CC BY
36
Уточняющие методы гематогенного распространения опухолевого процесса при плоскоклеточном раке головы и шеи
Е.Г. Тимонина1, Н.Н. Тупицын1, С.О. Подвязников2
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2кафедра онкологии ГОУДПО РМАПО, Москва
Контакты: Елена Геннадьевна Тимонина helentim@mail.ru
В последние годы появились публикации о клинической значимости обнаружения костномозговых микрометастазов плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ) на основе экспрессии гена Е48 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и радиоактивным проявлением (гибридизация с 32Р-меченой пробой). Метод позволяет обнаруживать одну метастатическую клетку среди 10 млн миелокариоцитов. При исследовании образцов костного мозга 41 больного ПРГШ цитологическими методами и стандартным методом ОТ-ПЦР метастатических клеток выявлено не было. С целью повышения чувствительности ОТ-ПЦР нами использованы радиоактивные и нерадиоактивные методы детекции мРНК Е48, что позволило выявить микрометастазы ПРГШ в костном мозге у 35,3 % больньх.
Ключевые слова: плоскоклеточный рак головы и шеи, костный мозг, микрометастазы, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
Methods for clarifying the hematogenic spread of a tumor process in squamous-cell carcinoma of the head and neck
E.G. Timonina1, N.N. Tupitsyn1, S.O. Podvyaznikov2
IN.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
2Department of Oncology, Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Moscow
There have recently been publications on the clinical importance of identifying bone marrow micrometastases of head and neck squamous-cell carcinoma (HNSCC) on the basis of E48 gene expression by reversal-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and radioactive detection (hybridization with a 32P-labelled probe). The method allows one to detect a metastatic cell among 10 million myelokaryocytes. Examination of bone marrow samples from 41 patients with HNSCC by cytoassays and standard RT-PCR revealed no metastatic cells. To enhance the sensitivity of RT-PCR, the investigators used radioactive and non-radioactive methods for E48 mRNA detection, which permitted bone marrow micrometastases from HNSCC to be identified in 35.3 %> of the patients.
Key words: squamous-cell carcinoma of the head and neck, bone marrow, micrometastases, reversal-transcription polymerase chain reaction
По данным ВОЗ, ежегодно выявляется 551 000 больных с первичным раком головы и шеи, при этом 217 000 погибают в первый год наблюдения. Число больных с гистологическим вариантом плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ) достигает 90 %. Несмотря на современные методы диагностики в России до 60 % больных с диагнозом «злокачественные образования полости рта и глотки» поступают в специализированные лечебные учреждения с местно-распространенным опухолевым процессом (III—IV стадии) [1].
ПРГШ относится к группе онкологических заболеваний с неблагоприятным течением болезни. Подтверждением тому является высокий процент развития локоре-гионарных метастазов, рецидивов болезни и в отдельных случаях развитие отдаленных метастазов с крайне неблагоприятным прогнозом. Многие годы изучались различные факторы прогноза. Однако мнения авторов весьма противоречивы о приоритете прогностических признаков дальнейшего развития опухолевого процесса.
Большинство больных ПРГШ погибают от прогрессирования опухолевого процесса, обусловленного развитием локорегионарных метастазов, в отдельных случаях развитием отдаленных метастазов с поражением отдельных органов с крайне неблагоприятным прогнозом [2—5]. Неоднократно проводились исследования больных, умерших от ПРГШ. Так, М.Б.М. КоюЫ е! а1. (2001) выявили метастазы в костный мозг при аутопсии 177 больных раком головы и шеи в 24,3 % (43 пациента) случаев. Из них рак языка — 33,3 % (7 пациентов из 21) случаев, опухоли полости рта — 33,3 % (6 из 18), опухоли парафарингеальной области — 21,2 % (7 из 33) и 9,4 % (3 из 32) — рак гортани и другие опухоли. При гистологическом исследовании среди всех случаев рака орофарингеальной области (124 пациента) гематогенное метастазирование плоскоклеточного рака выявлено у 12,4 % больных [6].
В последние годы появились научные публикации об определении присутствия микрометастатических
клеток в костном мозге (КМ) больных при ПРГШ и возможной связи с распространенностью опухолевого процесса [7, 8]. Определяемые отдаленные метастазы свидетельствуют о гематогенном распространении опухолевых клеток, для которого идеальную мишень представляет КМ [9—11].
Развитие современных технологий позволило не только распознать механизмы метастазирования, но и сделало возможным выявление единичных опухолевых клеток в КМ и периферической крови.
КМ является органом повышенной васкуляриза-ции и интенсивного обмена между собственно гемо-поэтической тканью и периферической кровью. Это создает оптимальные условия для осаждения циркулирующих опухолевых клеток в КМ. Предполагаемые опухолевые микродиссеминаты могут находиться в покоящемся, «дремлющем» состоянии (dormant cells, фаза G0 клеточного цикла) и многие годы не вызывать какой-либо иммунной реакции окружающих тканей [12—15]. Совокупность факторов, способствующих переходу из «дремлющего» состояния в состояние активной пролиферации, т. е. возобновлению клеточного цикла и персистенции в КМ с последующим транспортом активированных клеток в определенные органы-мишени вторичного метаста-зирования, специфична для различных опухолей и, кроме того, недостаточно изучена [16]. Опухолевые отсевы в КМ могут выглядеть как единичные разрозненные, изолированные или солитарные клетки или их группы — микрометастазы. Они также определяются и в периферической крови — как циркулирующие опухолевые клетки. Спустя годы после радикального лечения эти клетки могут активизироваться и давать метастатический рост. В связи с чем опухолевые ми-кродиссеминаты могут являться мишенью для применения таргетной терапии.
Многочисленные работы по изучению КМ, проведенные в течение последних трех 10-летий, позволили сделать вывод о большой значимости исследования КМ при различных нозологических формах опухолей, так:
- КМ редко поражается изолированно от других органов;
- изменение состава аспирата может быть косвенным признаком поражения КМ на этапе развития опухолевого процесса;
- при некоторых злокачественных заболеваниях исследование КМ имеет прогностическое значение.
Роль КМ как возможного источника гематогенного метастазирования доказана при многих опухолях эпителиальной природы. В последнее время появились публикации о наличии микрометастатического поражения КМ при ПРГШ в 35—40 % случаев [7, 17—19].
В течение длительного времени усилия биологов, иммунологов и клиницистов были направлены на
разработку методик, позволяющих обнаружить опухолевые клетки в КМ больных.
Альтернативным подходом для выявления микро-метастатического поражения КМ, в том числе больных ПРГШ, является метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
ПЦР позволяет обнаружить мельчайшие фрагменты генетического материала в образцах интересующей ткани [20]. Метод основан на амплификации ДНК с помощью ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с 2 олигонуклеотидных праймеров (затравок). Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3'-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Очевидно, что для амплификации интересующего района ДНК необходимо иметь хотя бы минимальную информацию о его концевых участках с тем, чтобы синтезировать соответствующие праймеры. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующих-ся молекул ДНК. Каждая из вновь синтезированных с помощью одного из праймеров молекул ДНК может служить матрицей для синтеза комплементарной ДНК с помощью другого праймера. Для этого надо лишь денатурировать образовавшиеся в результате первого цикла двухцепочечные молекулы ДНК, дать возможность праймерам комплементарно присоединиться к ДНК и осуществить элонгацию. Эти 3 операции составляют цикл ПЦР и приводят к удвоению количества ДНК в образце. Следует отметить, что любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и последовательности участку ДНК, выбранному для амплификации (такие молекулы образуются после 2-го цикла ПЦР). Поэтому ПЦР приводит к экспоненциальному росту количества именно таких, ограниченных с 2 сторон праймерами, молекул ДНК. Следовательно, теоретически за 20 циклов ПЦР можно получить амплификацию заданного участка ДНК в 220, т. е. примерно в миллион раз. Вследствие этого метод получил название полимеразной цепной реакции. Специфичность амплификации заданного участка ДНК обеспечивается за счет специфичности гибридизации праймеров. Эффективность метода ПЦР такова, что по прошествии 25—30 циклов достаточно использовать для анализа десятую часть реакционной смеси, даже в том случае, если исходное количество нужной ДНК в пробирке было исчезающе малым.
Анализируемый материал может быть представлен как молекулами ДНК, так и РНК. Для амплификации нуклеотидных последовательностей, представленных молекулами РНК, ПЦР предшествует стадия обрат-
ной транскрипции (ОТ-ПЦР). РНК служит матрицей для ревертазы, и образующаяся кДНК подвергается стандартной амплификации. Этот прием может оказаться предпочтительным в тех случаях, когда амплификация самого гена невозможна из-за наличия в нем протяженных интронов, так что полимераза не способна пройти расстояние, отделяющее один праймер от другого. Для большинства мРНК эукариот праймером для обратной транскрипции может служить олиго(ёТ). Он же может быть использован в качестве одного из праймеров при последующих ПЦР. Этот метод используется для обнаружения в образцах ткани заданной матричной РНК (мРНК) опухолевых антигенов, экспрессируемых метастатическими клетками, или поиске мРНК генов, мутации которых специфичны для опухолевых клеток. Одним из замечательных свойств ПЦР является возможность не только ампли-фицировать нужную ДНК, но и возможность внести в нее при этом необходимые изменения, которые окажутся включенными в состав амплифицированной ДНК или РНК и в дальнейшем окажут неоценимую помощь при идентификации продукта ПЦР. Например, используя 32Р-меченные синтетические олигонуклеотиды, можно выявлять единичные замены нуклеотидов в выбранных локусах геномной ДНК. Таким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в мизерных количествах в образце ткани, что особенно актуально для диагностики микрометастазов и циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови, для которой ПЦР открывает совершенно новые перспективы. Чувствительность ПЦР при выявлении опухолевых клеток составляет 1 опухолевая клетка на 1 миллион нормальных клеток КМ, а некоторые модификации ПЦР достигают чувствительности 1 на 20 х 106 клеток.
Особенности течения плоскоклеточного рака орофарингеальной области, высокая частота отдаленных метастазов подвигли многих авторов более подробно изучать причины столь бурного течения опухолевого процесса и возможность определить маркер, который избирательно реагировал с нормальным плоским и переходным эпителием, а также с их злокачественным аналогом. Таким маркером оказался МКА Е48. Ген, кодирующий антиген Е48, который избирательно эскпрессируется у больных ПРГШ и позволяет выявить Е48 транскрипты в КМ методом ОТ-ПЦР.
В 1999 г. была опубликована научная работа Вгаке^ой" е! а1., в которой отмечено, что наличие небольших опухолевых кластеров или единичных опухолевых клеток в КМ больных различными эпителиальными опухолями можно установить методами цитохимии и молекулярной биологии, а именно ОТ-ПЦР с использованием тканеспецифичных маркерных антигенов, таких как цитокератины. Специфичным для выявления метастатических клеток ПРГШ
является экспрессия гена Е48 на уровне мРНК в ОТ-ПЦР, которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью (1 опухолевая клетка среди 10 миллионов миелокариоцитов). Сам антиген специфичен для многослойного плоского эпителия и опухолей соответствующего гистогенеза [17].
В 2000 г. V.M.M. van Houten et al. провели исследование 28 больных ПРГШ методом Е48 ОТ-ПЦР, которое позволило выявить поражение КМ у 35 % больных преимущественно при III и IV стадиях заболевания и в 4 случаях при рецидиве, тогда как контрольные образцы КМ (без рака) были отрицательными [19].
Аналогичные исследования, проведенные в некоторых научных центрах (2003, 2004), подтвердили эту информацию. Авторами показана экспрессия гена Е48 клетками костномозгового пунктата в 40 % случаев и отмечено достоверное снижение выживаемости больных ПРГШ с поражением не менее 2 метастатических лимфатических узлов (ЛУ) (р = 0,02) в этой группе больных [7, 8].
Нами проведен анализ предложенных методов выявления микрометастатических клеток КМ больных ПРГШ. Следует отметить, что методику, предложенную для выявления экспрессии данного гена V.M.M. van Houten et al. (2000), трудно назвать подходящей для клиники. Она включает проведение ОТ-ПЦР, капиллярный Саузерн-блоттинг, гибридизацию с радиоактивно (32Р) меченой кДНК с последующей радиоавтографией. Чувствительность метода составляет — 1 клетка на 2—7 х 107 лейкоцитов крови (2—7 мл), в клинических исследованиях определения проводили в 2—5 мл КМ. При титровании РНК и взятии в реакцию 5 пг общей РНК линии SCC реакция не была воспроизводимой. Реакция считалась положительной, если сигнал присутствовал хотя бы в одном из 4 повторов. Видимо, это связано с тем, что в этом случае амплифицируется примерно 1/3 общей РНК клетки — 5 из 17 пг [19].
Материалы и методы
На основании вышеизложенного нами проведено молекулярное исследование КМ у 41 больного с ПРГШ различных стадий. Исследуемую группу составили первичные пациенты II—IV стадий заболевания. Больные проходили обследование и лечение в хирургическом отделении опухолей верхних дыхательнопищеварительных путей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН за период 2007—2008 гг.
Больным проведены стандартные общеклинические и лабораторные исследования систем и органов. По результатам обследования пациентов отдаленных метастатических изменений выявлено не было.
Среди пациентов были преимущественно мужчины — 38 (92,6 %) человек, женщин — 3 (7,3 %). Возраст больных варьировал от 33 до 75 лет, средний возраст составил 54,4 года.
Объем опухоли и степень распространенности процесса колебались значительно. Наиболее часто определялась IV стадия заболевания — у 19 (46 %) пациентов (рис. 1).
частота распределения по стадиям заболевания
частота выявления опухолевого поражения
III стадия, n = 9 IIII стадия, n = 13 . IVa стадия, n = 15 I IVb стадия, n = 4
рак языка, п = 17
рак ротоглотки, п = 9
рак гортаноглотки, п = 7
рак слизистой оболочки полости рта, п = 8
Рис. 1. Частота распределения больных по стадии и локализации опухолевого процесса
При гистологическом исследовании биоптатов опухоли во всех случаях рака орофарингеальной области определен плоскоклеточный рак с разной степенью дифференцировки опухолевых клеток (рис. 2).
гистологический вариант плоскоклеточного рака
■ высокодифференцированный, n =18
■ умереннодифференцированный, n = 17 _ низкодифференцированный, n = 6
Рис. 2. Степень дифференцировки плоскоклеточного рака
Всем больным, вошедшим в наше исследование, перед проведением специального лечения, применяемого в клинике ОВДПП РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН с учетом локализации и распространенности опухолевого процесса, выполнялась пункционная биопсия КМ в области задней верхней ости подвздошной кости (spina iliaca posterior superior) по общепринятой методике иглой «Jamshidi».
Микроскопическое исследование выполнялось 2 экспертами-гемоцитологами, просматривались 6 пре-
паратов КМ. При морфологическом исследовании образцов КМ 41 больного ПРГШ (по 6 мазков в каждом случае) метастатических клеток выявлено не было.
Возможности использования нерадиоактивных методов молекулярной диагностики метастатического поражения КМ при ПРГШ
Нами проведено молекулярное исследование КМ у 41 больного ПРГШ. РНК выделяли из 4,4—5,4 миллионов миелокариоцитов. Всем больным определена экспрессия гена Е48 в стандартной ОТ-ПЦР с использованием для выявления продукта ПЦР красителя этидиум бромид, внесенного в агарозный гель при разделении продуктов ПЦР. Ни в одном из изученных образцов КМ экспрессии гена Е48 на уровне мРНК не обнаружено.
С целью определения чувствительности обнаружения продукта ПЦР РНК выделяли из 100 000 клеток линии А431, которая постоянно экспрессирует белок Е48. Краситель этидиум бромид выявлял продукт ПЦР, соответствующий мРНК Е48, выделенной из 100 клеток линии А431. Подобная чувствительность обнаружения продукта ПЦР не является достаточной для выявления микрометастазов ПРГШ в КМ больных. Мы заменили ДНК-связывающий краситель этидиум бромид на более чувствительный — SYBR Green I. При проведении экспериментов на клеточной линии А431, SYBR Green I позволяет выявлять продукт амплифицированного мРНК Е48, выделенного из 10 клеток. Этой чувствительности также недостаточно для выявления микрометастазов. Необходимый порог чувствительности должен соответствовать мРНК 1 клетки линии А431.
Для повышения чувствительности обнаружения экспрессии Е48 предпринята попытка обнаружения продукта ОТ-ПЦР за счет использования радиоизо-топной метки (радиоактивно меченые нуклеотиды по 32Р). В эксперименте использование радиоактивной метки и электрофоретического Саузерн-блоттинга повышает чувствительность обнаружения до 1 клетки А431, что особенно ценно при определении мРНК единичных опухолевых клеток.
Однако использование радиоактивной метки имеет ряд ограничений: радиоактивность и период полураспада 32Р (14 дней), что требует регулярных поставок радиоизотопа, а это невозможно планировать с учетом поступления больных.
Все это сделало необходимым поиск более чувствительных нерадиоактивных методов. Для этого потребовалось придание ДНК иммуногенно-сти. В качестве иммуногена использовали BrdUTP (бромдезоксиуридин-трифосфата). Использование BrdUTP на этапе ПЦР позволяет эффективно выявлять ПЦР -продукты с различной молекулярной массой — 130 п. о., 210 п. о., 908 п. о. (п. о. — пар
оснований). Однако в экспериментах не исключена возможность включения нуклеотидов, использовавшихся на этапе обратной транскрипции синтеза кДНК Е48. Подтверждение этому может быть получено иммунологически. После отмывок и нанесения флюоресцирующих антител проводилось сканирование мембраны на приборе TYPHOON 9440 (лазер 488нм, детектировали излучение 532 нм). Продукт ПЦР с включенным BrdU выявляется с помощью флуоресцирующих антител прямым конъюгатом анти-BRDU-FITC (BD, USA). Однако флуоресцентное окрашивание уступает иммуноферментному по чувствительности в несколько раз и соответствует таковой при использовании детекции мРНК с радиоактивной гибридизацией (32P-dCTP). По этим причинам мы оценили возможность использования непрямого иммуноферментного метода для выявления BRDU-меченой кДНК Е48. В качестве субстрата в этих случаях стандартно используется ECL (хемилюминесцент-ное усиление).
По нашим данным, иммуноферментное проявление BrdUTP, включенного в продукт ОТ-ПЦР, после Саузерн-блоттинга с использованием в качестве субстрата ECL значительно повышает чувствительность обнаружения метастатических клеток ПРГШ в КМ и позволяет выделять мРНК из 1 клетки. Следует отметить, что нами проведен анализ 11 контрольных образцов КМ (здоровые лица; больные гемобласто-зами), сигнала Е48 не обнаружено (исследовали от 5 х 106 — 3 х 107 миелокариоцитов).
Результаты и обсуждение
С использованием данного метода исследование образцов КМ проведено у 19 больных ПРГШ (0,44— 5,4 х 107 миелокариоцитов). В 2 случаях из 19 было отмечено низкое качество РНК (не было сигнала мРНК Р-глобина). Из 17 оставшихся пациентов у 6 (35,3 %) выявлен продукт экспрессии Е48, 130 п. о. (в позитивных случаях изучено 1,1—2,7 х 107 миелокариоцитов).
Мы изучили, насколько наиболее важные прогностические признаки взаимосвязаны с обнаружением единичных опухолевых клеток в КМ больных ПРГШ. Наиболее значимая связь отмечена с поражением регионарных ЛУ и прогрессированием опухолевого процесса (рис. 3).
Поражение регионарных ЛУ при III и IV стадиях ПРГШ наблюдалось в 100 % случаев при наличии
%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
поражениерегионарных
лимфатическихузлов
100
МТС+ МТС-
IN -N+
%
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
прогрессирование опухолевого процесса
50
МТС -
МТС+
Рис. 3. Частота поражения ЛУ и прогрессирование опухолевого процесса при наличии микрометастазов в КМ больных ПРГШ
микрометастазов в КМ и в 63 % — при их отсутствии. Взаимосвязь между признаками статистически значима (р = 0,46). Так же в группе больных с положительным сигналом Е48 частота прогрессирования болезни после проведенного лечения составила 50 %, а в группе сравнения — 9 %. Взаимосвязь близка к достоверной (р = 0,57).
При анализе размера первичной опухоли и ее локализации (р = 0,481, р = 0,232 соответственно), стадии заболевания (р = 0,78) и степени дифференциров-ки опухоли (р = 0,984) достоверных закономерностей не выявлено.
Выводы
Метастатические клетки ПРГШ не выявляются в пунктатах КМ морфологическими методами и с использованием ОТ-ПЦР (экспрессия мРНК специфического белка ПРГШ Е48).
Повышение чувствительности метода детекции мРНК Е48 введением радиоактивно меченых нуклеотидов или включением ВгёиТР с последующим иммуноферментным окрашиванием после Саузерн-блоттинга и хемилюминесцентным проявлением позволяет выявить микрометастазы ПРГШ в КМ у 35,3 % больных.
Обнаружение микрометастазов в КМ больных ПРГШ ассоциируется с большей частотой поражения регионарных ЛУ при III и IV стадиях заболевания (100 % и 62,5 %, р = 0,046) и более частым прогрессированием болезни в сроки до 9 мес (50 % и 9,1 %, р = 0,057).
1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований
в России и странах СНГ в 2004. М., т. 17, прил. 1. 47 с.
2. Ferlito A., Shaha A. R., Silver C. E. et al. Incidence and sites of distant metastases from head and neck cancer. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 2001;63:202-7.
3. Schwender F.T., Wollner I., Kunju L.P.
et al. Squamous cell carcinoma of the buccal mucosa with metastases to the pericardial cavity, lung and thyroid. Oral Oncol 2002;38:114-6.
4. Shingaki S., Suzuki I., Kobayashi T. et al. Predicting factors for distant metastases in head and neck carcinomas: an analysis of 103 patients with locoregional control. J Oral Maxillofac Surg 1996;54:853-7.
5. Vega L.G., Dipasquale J., Gutta R.
Head and neck manifestations of distant carcinomas. Oral Maxillofac Surg Clin North Am 2008;20:609-23.
6. Koichi M.S.M., Kunio N., Satoyuki K. Bone marrow metastasis and direct bone invasion in autopsy cases of head and neck tumors. Japanese Journal of Cancer Clinics 2001;47:759-69.
7. Colnot D.R., Nieuwenhuis E.J.C.,
Kuik D.J. et al. Clinical significance of micrometastatic cells detected by E48 (Ly-6D) reverse transcription-polymerase chain
ЛИТЕРАТУРА
reaction in bone marrow of head and neck cancer patients. Clinical Cancer Research 2004;10:7827-33.
8. Partridge M., Brakenhoff R.H., Phillips E. et al. Detection of rare disseminated tumor cells identifies head and neck cancer patients at risk of treatment failures. Clin Cancer Res 2003;9:5287-94.
9. Pantel K., Aignher C., Kollerman J. et al. Immunocytochemical detection of isolated cells in bone marrow of patients with untreated stage C prostatic cancer. Eur J Cancer 1995;31:1627-32.
10. Papac R.J. Bone marrow metastases.
A review. Cancer 1994;74:2403-13.
11. Крохина О.В. Микрометастазы рака молочной железы в костный мозг. Имму-номорфологическая диагностика. Дис. ... канд. мед. наук. М., 2003. 170 с.
12. Pantel K., Cote R.J. New strategies in minimal residual cancer. Inpharma Weekly Suppl 1998;1:3-6.
13. Pantel K., Schlimok G., Braun S. et al. Differential expression of proliferationassociated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells.
J Natl Cancer Inst 1993;85:1419-24.
14. Riethmuller G., Holz E., Schlimok G. et al. Monoclonal antibody therapy for resected Dukes’ C colorectal cancer. J Clin Oncol 1998;16:1788-97.
15. Riethmuller G., Schneider-Gadicke E., Schlimok G. et al. Randomized trial of monocolonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes’ C colorectal carcinoma. German Cancer Aid 17-1A Study Group. Lancet 1994;343:1177-83.
16. Pantel K., Schlimok G., Kutter D.
et al. Frequent down-regulation of major histocompatibility class I antigen expression on individual micrometastatic carcinoma cells. Cancer Res 1991;51:4712-5.
17. Brakenhoff R.H., Stroomer J.G.W., ten Brink C. et al. Sensitive detection of squamous cells in bone marrow and blood of head and neck cancer patients by E48 reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Clinical Cancer Research 1999;5:725-32.
18. Gath H.J., Heissler E., Hell B. et al. Immunocytologic detection of isolated tumor cells in bone marrow of patients with squamous cell carcinomas of the head and neck region. Int J Oral Maxillofac Surg 1995;24:351-5.
19. Van Houten V.M.M., Tabor M.P., van den Brekel M.W. et al. Molecular assays for the diagnosis of minimal residual head and neck cancer: methods, reliability, pitfalls and solutions. Clin Cancer Res 2000;6:3803-16.
20. Варапетян А. Полимеразная цепная реакция. Молекулярная биология 1991;4:926-36.
