CC BY
92
Торф и продукты его переработки
УДК: 615.32:615.5.001.2
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЭТАНОЛЬНОГО ЭКСТРАКТА ИЗ СФАГНУМА БУРОГО (SPHAGNUM FUSCUM (SHIMP) KLINGGR)
© М.В. Белоусов1, Р.Р. Ахмеджанов2, В.Н. Дмитрук3, М. С. Юсубов1, Л.Г. Бабешина1, С.Е. Дмитрук1
1 Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт, 2, Томск, 634050, (Россия) E-mail: yusubov@mail.ru
2Томский политехнический университет, пр. Ленина, 30, Томск, 634050 (Россия)
3Самарский государственный медицинский университет, ул. Чапаевская, 89, Самара, 443099 (Россия)
Целью исследования являлось экспериментальное изучение фармакологической активности 20% водно-этанольного экстракта из S. fuscum (Shimp) Klinggr флоры Западной Сибири. На лабораторных животных исследована острая токсичность экстракта из S. fuscum и изучено его влияние на процессы, сопутствующие протеканию раневых патологий. Установлено, что исследуемый экстракт является малотоксичным и соответствует IV классу опасности «Вещества малоопасные». Экспериментальные исследования показали, что он обладает выраженным антиэкссудативным, болеутоляющим, ранозаживляющим, антибактериальным и избирательным антифунгальным действием. Фармакологические свойства экстракта из
S. fuscum превосходят или сравнимы с аналогичными эффектами фармакопейных препаратов сравнения.
Сочетание фармакологических свойств данного экстракта делает его перспективным для разработки средства комплексной терапии раневых и воспалительных процессов, ожоговых поражений кожи и инфицированных ран.
Ключевые слова: экстракт из сфагнума, сфагнум фускум, сфагнум бурый, острая токсичность, биологическая активность. Введение
Согласно данным литературы и сведениям народной медицины сфагновые мхи издавна использовались в качестве эффективного наружного средства для лечения раневых патологий, в особенности для заживления гнойных ран [1-3]. Известно, что раневая патология является сложным, многофакторным процессом, который протекает в условиях острой воспалительной реакции, выраженных болевых ощущений и, как правило, на фоне бактериальных или грибковых инфекций [3].
Руководствуясь вышесказанным, мы провели оценку острой токсичности 20% водно-этанольного экстракта из S. fuscum (Shimp) Klinggr (далее по тексту «экстракта») флоры Западной Сибири и исследовали его влияние на процессы, сопутствующие протеканию раневых патологий.
Экспериментальная часть
Сырьем для получения экстракта служили дерновины Sphagnum fuscum (Shimp) Klinggr, собранные в экспедиционных условиях на территории Томской области в 2005-2006 гг.
20% водно-этанольный экстракт получали, используя технологические приемы в соответствии с требованиями ГФ XI.
Исследования биологической активности проведены на 400 белых беспородных мышах-самцах массой 18-22 г и 100 белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г, полученных из питомника «Рассвет» НПО «Вирион» (Томск). Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с правилами гу-
* Автор, с которым следует вести переписку.
манного обращения с животными, регламентированными ФЗ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г. и положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных.
Острую токсичность, противовоспалительную и анальгезирующую активности, ранозаживляющие свойства исследуемого экстракта исследовали согласно Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005 г.) [4].
Антигрибковую активность исследовали in vitro методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде Сабуро [5]. В качестве тест-микроорганизмов использовали Trichophyton rubrum, Trychophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Aspergillus niger и Candida albicans. Оценку антигрибковых свойств экстракта проводили в сравнении с фармакопейными препаратами - нитрофунгином и сангвиритрином и индивидуальными веществами фенольной природы, обладающими фунгистатическими свойствами.
Антибактериальную активность экстракта исследовали методом серийных разведений на мясопептонном бульоне [5], в сравнении с извлечениями из фармакопейного сырья шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного, используемых в качестве антимикробных средств.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятыми методами с определением средней арифметической (М) и ошибки средней арифметической (m). Достоверность результатов оценивали параметрически по t-критерию Стьюдента. Кроме того, использовали пакет статистических программ «Statistica for Windows 7.0».
Обсуждение результатов
Однократное внутрижелудочное введение белым беспородным мышам-самцам экстракта в дозе 10000 мг/кг не вызывает гибели мышей и изменения их двигательной активности и поведенческих реакций в течение двух недель наблюдения. Таким образом, согласно существующей классификации (ГОСТ 12.1.00776), он соответствует IV классу опасности «Вещества малоопасные».
Существенными составляющими фармакологической активности ранозаживляющих средств является наличие у них противовоотечного и анальгезирующего действия, так как воспалительный отек и боль являются неотъемлимыми компонентами раневой патологии [6-10]. Это побудило нас оценить антиэкссудатив-ные и болеутоляющие свойства экстракта.
При субплантарном введении раствора агара наблюдалось интенсивное формирование воспалительного отека задней конечности у мышей. В данных условиях эксперимента предварительное 5-кратное внутрижелудочное (один раз в сутки) введение экстракта в диапазоне доз 100-500 мг/кг приводило к достоверному ослаблению формирования воспалительного отека лапы мышей (табл. 1).
При этом наиболее выраженный антиэкссудативный эффект экстракта отмечался для доз 250 и 500 мг/кг -угнетение отека составило 30,1 и 31,1% соответственно. Предварительное введение мышам препарата сравнения - индометацина (10 мг/кг) вызывало более эффективное торможение развития отека - 47,2% (табл. 1).
Известно, что анальгетическое действие флоголитиков состоит из периферического и центрального эффектов. К периферическим компонентам, участвующим в обезболивании, относится противоотечное действие [6-10]. Ослабление экссудации под влиянием исследуемого экстракта позволило предположить болеутоляющие свойства исследуемого экстракта на модели уксусных корчей у мышей.
Таблица 1. Влияние предварительного введения экстракта из (50-500 мг/кг) и индометацина (10 мг/кг) на формирование агарового отека конечностей у белых беспородных мышей-самцов
Группа наблюдения, доза (мг/кг) Средний прирост массы конечности в группе (M±m), мг Угнетение отека на пике воспаления, %
Контроль (п=20) 118,20±11,62 -
Индометацин, 10 (п=20) 62,40±5,46* 47,2
20% водно-этанольный экстракт, 50 (п=20) 109,2±9,8 9,2
20% водно-этанольный экстракт, 100 (п=20) 95,6±9,24* 19,1
20% водно-этанольный экстракт, 250 (п=20) 82,6±8,82* 30,1
20% водно-этанольный экстракт, 500 (п=20) 81,4±7,64* 31,1
* Различия с контролем достоверны (р<0,05).
Судя по полученным экспериментальным данным (табл. 2), экстракт обладает и выраженным болеутоляющим действием. Предварительное 5-кратное внутрижелудочное введение (один раз в сутки) данного экстракта в диапазоне доз 250-500 мг/кг приводит к достоверному, практически не уступающему аналогичному действию индометацина по снижению среднего количества корчей - на 36,9 и 42,9% соответственно (табл. 2).
Исследование ранозаживляющей активности экстракта проводили на моделях «асептически резаной раны» и «ампутации хвоста» у крыс. В качестве препаратов сравнения использовали фармакопейные ранозаживляющие средства: 10%-ную метилурациловую мазь и облепиховое масло (ООО «Биолит», Томск). О ранозаживляющей активности исследуемых препаратов судили по срокам полного заживления раны и морфологическим показателям состояния тканей в области резаной раны. Результаты исследований представлены в таблицах 3 и 4.
У контрольной группы животных, получавших обработку мазевой основой: ПЭГ 400 - ПЭГ 1500 (1 : 4), после нанесения «асептической раны» в области спины методом удаления кожно-фасциального лоскута диаметром 20 мм, заживление дефекта кожи происходило в сроки 18,60±1,40 дня (табл. 3).
В течение первых 5-7 дней наблюдалась гнойно-воспалительная реакция мягких тканей, окружающих раневой дефект, сопровождающаяся обильной экссудацией и образованием гнойно-некротической корочки. При удалении последней на 7-й день отмечено отхождение обильного гнойного отделяемого скопившегося между грануляционной тканью дна раны и удаляемой корочкой. Отмечена мацерация кожи, окружающей рану.
Морфологическая картина, свидетельствующая о выраженности воспалительного процесса у животных контрольной группы, подтверждалась гистологическим исследованием. Микроскопия препаратов участка раневого дефекта показала наличие гнойно-некротической корочки и поверхностной гематомы. Хорошо определялся эпидермис, с сохраненной дифференцировкой слоев, но на поверхности имелся некротический детрит с выраженной лейкоцитарной инфильтрацией с наличием гнойных телец, между гнойно-некротической корочкой и поверхностью раневого дефекта определялся разрушающийся эритроцитарный тромб.
При обработке раны 3% мазью экстракта полная эпителизация дефекта отмечается в сроки 12,20±1,4 дня. Ускорение заживления раны по отношению к контрольной группе составило 34,4% (табл. 3). Обработка раны мазью данного экстракта способствовала ликвидации гнойно-экссудативной воспалительной реакции, о чем свидетельствовало отсутствие скопление гноя под удаляемой корочкой на 7-е сутки после нанесения раны.
Таблица 2. Влияние предварительного введения 20% водно-этанольного экстракта из S. fuscum (50-500 мг/кг) и индометацина (10 мг/кг) на болевую чувствительность белых беспородных мышей-самцов на модели «уксусных корчей»
Группа наблюдения, доза, мг/кг Количество корчей за 20 мин (М±т) Угнетение болевой чувствительности,%
Контроль (п=20) 50,4±4,84 -
Индометацин, 10 (п=20) 22,6±2,44* 55,2
20% водно-этанольный экстракт, 50, 52,8±4,50
(п=20)
20% водно-этанольный экстракт, 100, 44,2±3,46 12,4
(п=20)
20% водно-этанольный экстракт, 250, (п=20) 31,8±2,64* 36,9
20% водно-этанольный экстракт, 500, (п=20) 28,8±2,58* 42,9
“Различия с контролем достоверны (р<0,05).
Таблица 3. Влияние аппликаций 3% мази 20% водно-этанольного экстракта из & исит, 10% метилураци-ловой мази и масла облепихи на сроки заживления «асептически резаной раны» у крыс
Группа наблюдения Сроки заживления раны (дни, М±т) Ускорение заживления раны по отношению к контрольной группе**, %
Мазевая основа (п=10) 18,60±1,40 -
10% метилурациловая мазь (п=10) 13,40±1,20* 28,0
Масло облепихи (п=10) 15,60±1,60* 16,2
3% мазь 20% водно-этанольного экс- 12,20±1,40* 34,4
тракта из Б. /теиш (п=10)
*Различия с контролем достоверны (р<0,05); **за контрольную группу принимали животных, обработанных мазевой основой.
Таблица 4. Влияние аппликаций 3% мази 20% водно-этанольного экстракта из & исит, 10% метилураци-ловой мази и масла облепихи на сроки заживления «ампутационной культи хвоста» у крыс
Группа наблюдения Сроки заживления раны (дни, M±m) Ускорение заживления раны по отношению к контрольной группе**, %
Мазевая основа** 19,20±1,40 -
10% метилурациловая мазь 15,40±1,20* 19,80
Масло облепихи 17,20±1,40 10,40
3% мазь 20% водно-этанольного экстракта из Б. /изеит 14,80±1,20* 22,90
*Различия с контролем достоверны (р<0,05); **за контрольную группу принимали животных, обработанных мазевой
основой.
При микроскопии препаратов поверхности раневого дефекта наблюдался эпидермис с наличием акантотических тяжей, грануляционная ткань с переходом в созревающую, в сосочковом слое дермы очаговый гиперкератоз в различных фазах созревания. По поверхности определялись роговые чешуйки в состоянии очагового слущивания.
Необходимо отметить, что 10% метилурациловая мазь и масло облепихи в аналогичных условиях эксперимента оказали менее выраженные ранозаживляющие эффекты - полная эпителизация раны наблюдается в сроки 13,40±1,20 и 15,60±1,60 дня соответственно (табл. 3). Кроме того, в группе животных, получавших аппликации масла облепихи, так же как и в контрольной группе, в течение первых 5-7 дней наблюдалась гнойно-воспалительная реакция мягких тканей, окружающих раневой дефект, сопровождающаяся обильной экссудацией и образованием гнойно-некротической корочки.
Аналогичная картина наблюдается на модели «ампутации хвоста» у крыс - аппликации 3% мази экстракта и 10% метилурациловой мази проявляют сравнимое между собой ранозаживляющее действие, ускоряя процесс заживления ампутационной культи (по сравнению с контрольной группой) на 22,9 и 19,8% соответственно (табл. 4).
В данных условиях эксперимента не наблюдалось достоверного влияния масла облепихи на процессы заживления культи. Таким образом, в данных условиях эксперимента 3% мазь экстракта обладает выраженным ранозаживляющим действием, сравнимым с аналогичным эффектом 10% метилурациловой мази и значительно превосходящим репаративные эффекты масла облепихи.
Рациональная терапия раневых поражений включает в себя обязательную антимикробную (антибактериальную и противогрибковую) составляющую [11-13]. Известно, что перспективными в этом плане группами БАВ являются эфирные масла, фенольные соединения (особенно фенолокислоты) и полисахаридный комплекс (ПСК) [5, 14, 15]. Наши исследования показали, что в растениях S. fuscum присутствуют фенолокисло-ты, кумарины и ПСК, что позволило предположить у них наличие антифунгальных и антимикробных свойств. Поэтому мы провели исследование антибактериальной и противогрибковой активности экстракта.
В перспективных концентрациях (31,7-62,5 мкг/мл) экстракт действует только на возбудителей дерма-тофитий. При этом более высокую чувствительность к исследуемым препаратам проявляют тест-грибы Trichophyton rubrum и Microsporum canis (табл. 5).
По данным эксперимента, экстракт проявляет выраженные бактериостатический и бактерицидный эффекты (табл. 6). В разведении 1/80 он ингибирует размножение микроорганизмов штаммов Escherichia coli Н-304, Staphylococcus aureus Р-209 и Klebsiella pneumoniae, слабо влияя на штамм Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 (б/ст - 1/20). Бактерицидное действие проявляется в более высоких концентрациях: 1/40-1/20, за исключением влияния на Staphylococcus aureus Р-209 (б/ц - 1/80).
Таким образом, сырье S. fuscum является перспективным объектом для разработки на его основе новых фитопрепаратов. 20% водно-этанольный экстракт, обладая низкой токсичностью, оказывает многогранное воздействие на организм.
На наш взгляд, сочетание противовоспалительной и анальгезирующей активности, ранозаживляющих свойств, антибактериального и антифунгального действий данного экстракта рационально в комплексной терапии раневых и воспалительных процессов, ожоговых поражений кожи, инфицированных ран.
Таблица 5. Противогрибковая активность 20% водно-этанольного экстракта из S. fuscum, мкг/мл
Источник выделения Исследуемый препарат Тест-грибы
Trichoplyton rubrum Trichplyton mentagrophytes Microsporum canis Aspergillus niger Candida albicans
S. fuscum Водно-этанольный 20% экстракт (мацерация, 70 °С) Водно-этанольный 40% экстракт (перколяция) Водный экстракт (мацерация, 95%) Водный экстракт (УЗ-экстракция с ИК-сушкой) 15.7 7,9 31.7 125 15.7 15.7 62,5 125 15.7 15.7 62.5 62.5 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Индивидуальные вещества Кофейная кислота Кумарин 62,5 125 250 62,5 31,7 62,5 1000 1000 1000 1000
Препараты сравнения Нитрофунгин Сангвиритрин 7,9 15,7 31.7 15.7 15.7 15.7 7,8 15,7 31.7 15.7
Таблица 6. Антимикробная активность 20% водно-этанольного экстракта S. fuscum
Исследуемые препараты Действие Штамм микроорганизмов (посевная доза и 100000 микробных тел)
Escherichia coli Н-304 Staphylococcus aureus Р-209 Pseudomonas Aeruginosa АТСС 9027 Klebsiella pneumoniae
20% водно-этанольный экстракт б/ст* 1/80 1/80 1/80 1/20
из S. fuscum б/ц** 1/40 1/80 1/40 1/20
Водное извлечение из шалфея б/ст 1/40 1/80 1/40 1/80
лекарственного б/ц 1/40 1/80 1/40 1/80
Водное извлечение из зверобоя б/ст 1/80 1/80 1/40 1/40
продырявленного б/ц 1/40 1/40 1/20 1/20
*бактериостатическое действие; “бактерицидное действие.
Выводы
1. Экстракт из S. fuscum является малотоксичным и согласно ГОСТ 12.1.007-76 соответствует IV классу опасности «Вещества малоопасные».
2. При предварительном введении экстракт проявляет выраженный антиэкссудативный и болеутоляющий эффекты, сравнимые с действием препарата сравнения - индометацина.
3. В данных условиях эксперимента 3% мазь 20% водно-этанольного экстракта S. fuscum обладает выраженным ранозаживляющим действием, сравнимым с аналогичным эффектом 10% метилурациловой мази и значительно превосходящим репаративные эффекты масла облепихи.
4. В перспективных концентрациях (31,7-62,5 мкг/мл) экстракт из S. Fuscum проявляет избирательную активность, действуя только на возбудителей дерматофитий. При этом более высокую чувствительность к исследуемым препаратам проявляют Trichophyton rubrum и Microsporum canis.
5. В условиях in vitro в диапазоне концентраций 1/20-1/80 экстракт проявляет выраженное антибактериальное (бактериостатическое и бактерицидное) действие в отношении штаммов Escherichia coli Н-304, Staphylococcus aureus Р-209, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, превосходящее или сравнимое с аналогичным действием растительных фармакопейных антибактериальных средств.
Список литературы
1. Городкова А.А. О влиянии сфагна на аэробную флору гнойных ран: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Л., 1949. 9 с.
2. Савич-Любицкая С.И. Применение сфагнового (торфяного) мха в медицине // Природа. 1943. №4. С. 41-50.
3. Военно-полевая хирургия: учебник / под. ред. проф. Е.К. Гуманенко. СПб, 2004. 464 с.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. Р.У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. М., 2005. 832 с.
5. Вичканова С.А., Рубинчик М.А. Методика изыскания антимикробных препаратов из высших растений // Фитонциды, их биологическая роль и значение для медицины и народного хозяйства. Киев, 1974. С. 138-141.
6. Варфоломеев С. Д., Мевх А.Т. Простагландины - молекулярные биорегуляторы. М., 1985. 156 с.
7. Arrigoni-Martelli E., Drugs which inhibit prostaglandin biosyntesis // Bull. Chim. Pharmacy. 1968. V. 107. №1. P. 29-42.
8. Keuhl F.T., Humes I.L., Egan R.W., Ham E.A., Beweridge G.C., Van Arman C.G. Role of prostaglandin endoperoxide PGE2 in inflammatory processes // Nature. 1977. №265. P. 170-173.
9. Mediators of acute and chronic inflammation. Proceedings of syntax symposium. M., 1983. 42 c.
10. Trang L.E., Granstrom E., Lovguero M. Levels of prostaglandin F2 and E2- fnd tromboxan B2 in rheumatoid arthritis
// Scand. J. Rheum. 1977. №6. P. 151.
11. Русланов Д.В. Комплексное лечение больных с микозами стоп и кистей: дис. ... канд. мед. наук. 1983. 156 с.
12. Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г. Дисбактериозы. Л., 1979. 176 с.
13. Кашкин П.Н. и др. Антибиотики. Л., 1970. 165 с.
14. Дмитрук С.Е. Антифунгальные свойства биологически активных веществ некоторых представителей флоры Сибири: автореф. дис. ... д-ра фарм. наук. Харьков, 1991. 45 с.
15. Белоусов М.В., Дмитрук С.Е., Белоусова Н.И. Антифунгальная активность сибирско-дальневосточных видов семейства вересковые // Фитонциды. Бактериальные болезни растений: материалы конф. Киев; Львов, 1990. Ч. 1. С. 17.
Поступило в редакцию 6 декабря 2007 г.
