CC BY
109
РАЗДЕЛ IV
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 615.28:61.001.5
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НОВОГО АНТИСЕПТИКА НА ДОКЛИНИЧЕСКОМ УРОВНЕ
В.И. Присакарь, С.А. Бурачева, В.И. Цапков,
Государственный университет медицины и фармации им. Н. Тестемицану. Республика Молдова
Присакарь Виорел Иванович - e-mail: [email protected]
Представлены результаты доклинических исследований in vitro и in vivo новой фармацевтически активной субстанции нитрофуранового ряда и созданного на ее основе антибактериального препарата Изофурал в виде 0,1% мази. Разработанный препарат в 12 раз менее токсичен и в 5-20 раз более активен (в зависимости от вида микроорганизма] по сравнению со структурным аналогом - Фурацилином. Полностью подавляет рост и размножение грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в кратчайшие сроки после контакта с ними и способствует быстрому устранению гнойно-воспалительного процесса и ускоряет регенерацию тканей. Препарат не обладает канцерогенным действием, не вызывает патологических изменений гемограммы, биохимических показателей крови и деструктивных изменений внутренних органов и кожи. Может быть рекомендован для лечения наружных гнойно-воспалительных процессов.
Ключевые cAOBa: антисептик, антибактериальная активность, лечение гнойно-воспалительных заболеваний.
Presents the results of preclinical studies in vitro and in vivo new pharmaceutically active substance nitro-furans series and was created on the basis of its antibiotic izofural as 0,1% ointment.
Elaborated product is 12 times less toxic and is 5-20 times more active (depending on the type of microorganism) in compare with the structural analogue - furacilini. Completely inhibits the growth and reproduction of Gram-positive and gram-negative organisms in a short time after contact with them, contributes to the rapid elimination of purulent-inflammatory process and quick tissues recovery . The drug does not have carcinogenic effect, does not cause pathological changes in hemogram, biochemical parameters of blood and destructive changes of internal organs and skin. Can be recommended for treatment of external inflammatory processes.
Key words: antiseptic, antibacterial activity, the treatment of inflammatory diseases.
Открытие в ХХ веке пенициллина внесло радикальные изменения в медицинскую практику и позволило сохранить жизни миллионам людей. За период от начала производства пенициллина (1941 г.) и до наших дней были разработаны многочисленные группы новых препаратов (антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны), пополнивших арсенал антибактериальных средств. Однако антибактериальная терапия по-прежнему остается острейшей проблемой для практической медицины, что обусловлено:
- доминирующим положением инфекционных заболеваний в патологии как человека, так и животных;
- ростом числа заболеваний, вызванных условно патогенной флорой;
- большим потенциалом микроорганизмов вырабатывать устойчивость к любым антибактериальным препаратам и дезинфицирующим средствам, что снижает или даже полностью исключает их эффективность;
- не в последнюю очередь проблема антибактериальной терапии связана и со стоимостью медикаментов. В большинстве случаев их цена достигает значимых цифр, что ограничивает использование препаратов населением.
Решение проблемы видится в постоянном пополнении списка антибактерильных средств, в том числе и препаратами, разработанными на основе местного сырья.
В этих целях на базе лаборатории Внутрибольничных инфекций при кафедре эпидемиологии Государственного университета медицины и фармации им. Н. Тестемицану Республики Молдова на протяжении многих лет ведется
поиск новых соединений противомикробного действия. В результате были выявлены оригинальные растительные и синтетические вещества, обладающие выраженной антибактериальной активностью и малой токсичностью, которые могли бы найти применение в медицине и ветеринарии в качестве новых антисептических препаратов.
Одно из этих веществ - изогидрафурал - новое органическое соединение ряда нитрофуранов, было использовано в качестве фармацевтически активной субстанции при разработке нового антисептического препарата Изофурал в виде
0,1% мази [1, 2].
Цель исследования: изучение на доклиническом уровне антибактериальных, токсических, дермато-резорбтивных и канцерогенных свойств нового фармацевтически активного вещества и разработанного на его основе антибактериального препарата Изофурал в виде 0,1% мази.
Материалы и методы
Доклинические исследования активной субстанции и препарата проведены in vitro и in vivo. Антибактериальную активность оценивали методом серийных разведений в жидкой питательной среде (2%-м мясо-пептонном бульоне, а для стрептококков - в сахарном бульоне) [3,4]. В качестве тест-культур были использованы стандартные грам-положительные и грамотрицательные микроорганизмы: Staphylococcus aureus (Wood-46,Smith, 209-P), Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis, Escherihia coli (ATCC), Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris. Бактериостатическую активность определяли визуально по отсутствию роста микроорганизмов в жидкой
питательной среде, а бактерицидную - по отсутствию роста культур после высева на твердую питательную среду.
Экспериментальные исследования вещества и препарата in vivo проведены на 960 белых крысах линии Wistar, 190 белых мышах и 45 кроликах. Животных содержали согласно ветеринарному законодательству и подвергли эвтаназии в соответствии с требованиями по гуманитарному содержанию и использованию животных в экспериментальных целях [5]. Были изучены острая (LD50) и хроническая токсичность [6, 7], дерматорезорбтивное действие [6], канцерогенный и эмбриотоксический потенциал [8, 9, 10], влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов крови [11]. Функцию печени определяли по уровню общих протеинов [12, 13], р-липопротеинов [13, 14], АсАТ, АлАТ [13, 15], холестерола [13, 15] и церулоплазмина [16]. Состояние поджелудочной железы оценивали по уровню глюкозы в крови [14, 15]. Гематологические исследования включали определение количества эритроцитов, гемоглобина, цветного показателя, общего числа лейкоцитов и лейкоформулы. Влияние активного вещества и препарата на органы и ткани оценивали по окончании экспериментов путем макро- и микроскопического исследования основных внутренних органов (легких, печени, селезенки, почек) а также кожи, взятой из места его аппликации. Доклиническая оценка терапевтичесго действия 0,1% мази Изофурала проведены на экспериментальной модели гнойно-воспалительного процесса у крыс, вызванного S. aureus 209-P.
Результаты и их обсуждение
Доклинические испытания фармацевтически активной субстанции (изогидрафурала) показали, что ее бактерицидная активность в отношении представителей рода Staphylococcus (Wood-46, Smith, 209-P, S. saprophyticus) находится в пределах 2,33-9,35 мкг/мл, что в 2-4 раза ниже активной дозы прототипа - фурацилина (9,35-37,5 мкг/мл) (рис. 1). По сравнению с фурацилином изогидрафурал в 2 раза более активен в отношении E. coli (М-17) и в 32 раза - в отношении P. vulgaris. На E. faecalis изогидрафурал действует бактериостатически в дозе 4,67 мкг/мл, а в отношении K. pneumoniae и P. aeruginosa - на уровне фурацилина (300,0 мкг/мл).
166,7
Токсичность LD50 (мг/кг)
S.aureus 209 F
S.aureus (Wood 46) S.aureus(Cowan 1) S.epidermidis
S.saprophyticus
>2000,0
□
w1
5 10
Антибактериальная активность (мкг/мл)
в Изогидрафурал □ Фурацилин
15
РИС.
Активность и токсичность фармацевтически активного вещества, изогидрафурала, в сравнении с фурацилином.
Изогидрафурал относится к группе малотоксичных веществ. Пороговая токсическая доза (LD50) соединения составляет: для крыс при введении per os>2000 мг/кг (рис.), для мышей при интраперитониальном введении -1512,5±98,9 мг/кг. Введение вещества в течение 30 дней
(крысам - per os, кроликам - накожно) в максимальной терапевтической дозе (Q,7 мг/кг) и его передозировка в 2, 3, 4, Б раз не вызвали гибели животных, нарушений гематологических и биохимических показателей крови, а также деструктивных изменений внутренних органов и кожи в месте нанесения вещества.
Изогидрафурал не оказывает канцерогенного и эмбрио-токсического действия. Не вызывает раздражения кожи и слизистых оболочек [1, 2].
Разработанный на основе данного вещества новый антисептик Изофурал в виде Q,1% мази обладает свойствами, аналогичными фурацилину, однако превышает его активность в 5-2Q раз, являясь, в то же время, в 12 раз менее токсичным.
Препарат действует бактерицидно в отношении штаммов Staphylococcus aureus (Wood-Дб, Smith, 2Q9-P) в концентрации 3,9-7,8 мкг/мл активного вещества, что в 5-1Q раз ниже бактерицидной дозы прототипа - фурацилина. Бактерицидная активность Изофурала в отношении грам-отрицательных бактерий выше активности фурацилина: в 2 раза - в отношении K. pneumoniae, в 1Q раз - в отношении P. aeruginosa и в 2Q раз - в отношении P. vulgaris. На E. шіі препарат действует аналогично фурацилину, а в отношении E. faecalis - бактериостатически (таблица 1).
ТАБЛИЦА 1.
Антибактериальная активность Изофурала в сравнении с фурацилином (мкг/мл активного вещества)
Микроорганизмы
МПК* МБК** S. aureus E. faecalis ol c E. K. pneumoniae P. aeruginosa P. vulgaris
Wood Smith 2O9-P
Фурацилин МПК* МБК** 9,35 9,35 18,7 37,5 18,7 >300 >300 150
18,7 9,35 37,5 75 37,5 >300 >300 300
Изофурал МПК* МБК** 3,9 3,9 3,9 >125 62,5 125 31,25 15,6
3,9 3,9 3,9 >125 62,5 125 31,25 15,6
Примечания: МПК* - минимальная подавляющая концентрация, МБК** - минималная бактерицидная концентрация.
Тестирование 0,1% мази Изофурала в хроническом опыте показало, что многократное, в течение 30 и 90 дней, его применение в максимальной терапевтической дозе (0,7 мг/кг активного вещества), а также передозировка в 2 и 3 раза не влияет на общее состояние животных и не вызывает их гибели. Гематологические и биохимические показатели крови остаются на уровне контрольных групп (интактные животные и животные, получавшие 0,02% мазь фурацилина) (таблицы 2, 3). Препарат не оказывает деструктивного действия на внутренние органы и кожу в месте его нанесения и не влияет на фагоцитарную активность нейтрофилов крови [1, 2]. Мазь не вызывает раздражения кожи и слизистых в местах ее нанесения.
Доклинические испытания терапевтического действия препарата на экспериментальной модели гнойновоспалительного процесса у крыс показали, что 0,1% мазь Изофурала способноствует быстрому его устранению (3,6 дня в сравнении с 4,9 дня при применении фурацилина) и сокращает сроки формирования рубца (7,9 дня в сравнении с 10,8 дня при обработке фурацилином). В результате обработки раны мазью у 70% животных воспалительный процесс
РАЗДЕЛ IV
РАЗДЕЛ IV
IVK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
прекратился в течение 2-4 дней и у 80% животных корка отпала на 5-8-й день. При обработке раны фурацилином аналогичные показатели составили, соответственно, 30% и 50%. Препарат хорошо впитывается в кожу, обладает смягчающим свойством и ускоряет регенерацию тканей.
Заключение
1. Разработан новый антибактериальный препарат Изофурал в виде 0,1% мази, предназначенный для лечения и профилактики наружных гнойно-септических процессов.
2. Препарат в 12 раз менее токсичен и в 5-20 раз (в зависимости от вида микроорганизма) более активен по сравнению со структурным аналогом - фурацилином. Полностью подавляет рост и размножение грамположительных и грам-отрицательных микроорганизмов в кратчайшие сроки после контакта с ними и способствует быстрому устранению гнойно-воспалительного процесса.
3. Доклиническое тестирование препарата in vivo показало его высокую эффективность в лечении наружных гнойновоспалительных заболеваний, вызванных стафилококковой флорой, и способность ускорять процесс регенерации тканей.
ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Prisacari V., Burachiov S., Stoleicov S., Dizdari A.Izohidrafural - new antibacterial remedy /The study of toxicity, dermatoresorbtive, irritating featurs as well as the experimental therapeutical action. Scientific Annales of the University of Medicine and Pharmacy «N. Testemitanu». Medico-biological problems, pharmaceutical, public health and management. Vol. 1. Chisinau. 2003. Р. 243-247.
2. Prisacari V., Burachiov S., Dizdari A., Tapcov V. and al. New antibacterial and antifungal substances from local raw materiale. Academos. Jornal of Science, Innovation, Culture and Art. Chisinau. 2010. № 2 (17). P. 66-75.
3. Методы экспериментальной химиотерапии /под ред. Г.Н. Першина. Москва: Медицина, 1971.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Р.У. Хабриев (ред). М.: Медицина, 2005.
5. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Washington D.C., National Academy Press. 1996.
6. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств. Москва. МЗ Рос.Федерации, 1997.
7. Прозоровский И.Б. Использование метода наименьших квадратов для пробит - анализа кривых летальности. Фармакология и токсикология. 1962. № 1. С. 132-142.
8. Методические рекомемендации по исследованию канцерогенных свойств фармакологических и лекарственных средств. Москва. 1988.
9. Методические рекомендации по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию. Москва. 1986.
10. Методические рекомендации по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств. Москва. 1995.
11. Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.В. Иммунологические исследования в клинике. Киев. 1978. С. 21.
12. Биохимические методы исследования в клинике. /Под ред. А. Покровского. Москва. 1969.
13. Gudumac V., Baciu E., Marin V., Macari., Melnic D., Nastas I., Rivneac V., Rudic V. Metode de dozare a activitatii enzimatice. Elaborarea metodica. Chisinau. 2001. P. 4-5.
14. Chromy V., Voznicek. J., Fisher J. Glucose enzimatic. Biochemia Clinica. Bohemoslovaca. 1981. № 10. P. 123.
15. Alain C.C., Lucy S.Poon, Cicely G.Chan and al.. Enyimatic detetrmination of total serum cholesterol. Clin.Chem. 1974. № 20. P. 476.
16. Колб В.Г., Каменкова В.С. Справочник по клинической химии. Минск. 1982.
ТАБЛИЦА 2.
Показатели крови у крыс после 90-дневного накожного применения 0,1% мази Изофурала
Исследованные группы животных Условные обозначения Кол-во эритроцитов (х 1012) Гемоглобин (g/l) Цветной показатель Кол-во лейкоцитов (х 109) Лейкоформула (%)
Сегментоядерные Палочкоядерные Эозинофилы Базофилы Лимфоциты Моноциты
Контрольинтактная группа 1 7,35+0,73 159,0+4,7 0,68+0,04 5,8+1,5 20,0+2,4 3,O+O,5 3,0+0,5 1,0+0,2 69,0+0,2 4,0+0,7
Контроль - 0,02% мазь фурацилина 2 6,3+0,56 182,7+4,6 0,87+0,02 9,4+0,25 23,0+1,6 5,0+0,8 4,0+0,9 1,0+0,3 60,0+1,8 7,0+1,0
0,1% мазь Изофурала 3 5,7+0,39 172,7+3,8 0,91+0,05 6,5+0,47 25,0+4,6 4,0+0,8 6,0+1,5 0,3+0,1 59,0+ 3,2 5,7+0,6
P1,2>0,05 P1,2<0,01 P1,2<0,001 P1,2<0,05 P1,2>0,05 P1,2<0,05 P1,2>0,05 P1,2>0,05 P1,2<0,001 P1,2<0,05
P1,3<0,05 P1,3<0,05 P1,3<0,001 P1,3>0,05 P1,3>0,05 P1,3>0,05 P1,3>0,05 P1,3<0,01 P1,3<0,001 P1,3>0,05
Р 2,3>0,05 Р2,3>0,05 Р2,3>0,05 Р2,3<0,01 Р2,3>0,05 Р2,3>0,05 Р2,3>0,05 Р2,3<0,05 Р2,3>0,05 Р2,3>0,05
ТАБЛИЦА 3.
Биохимические показатели крови у крыс после 90-дневного накожного применения 0,1% мази Изофурала
Исследованные группы животных Условные обозначения АсАТ ммоль/час/л АлАТ ммоль/час/л Общие протеины г/л b-липопротеины усл. ед. Холестерол ммоль/л Церулоплазмин ммоль/л Глюкоза мг/л
Контрольинтактная группа 1 1,13+0,07 0,63+0,2 62,4+3,7 32,14+3,2 2,52+0,2 536,11+30,8 5,66+0,4
Контроль - 0,02% мазь фурацилина 2 0,82+0,14 0,67+0,13 61,95+4,7 33,8+1,97 1,62+0,12 415,76+27,46 5,46+0,23
0,1% мазь Изофурала 3 0,85+0,11 0,54+0,07 65,6+2,12 32,47+3,04 1,7+0,08 381,8+26,26 5,7+1,23
P1,2<0,05 P1,2>0,05 P1,2 >0,05 P1,2>0,05 P1,2<0,001 P1,2<0,05 P1,2>0,05
P1,3<0,01 P1,3>0,05 P1,3>0,05 P1,3>0,05 P1,3<0,001 P1,3<0,05 P1,3>0,05
Р2,3>0,05 Р2,3>0,05 Р2,3>0,05 Р2,3>0,05 Р2,3>0,05 Р2,3>0,05 Р2,3>0,05
