author's abstract of thesis ... of doctor of medicine. Moscow, 1988. (In Russ.)].
5. Kademani D., Bell R.B., Bagheri S. et al. Prognostic factors in intraoral squamous cell carcinoma: the influence of histologic grade. J Oral Maxillofac Surg 2005;63(11): 1599-605.
6. Ахундов А.А. Клиническое значение ди-плоидности ДНК при плоскоклеточном раке слизистой оболочки полости рта. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2000.
[Akhundov А.А. Clinical value of the DNA diploidy at the epidermoid cancer of the oral mucosa. Author's abstract of thesis ... of candidate of medicine. Moscow, 2000. (In Russ.)].
7. Уваров А.А. Органосохраняющие методы лечения местно-распространенного рака орофарингеальной области. Дис. . д-ра мед. наук. М., 1997. [Uvarov А.А. Оrgan-preserving methods of treatment
of the local cancer of the oropharyngeal area. Thesis ... of doctor of medicine. Moscow, 1997. (In Russ.)].
8. Худират С.А. Анализ ДНК-цитомет-рических данных и их использование
для прогнозирования течения опухолевого процесса при злокачественных опухолях слизистой оболочки полости рта и гортани. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 1998. [Khudirat SA. Analysis of DNA-cytometric data and its use for the forecasting of the tumor process course at malignant neoplasms of the mouth cavity and pharynx. Author's abstract of thesis ... of candidate of biology. Moscow, 1998. (In Russ.)].
9. Colnot D.R., Nieuwenhuis E.J., Kuik D.J. et al. Clinical significance of micrometastatic cells detected by E48 (Ly-6D) reverse transcription-polymerase chain reaction
in bone marrow of head and neck cancer patients. Clin Cancer Res 2004;10(23): 7827-33.
10. Partridge M., Brakenhoff R., Phillips E. et al. Detection of rare disseminated tumor cells identifies head and neck cancer patients at risk of treatment failure. Clin Cancer Res 2003;9(14):5287-94.
11. Крохина О.В. Микрометастазы рака молочной железы в костный мозг. Имму-номорфологическая диагностика. Дис. ... канд. мед. наук. М., 2003. [Krokhina О.У. Micrometastases of the mammary gland cancer to the bone marrow. Immuno-morphologic diagnostics. Thesis ... of candidate of medicine. Moscow, 2003. (In Russ.)].
12. Mansi J.L., Easton D., Berger U. et al. Bone marrow micrometastases in primary breast cancer: prognostic significance after 6 years' follow-up. Eur J Cancer 1991;27(12):1552-5.
13. Harbeck N., Untch M., Pache L., Eiermann W. Tumour cell detection
in the bone marrow of breast cancer patients at primary therapy: results of a 3-year median follow-up. Br J Cancer 1994;69(3):566-71.
14. Wiedswang G., Borgen E., Karesen R. et al. Detection of isolated tumor cells
in bone marrow is an independent prognostic factor in breast cancer. J Clin Oncol 2003;21(18):3469-78.
15. Кузнецов Ю.В., Ковригина Е.С., Байдун Л.В. и др. Использование эритро-цитарных индексов и показателей обмена железа в дифференциальной диагностике микроцитарных анемий. Гематология
и трансфузиология 2000;45(6):46-8. [Kuznetsov Yu.V., Kovrigim E.S., Baydun L.V. et al. Using of erythrocyte indices and of iron exchange indices in the differential diagnostics of microcytic anemias. Gematologiya i transfuziologiya = Hematology and Transfusiology 2000;45(6):46-8. (In Russ.)].
16. Hofmann T., Buchner A., Hofstetter A. et al. Prognostic relevance of disseminated tumour cells in bone marrow of patients with transitional cell carcinoma. Eur J Cancer 2007;43(18):2678-84.
17. Pantel K., Aignherr C., Kollerman J. et al. Immunocytochemical detection of isolated cells in bone marrow of patients with untreated stage C prostatic cancer. Eur J Cancer 1995;31A(10):1627-32.
18. Pantel K., Izbicki J., Passlick B. et al. Frequency and prognostic significance of isolated tumour cells in bone marrow of patients with non-small-cell lung cancer without overt metastases. Lancet 1996;347(9002):649-53.
19. Soeth E., Roder C., Juhl H. et al. The detection of disseminated tumor cells in bone marrow from colorectal-cancer
patients by a cytokeratin-20-specific nested reverse-transcriptase-polymerase-chain reaction is related to the stage of disease. Int J Cancer 1996;69(4):278-82.
20. Weitz J., Kienle P., Magener A. et al. Detection of disseminated colorectal cancer cells in lymph nodes, blood
and bone marrow. Clin Cancer Res 1999;5(7):1830-6.
21. Brakenhoff R.H., Stroomer J.G., ten Brink C. et al. Sensitive detection
of squamous cells in bone marrow and blood of head and neck cancer patients by E48 reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Clin Cancer Res 1999;5(4):725-32.
22. Соколов В.В., Грибова И.А. Гематологические показатели здорового человека.
М.: Медицина, 1972. [Sokolov V.V., Gribova I.A. Hematologic indices of healthy
humans. Moscow: Meditsina, 1972. (In Russ.)].
23. Наследов А.Д. SPSS. Компьютерный анализ данных в психологии и социальных науках. СПб.: Питер, 2005. [Nasledov AD. SPSS. Computer analysis of data in psychology and social sciences. Saint Petersburg: Piter, 2005. (In Russ.)].
24. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М., 2006. [Rebrovа O.Yu. Statistic analysis
of medical data. Application of the applied programs' package STATISTICA. Moscow, 2006. (In Russ.)].
25. Dakhama A., Hegele R.G. A nonradio-active method for rapid and sensitive detection of polymerase chain reaction products
by use of bromo-desoxyuridine. Mod Pathol 1996;9(8):849-53.
