CC BY
553
ОБМЕН ОПЫТОМ
В.М. Козлова1, Т.П. Казубская1, И.Н. Соколова1, Е.А. Алексеева2, О.В. Бабенко2,
Е.А. Близнец2, Т.Л. Ушакова1, С.Н. Михайлова1, Л.Н. Любченко1, В.Г. Поляков1,3
1 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, Москва, Российская Федерация 2 Медико-генетический научный центр, Москва, Российская Федерация 3 Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава России, Москва,
Российская Федерация
30
Ретинобластома: диагностика и генетическое консультирование
В представленной работе обсуждаются результаты использования клинико-генетических и молекулярных методов в собственных многолетних исследованиях больных ретинобластомой и данные литературы. Показано, что включение современных методов молекулярно-генетического анализа в комплексное обследование пациентов расширяет возможности ранней диагностики, своевременного лечения и профилактики ретинобластомы. Идентификация мутаций гена RB1 крайне важна для эффективного генетического консультирования. Успехи в лечении ретинобластомы позволяют сохранить жизнь более 90% пациентов, однако качество их жизни строго зависит от ранней диагностики опухоли.
Ключевые слова: ретинобластома, ген RB1, молекулярная диагностика, генетическое консультирование.
(Для цитирования: Козлова В.М., Казубская Т.П., Соколова И.Н., Алексеева Е.А., Бабенко О.В., Близнец Е.А., Ушакова Т.Л., Михайлова С.Н., Любченко Л.Н., Поляков В.Г. Ретинобластома: диагностика и генетическое консультирование. Онкопедиатрия. 2015; 2 (1): 30 - 38).
ВВЕДЕНИЕ
Ретинобластома (РБ) — злокачественная опухоль сетчатки глаза, развивается из недифференцированных эмбриональныхтканей нейроэктодермы. Частота РБ 1:15 000-30 000 новорожденных. Манифестирует в большинстве случаев до 4 лет жизни [1]. Клиническими признаками РБ являются косоглазие, лейкокория («кошачий глаз»), изменение цвета радужки. Диагноз обычно устанавливается при осмотре глазного дна с максимально расширенным зрачком. Опухоль довольно быстро прорастает в ткани глаза, распространяется по
его орбите, зрительному нерву, метастазирует в центральную нервную систему и отдаленные органы. Ранняя диагностика и своевременное лечение ретинобластомы у детей обусловливают характер ее развития и течения.
Наследственные формы РБ встречаются у 40% больных, среди них большую часть составляют мутации de novo; частота семейных случаев при этой опухоли, по данным литературы, довольно высока — 10-12% [2-4]. Тип наследования носит аутосом-но-доминантный характер. Пенетрантность РБ (вероятность возникновения опухоли у носителей
V.M. Kozlova1, T.P. Kazubskaya1, I.N. Sokolova1, E.A. Alekseeva2, O.V. Babenko2,
E.A. Bliznetz2, T.L. Ushakova1, S.N. Mikhaylova1, L.N. Lubchenko1, V.G. Polyakov1,3
1 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow, Russian Federation 2 Research Centre for Medical Genetics, Moscow, Russian Federation 3 Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Moscow, Russian Federation
Retinoblastoma: Diagnostics and Genetic Counseling
In the present paper we discuss the results of the use of clinical, genetic and molecular techniques in their extensive studies of patients with retinoblastoma and literature data. It is shown, that the inclusion of a comprehensive survey of patients modern methods of molecular analysis enhances early diagnosis, early treatment and prevention of retinoblastoma. Identification of mutations RB1 is very important for the effectiveness of genetic counseling.
Key words: Retinoblastoma, gene RB1, molecular diagnostics, genetic counseling.
(For citation: Kozlova V.M., Kazubskaya T.P., Sokolova I.N., Alekseeva E.A., Babenko O.V., Bliznetz E.A., Ushakova T.L., Mikhaylova S.N., Lubchenko L.N., Polyakov V.G. Retinoblastoma: Diagnostics and Genetic Counseling. Onkopediatria. 2015; 2 (1): 30 - 38).
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2015 / том 2 / № 1
наследственной мутации) составляет 90%. Однако в некоторых семьях пенетрантность может быть неполной и достигать 50% [5].
Этиология
Этиология наследственных и большинства ненаследственных форм РБ обусловлена мутацией онкосупрессорного гена RB1, локализованного на длинном плече хромосомы 13 (13q14.2). Ген RB1, который был клонирован в 1986 г., — первый из класса онкосупрессорных генов, состоит из 27 экзонов и занимает 200 kb геномной ДНК, кодирует ядерный фосфопротеин (pRb) и играет важную роль в регуляции клеточного цикла. Белок рRb в активном гипофосфорилированном состоянии способен связывать фактор инициации транскрипции E2F — регулятор транскрипции большого числа ответственных за пролиферацию клеточных генов [6-8].
Ретинобластома — первая опухоль, ставшая «прототипом» теперь уже классической «двухступенчатой модели» канцерогенеза наследственного рака (разработана А. Knudson в 1971 г.). Согласно этой модели, для развития ретинобластомы необходимо повреждение (мутация) обоих аллелей гена RB1, предрасполагающего к РБ (1 локус — 2 удара) [3].
При наследственной РБ мутация одного аллеля гена RB1 происходит еще в половой клетке одного из родителей. Она может быть унаследованной или возникнуть de novo, тогда каждая клетка будущего ребенка будет нести мутацию гена RB1 в гетерозиготном состоянии (герминальная мутация). Мутация второго аллеля гена происходит в одной или нескольких клетках сетчатки глаза. Таким образом, повреждение обоих аллелей гена приводит к потере функции онкосупрессорного гена RB1, что ведет к утрате контроля перехода клетки из G1 в S-фазу и к активации протоонкогенов. Следствием этого суммарного эффекта является неконтролируемое размножение клеток, накопление мутаций, злокачественная трансформация и опухолевая прогрессия [6, 9]. Таким образом, манифестация РБ в наследственных случаях возникает в более раннем возрасте и носит билатеральный и мультифокальный характер.
При ненаследственной РБ мутации обоих аллелей гена происходят в клетках сетчатки глаза и обнаруживаются только в клетках опухолевой ткани (соматическая мутация). Клинически опухоль носит односторонний, монофокусный характер поражения. Такая опухоль не наследуется и составляет 60% всех случаев ретинобластомы [3]. Согласно данным литературы, дисфункция гена RB1 выявляется не только в клетках ретинобластомы, но и в опухолевых клетках при остеосаркоме, мягкотканных саркомах, раке легкого и ассоциируется с прогрессией многих других опухолей, где мутации в гене RB1 обнаруживаются только в соматических клетках [10].
Виды мутаций
К инактивации гена RB1 приводят следующие виды мутаций:
• хромосомные, затрагивающие район локализации гена RB1 на длинном плече хромосомы 13q14.2 (интерстициальные, терминальные делеции);
• генные, изменяющие структуру ДНК гена RB1;
• эпигенетические, приводящие к нарушению функции гена при сохранной структуре (вследствие нарушения метилирования, изменения экспрессии микроРНК).
Вышеуказанные мутации в редких случаях могут носить мозаичный характер, происходят на ранних этапах постзиготических рекомбинаций в развитии эмбриона, которые требуют дополнительных высокоразрешающих методик для их диагностики. Согласно литературным данным, мозаичные мутации гена RB1 встречаются с частотой 5,5 и 3,8% при билатеральной и монолатеральной РБ, соответственно [2, 11].
Исследования последних лет показали связь ненаследственных монолатеральных ретинобла-стом с мутациями в других генах, в частности с амплификацией гена MYCN при нормальной функции гена RB1 [12, 13].
Цель исследования: раскрыть современные возможности распознавания наследственной ретинобластомы, а также ее дифференциальной диагностики на практическом примере медикогенетического консультирования детей, наблюдаемых в НИИ детской онкологии ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» в период с 1994 по 2013 г.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
В работе были проанализированы результаты обследования 393 пациентов с ретинобластомой из 351 семьи.
В случае энуклеации глаза опухоль была изучена и гистологически верифицирована на операционном материале в патологоанатомическом отделении РОНЦ им. Н.Н. Блохина, классифицирована по международной системе стадий злокачественных новообразований (Tumor, Nodus, Metastasis; TNM) согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версии 1998, 2002, 2010 гг.).
В работе использованы клинико-генеалогический, цитогенетический и молекулярно-генетический методы изучения.
Цитогенетическое исследование проведено 158 пациентам с РБ. Для анализа кариотипа применялся высокоразрешающий бэндинг хромосом: дифференциальный метод G-окраски метафазных хромосом фитогемагглютининстимулированных лимфоцитов периферической крови.
Молекулярно-генетическое исследование проведено 75 больным и 137 их родственникам. Для исследования структуры ДНК гена RB1 до 2002 г. применялись методы полимеразной цепной реакции (ПЦР), анализ гетеродуплексов, анализ одно-
31
ОБМЕН ОПЫТОМ
32
цепочечного конформационного полиморфизма (Single-strand conformation polymorphism, SSCP), с 2003 г. — прямое секвенирование всей кодирующей последовательности гена RB1 (1-27-й экзон), микросателлитный анализ с использованием внутригенных маркеров [RB2int (D13S153), RB4int, RB20int] и маркеров, фланкирующих ген (D13S168, D13S164, D13S165, D13S1307). Материалом для исследования стала ДНК, выделенная из клеток парафинированной ткани опухоли (в случае энуклеации глаза) и из лейкоцитов периферической крови ребенка и его родителей. Если опухоль была доступна для исследования, то на первом этапе анализировалась ДНК именно ее клеток, затем найденные мутации подтверждались в лейкоцитах периферической крови.
Для диагностики синдрома Блоха-Сульцбергера использовались методы количественной мультиплексной лигазной пробазависи-мой амплификации (Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) с целью изучения частой мутации гена NEMO и анализ аллельного метилирования области CAG повтора первого экзона гена AR с целью определения неслучайной инактивации (лайонизации) хромосомы Х. Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови ребенка и матери.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Диагностика
Выявление наследственно детерминированных форм опухоли основывается на комплексном анализе клинико-генеалогических, синдромологических, цитогенетических, молекулярно-генетических данных. Клинико-генеалогическое обследование 393 пациентов с ретинобластомой позволило установить, что заболевание родственников в таких семьях встречается в 8,6% случаев (30 семей — 72 больных). Среди всех анализируемых больных у 134 (38%) наблюдалось билатеральное поражение глаз, из них в 13% случаев (17 семей) были указания на семейную отяго-щенность ретинобластомой, тогда как у больных с односторонней РБ аналогичные указания наблюдались в 6% (13 семей). Клиническая манифестация двусторонней РБ до 1 года выявлена в 73% случаев, односторонней РБ — в 42%.
Фенотипы больных с ретинобластомой
При изучении фенотипа больных детей с РБ выявлены изолированные врожденные пороки развития (ВПР) в 17 случаях: врожденный порок сердца (у 6), пороки почек (у 3), врожденный двусторонний вывих тазобедренных суставов (у 3), открытая spina bifida (у 1), гипоспадия (у 2), врожденная расщелина губы и твердого неба (у 1), врожденная косолапость (у 1). В структуре ВПР преобладал врожденный порок сердца — дефект межжелудочковой перегородки. Частота ВПР составила 4,8%, что несколько превышает общепопуля-
ционную (3%). Частота ВПР среди больных с монолатеральной РБ — 4,6%, с билатеральной РБ — 3,2%. Более высокую частоту ВПР при монолатеральной РБ можно объяснить тем, что в ее развитии играет роль сочетание тератогенных и мутагенных факторов, а в этиологии билатеральных РБ — мутационное событие [14].
Кроме того, у детей с ретинобластомой помимо изолированных ВПР наблюдались другие наследственные заболевания. Так, у 8/393 больных детей ретинобластома проявилась на фоне наследственных заболеваний,таких как ихтиоз, синдром Элерса-Данло — унаследованных от отцов; алопеция, нистагм с дистопией зрачка — унаследованных от матерей. По одному случаю также были диагностированы трихоринофалангеальный синдром 1-го типа, синдром Рассела-Сильвера, синдром Мебиуса (врожденное недоразвитие ядер двигательных черепных нервов), синдром микроцефалии со спастической диплегией и отсутствием брюшных и кремастерных рефлексов. Большинство заболеваний были унаследованы от одного из родителей, и ретинобластома явилась случайным событием.
Во всех случаях ретинобластома носила монолатеральный характер, у одного пациента с синдромом Рассела-Сильвера в возрасте 1 года диагностирована билатеральная ретинобластома. Синдром Рассела-Сильвера относится к генетическим синдромам с повышенным риском развития разных эмбриональных (гепатобластома, нефробластома) опухолей. Этиология синдрома генетически гете-рогенна, связана с эпигенетическими мутациями — гипометилированием ДНК-центра импринтинга хромосомы 11р15 с вовлечением генов IGF2, H19 или материнской дисомией хромосомы 7, и их взаимосвязь с ретинобластомой неясна [15]. К сожалению, анализ ДНК гена RB1 пациенту с синдромом Рассела-Сильвера не проводился.
Интересным является и тот факт, что у детей при некоторых наследственных синдромах выявляемые изменения в сетчатке глаза клинически могут симулировать ретинобластому.
Клинико-генеалогический анализ у пациентов, направленных в НИИ ДОГ с подозрением на ретинобластому, выявил наследственные синдромы, ассоциированные с псевдоопухолями сетчатки глаза, симулирующими ретинобластому. Все случаи подтверждены молекулярно-генетическими методами исследования.
Синдром Норри — врожденная псевдоглиома сетчатки. Также выявляются гиперплазия пигментного эпителия радужки, облитерация передней камеры глаза. Нередко наблюдаются задержка психомоторного развития, судорожный синдром. Тип наследования — Х-сцепленный рецессивный. У одного из пациентов обнаружена мутация ^640G, p.S75C в экзоне 3 гена NDP, подтверждающая данный синдром.
При синдроме Бурневилля-Прингла (туберозный склероз; тип наследования — аутосомно-
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2015 / том 2 / № 1
доминантный) на глазном дне обнаруживаются множественные гамартомы (туберы). У одного из пациентов гамартома располагалась на диске зрительного нерва в виде «тутовой ягоды». У ребенка отмечались судороги с 3 мес, депигментированные пятна и единичные пятна цвета кофе с молоком. При анализе ДНК выявлена мутация с.2688_2897 del в гене TSC2, ассоциированная с данным синдромом.
В фенотипе синдрома Блоха-Сульцбергера (синдром недержания пигмента) чаще встречается поражение глаз в виде ретролентальной фибродисплазии или псевдоглиомы.
Клинический случай 1
Девочка, возраст 1 год 7 мес, направлена в НИИ ДОГ с подозрением на ретинобластому.
Из анамнеза: родилась от первой беременности, сопровождавшейся гестозом второй половины. Роды на 41-й нед беременности. Масса 2900 г, рост 53 см. Закричала сразу. Задержка темпов психомоторного развития. С рождения эритематозно-везикулезные изменения на коже туловища и конечностях, в последующем остались участки атрофии кожи с серо-коричневой пигментацией в виде брызг и полос. Судорог не было. Олигодонтия, зубы конической формы. Неравномерный рост волос, волосы тонкие. С 4 мес появился нистагм, косоглазие; в 1 год 3 мес выявлено опухолевое образование в левом глазу (OS). На основании характерного фенотипа у ребенка заподозрен синдром Блоха-Сульцбергера. У матери: кожа чистая, волосы и зубы в пределах нормы; с ее слов, в возрасте до 3 мес жизни отмечались эритематозно-везикулезные высыпания на коже голеней, кистей, которые исчезли, на их месте остались едва заметные линейные участки без волосяных фолликул, цвет кожи не изменен.
При обследовании онкоофтальмологом у девочки обнаружена ретролентальная фибродисплазия.
Проведены молекулярно-генетическое исследование ребенку и матери с определением наиболее частой мутации в экзоне 4-10 del гена NEMO, ответственного за развитие 70% случаев синдрома Блоха-Сульцбергера, и анализ аллельного метилирования области повтора (CAG)n в экзоне 1 гена AR.
У пациентки и ее матери выявлена мутация в экзоне 4-10 del гена NEMO в гетерозиготном состоянии, ассоциированная с синдромом Блоха-Сульцбергера 2-го типа (OMIM 308300). У матери ребенка обнаружена экстремально неравная инактивация хромосомы Х, содержащая мутацию в экзоне 4-10 del гена NEMO в 100% клеток крови, что и обусловило минимизацию клинических проявлений синдрома Блоха-Сульцбергера. У дочери, вероятно, инактивирована нормальная (отцовская) Х-хромосома, поэтому и отмечаются выраженные клинические признаки указанного синдрома.
Тип наследования синдрома — Х-сцепленный доминантный, с летальностью для плодов мужского пола. Риск повторного рождения девочки с синдромом Блоха-Сульцбергера 2-го типа и интра-натальной гибели плодов мужского пола с данной мутацией составляет 50% (высокий генетический риск). Однако степень проявления клинических признаков у будущего ребенка женского пола с носительством мутации гена NEMO предсказать сложно, поскольку это будет зависеть от сбалансированности инактивации Х-хромосом в постнатальном периоде.
Симулировать ретинобластому может также ангиоматоз сетчатки глаза как компонент синдрома Гиппеля-Линдау, ассоциированного с мутацией гена VHL. Таким образом, избежать ошибки в диагностике поможет совместное обследование пациента у онкоофтальмолога и генетика.
Вторые опухоли у больных с ретинобластомой выявлены в 13 случаях (9 детей и 4 родственников с РБ); чаще были представлены опухолями головы/ шеи — у 8 из 13 (табл. 1). Все пациенты получали лучевую терапию по поводу ретинобластомы. Согласно литературным данным, вторые опухоли у больных с ретинобластомой в 26% случаев могут развиваться после лечения в течение 1 года до 40 и более лет жизни. Для пациентов, получивших лучевое лечение, 30-летняя кумулятивная частота вторых опухолей составляет 35%, для пациентов, которые не подвергались лучевой терапии, — 6%. Для минимизации возникновения вторых опухолей у больных с РБ по возможности стоит избегать лучевую терапию, заменяя ее лазерокоагуляцией, криодеструкцией [16, 17].
Цитогенетическое исследование проведено 158 больным с РБ: 60 с билатеральной и 98 с монолатеральной формой. Патология кариотипа обнаружена в 16 случаях (10,1%). У 6 больных (у 4 — билатеральная и у 2 — монолатеральная РБ) выявлены интерстициальные делеции длинного плеча хромосомы 13, затрагивающие район локализации гена RB1, характерные для синдрома Орбели. В фенотипе помимо РБ выявлялись также такие врожденные аномалии, как микроцефалия, лицевые дизморфии, врожденные пороки сердца, задержка психомоторного развития. У 2 больных с умеренно выраженными лицевыми дизморфия-ми обнаружены микроделеции 13q14; у 4 больных с нормальным фенотипом микроделеции 13q14 носили мозаичный характер. Цитогенетически определяемые делеции в регионе хромосомы 13q14 могут включать не только ген RB1, но и другие, находящиеся в этом регионе, в частности ген PCDH8. Потеря этих генов и их функций может приводить к задержке психомоторного развития и разной степени выраженности лицевого дисмор-физма, врожденным порокам развития [18]. Кроме того, было показано, что крупные делеции в 13q14 имеют уменьшенную экспрессивность
33
w
Таблица 1. Возраст развития и локализация вторых опухолей у больных с билатеральной и монолатеральной, семейной и спорадической ретинобластомой
Монолатеральная ретинобластома Билатеральная ретинобластома
Спорадическая Манифестация Семейная Манифестация Спорадическая Манифестация Семейная Манифестация
Нефробластома правой почки 16 лет Глиома мозга 1 год 10 мес Гистиоцитоз-Х 3 года Фиброзная дисплазия большеберцовой кости 4 года
Папиллярный рак щитовидной железы 11 лет Менингиома левой височной области (мать пробанда) 22 года Рабдомиосаркома левой височной области 3 года 7 мес Остеосаркома скуловой кости (тетя пробанда) 29 лет
Остеосаркома верхней челюсти 17 лет МЗО: Аденома щитовидной железы Рак матки Ангиофибросаркома мягких тканей ягодицы (мать пробанда) 37 лет 40 лет 47 лет “ _ ” “ _ ” Остеосаркома теменной кости (тетя пробанда) 25 лет
Пилоидная астроцитома правой гемисферы мозжечка, синхронная сРБ 2,5 года “ _ ” “ _ ” “ _ ” “ _ ” “ _ ” “ _ ”
Врожденная фиброма правой ягодицы Врожденная? “ _ ” “ _ ” “ _ ” “ _ ” “ _ ” “ _ ”
Примечание. МЗО — множественные злокачественные опухоли.
Таблица 2. Спектр мутаций гена RB1 в ДНК выделенной из лейкоцитов, у больных с билатеральной и монолатеральной ретинобластомой
Билатеральная ретинобластома Монолатеральная ретинобластома
Вид мутации п, абс. Вид мутации п, абс.
Нонсенс-мутации 14 (5 семейные) “ _ ” “ _ ”
Инсерции 3 “ _ ” “ _ ”
Внутригенные делеции (несколько экзонов) 5 (1 семейная) Внутригенные делеции (2-4 нуклеотида) 2
Сайт сплайсинга 5 Сайт сплайсинга 1 (семья с н/п)
Миссенс-мутации 1 (семья, н/п) Миссенс-мутации 2 (1 семья с н/п)
Всего герминальные мутации выявлены у 28 больных из 40 (70%) Всего герминальные мутации выявлены у 5 больных из 35 (14,3%)
Примечание, н/п — неполная пенетрантность.
ОБМЕН ОПЫТОМ
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2015 / том 2 / № 1
региона, и у отдельных носителей крупных деле-ций ретинобластома не развивается вообще или развивается только в одном глазу [19]. В 3 случаях (1 ребенок с билатеральной и 2 — с монолатеральной РБ) выявлена сопутствующая хромосомная патология — 47,ХХ,+21 (синдром Дауна, трисом-ная форма), и один ребенок унаследовал от отца сбалансированную робертсоновскую транслокацию: 45,ХУ, robt 21/22. Известно, что у пациентов с хромосомной анеуплоидией, в частности при синдроме Дауна, повышен риск онкологических заболеваний, чаще развиваются лейкозы, однако и риск солидных эмбриональных опухолей значительно выше общепопуляционного [20]. В целом, цитогенетические изменения кариотипа в критическом регионе хромосомы 13q14 у обследованных больных выявлены в 7,6%. По данным литературы, делеции и перестройки, включающие регион хромосомы 13q14.1-q14.2, выявляются у 5% больных с монолатеральной и 7,5% — с билатеральной РБ [19].
Молекулярно-генетические исследования структуры ДНК гена RB1 проведены 75 пациентам с ретинобластомой и 137 их родственникам.
С билатеральной РБ обследовано 40 пациентов и 73 родственника (9 семейных форм). Мутации гена RB1 в ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови, ассоциированные с наследственной РБ, выявлены в 70% случаев (28 из 40; 7 семей). В 4 случаях у больных с несемейной билатеральной РБ мутации обоих аллелей гена были выявлены только в ДНК, выделенной из ткани опухоли, и не обнаружены в ДНК лейкоцитов. Учитывая билатеральный характер опухоли, в данном случае нельзя исключить наличие мозаичной мутации гена RB1 в лейкоцитах, недоступной для выявления вышеуказанными методами, поэтому генетический прогноз для будущих детей больного с билатеральной ретинобластомой остается в пределах высокого риска. Для обнаружения мозаичной мутации гена RB1 требуются более чувствительные методы диагностики, в частности аллельспецифическая ПЦР (AS-PCR) [11]. Из 40 больных с двусторонней ретинобластомой у 16 были использованы методы ПЦР, SSCP, анализ гетеродуплексов: мутации обнаружены в 50% (у 8 из 16). Применяя современные методы секвениро-вания, микросателлитного анализа, герминальные мутации выявлены в 83,3% случаев (у 20 из 24). Проведенный молекулярный анализ выявил разные типы мутаций. Среди больных с билатеральной РБ наиболее частой оказалась нонсенс-мутация (у 14), 1/3 из которых принадлежала семейным случаям ретинобластомы (табл. 2). Интересным является то, что у ребенка с билатеральной РБ, диагностированной в 4 года 9 мес, и наследственной миссенс-мутацией в 17-м экзоне гена RB1 была сестра с монолатеральной РБ, диагностированной в 6 мес, а их здоровый отец оказался носителем аналогичной мутации. Этот случай заболевания в
семье свидетельствует о неполной пенетрантно-сти и экспрессивности гена RB1. В трех случаях с крупной внутригенной делецией (int2-int20 del гена RB1) у детей были выявлены умеренно выраженные лицевые дизморфии и задержка темпов психоречевого развития.
С односторонней РБ обследовано 35 пациентов и 64 родственника. У 5/35 (14,3%; 2 семьи) пациентов в ДНК, выделенной из лейкоцитов, были выявлены мутации в гене RB1 в гетерозиготном состоянии, ассоциированные с наследственной формой РБ. В двух случаях отмечена неполная пенетран-тность гена (см. табл. 2). В спектре мутаций не были обнаружены нонсенс-мутации и инсерции, а внутригенные делеции были ограничены несколькими нуклеотидами; при билатеральной РБ внутригенные делеции в большинстве случаев занимали несколько экзонов.
Генотип-фенотип корреляция
в результате анализа ДНК гена RB1
При анализе спектра мутаций ДНК гена RB1 и клинических данных пациента обнаружена следующая генотип-фенотип корреляция: при нонсенс-мутациях, инсерциях, крупных внутригенных делециях выявляется более тяжелая клиническая картина — билатеральное, полифокусное поражение сетчатки, ранняя клиническая манифестация, появление новых фокусов РБ на фоне стандартной химиолучевой терапии; при миссенс-мутациях, мутации сайта сплайсинга выявлена неполная пенетрантность и экспрессивность признаков. При мутации сайта сплайсинга (у 2) и делеции четырех нуклеотидов (у 1) выявлено метахронное развитие опухоли. Во всех трех семьях с неполной пенетрантностью здоровыми носителями наследуемой мутации были отцы (в двух случаях — миссенс-мутации экзонов 14 и 17, в одном — мутация сайта сплайсинга в экзоне 9 гена RB1).
Клинический случай 2
Девочка, возраст 1 мес, пробанд из семьи В.
Диагноз: Монолатеральная полифокусная ретинобластома правого глаза (диагностирована в возрасте 1 мес).
Анамнез семьи: ретинобластома OS в возрасте 2 лет у полусибса отца.
Проведено определение мутаций в онкосупрессорном гене RB1 у пробанда, отца, матери, полусибса отца и деда по отцовской линии.
Результат: при анализе ДНК гена RB1 по лейкоцитам периферической крови пациентки, ее отца, сводного брата отца и деда выявлена герминальная мутация сайта сплайсинга в экзоне 9 гена RB1 — g.61807 G>A — в гетерозиготном состоянии, ассоциированная с наследственной формой ретинобластомы. Повышен риск малигни-зации сетчатки OS и вторых опухолей у пробанда. Риск носительства мутации g.61807 G>A в экзоне
35
ОБМЕН ОПЫТОМ
36
/
Рис. Семейная монолатеральная ретинобластома (родословная семьи В.)
Примечание. оп — монолатеральная ретинобластома: мутация сайта сплайсинга g.61807C>A в экзоне 9 гена RB1; 191 — здоровый носитель герминальной мутации сайта сплайсинга g.61807C>A в экзоне 9 гена RB1
9 гена RB1 в потомстве для отца, его полусибса и пробанда составляет 50%, пенетрантность опухоли — 50% (рис.).
Существование фенотип-генотип корреляции при РБ обсуждается и в литературных источниках [2, 12, 18, 19, 21, 22]. Поскольку существует связь между типами мутаций в гене RB1 и тяжестью клинического проявления ретинобластомы, молекулярно-генетические исследования этого гена могут внести существенный вклад в прогноз течения заболевания и планирование лечения таких больных.
Медико-генетическое консультирование
Открытие генов,ассоциированных с развитием ретинобластомы, значительно повысило эффективность медико-генетического консультирования, затрагивая практически все составные части этого процесса: уточнение этиологии; конкретизацию прогноза потомства, здоровья; доклиническую, в том числе дородовую, диагностику и профилактику ретинобластомы. Все семьи, имеющие детей с ретинобластомой, должны быть направлены на консультацию к врачу-генетику независимо от семейной истории.
Основные клинико-генеалогические критерии наследственных форм ретинобластомы:
• ранний возраст развития заболевания;
• билатеральное поражение;
• характер роста опухоли, как правило, мультицентрический (67%);
• наличие аналогичной опухоли у других членов семьи;
• трилатеральная РБ — сочетание у больного билатеральной РБ (редко монолатеральной) с опухолью эпифиза — пинеобластомой, которая имеет общее с РБ происхождение из нейроэктодермы [23].
Изучение клинико-генеалогических особенностей ретинобластомы необходимо для дальнейшего молекулярно-генетического обследования, выявления генотип-фенотип корреляций с целью
уточнения прогноза течения опухолевого процесса и прогноза потомства.
При прогнозе потомства для детей больного РБ и его братьев и сестер врач-генетик учитывает наличие нескольких факторов: семейной истории, тяжести клинического поражения, информативности методов молекулярно-генетического анализа, частоту возможного мозаицизма мутаций гена RB1, а также частоту возможного гонодального мозаицизма у родителя. При спорадической билатеральной форме ретинобластомы, ассоциированной с наследуемой мутацией, и отсутствии мутации у родителей прогноз для потомства больного составляет 50%, а для братьев и сестер — благоприятный (0,6%).
Планирование деторождения
При планировании деторождения лицам, перенесшим в детстве ретинобластому, ассоциированную с наследуемой мутацией гена RB1, возможно проведение дородовой диагностики с целью выявления носительства мутации гена у плода. Сроки беременности при проведении дородовой диагностики обычно зависят от решения супругов:
• если супруги примут решение прервать беременность в случае унаследования мутации плодом, то рекомендуется анализ ДНК из клеток хориона, выделенной при биопсии на сроке 10-12 нед беременности;
• если супруги решают провести дородовую диагностику с целью раннего обнаружения предрасположенности к ретинобластоме у плода и последующего своевременного лечения, то рекомендуется проводить анализ ДНК по клеткам околоплодных вод, полученных при амнио-центезе на сроке 15-20 нед гестации, когда меньше осложнений в течение беременности от процедуры.
При выявлении носительства герминальной мутации у плода рекомендуется его ультразвуковая диагностика с прицельным исследованием глаз каждые 4 нед внутриутробного развития. В случае выявления внутриутробно опухоли глаза возможно преждевременное родоразрешение после 36-й недели беременности с целью ранней, более щадящей терапии ретинобластомы [24, 25].
Среди изученных больных с ретинобластомой дородовая диагностика проведена в пяти семьях, в результате на свет появились трое здоровых детей. В двух случаях была выявлена герминальная мутация гена RB1 в ДНК, выделенной из клеток хориона, что свидетельствовало о высоком риске (90%) развития РБ у будущего ребенка. В обоих случаях супруги приняли решение прервать беременность в сроках медицинского аборта.
С помощью методик экстракорпорального оплодотворения стало возможным предотвратить рождение потенциально больного ребенка, применяя преимплантационную генетическую диагно-
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2015 / том 2 / № 1
стику известной мутации гена RB1 по бластомеру 6-8-клеточного эмбриона.
Новорожденный-носитель мутации гена RB1 нуждается в динамическом обследовании окулиста в группе риска с целью обнаружения начальных признаков РБ. Офтальмологическое исследование у детей грудничкового возраста проводится только под наркозом с расширенным зрачком. Большинство авторов рекомендуют клиническое обследование групп риска в первый месяц жизни, далее каждые 2 мес до 7 мес жизни, каждые 3 мес — до 18 мес жизни, каждые 6 мес — до 4 лет, затем 1 раз в год [4, 25].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Среди обследованных больных РБ (393 человека) в результате анализа клинико-генеалогических, цитогенетических, молекулярно-генетических данных опухоли с наследственной предрасположенностью составили 44%, среди односторонних форм
РБ — 13,9%. Ретинобластома — тяжелое заболевание, излечение которой приводит к инвалидности — слепоте. Успехи в лечении позволяют сохранить жизнь более 90% пациентов, однако качество жизни строго зависит от ранней диагностики опухоли. Офтальмоскопия глазного дна с периода новоро-жденности и далее в динамике в условиях поликлинической офтальмологической службы является залогом своевременной диагностики РБ. Ранняя диагностика начальных признаков РБ, в том числе подтверждающая ДНК-диагностика наследственных форм, позволит провести более щадящее лечение, что, несомненно, улучшит качество жизни ребенка и позволит семье ответственно подойти к вопросам планирования деторождения.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы данной статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки / конфликта интересов, который необходимо обнародовать.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алиев М.Д., Поляков В.Г., Менткевич Г.Л., Маякова С.Н. Детская онкология. Москва. 2012. С. 441-450.
2. Babenko O., Nemtsova M., Kozlova V., Brovkina A. Molecular analysis of RB1 gene mutations, loss of heterozygosity and methylation pattern on retinoblastoma patients. Abstr of ESHG. Amsterdam, Netherlands. 2000. P. 159.
3. Knudson A.G., Jr. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. Proc Nat Acad Sci. USA. 1971; 68: 820-823.
4. Lohmann D.R., Brandt B., Hopping W., Passarge E., Horsthemke B. The spectrum of RB1 germ-line mutations in hereditary retinoblastoma. Am J Hum Genet. 1996; 58: 940-949.
5. Harbour J.W. Molecular basis of low-penetrance retinoblastoma. Arch Ophthal. 2001; 119: 1699-1704.
6. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия. 2000; 65: 5-33.
7. Dryja T.P., Friend S., Weinberg R.A. Isolation of a cDNA fragment derived from human retina mRNA which detects a locus within 13q14 often deleted in retinoblastomas. (Abstract). Am J Hum Genet. 1986; 39: A29.
8. Pan H., Yin C., Dyson N.J., Harlow E., Yamasaki L., van Dyke T. Key roles for E2F1 in signaling p53-dependent apoptosis and in cell division within developing tumors. Molec Cell. 1998; 2: 283-292.
9. Bowles E., Corson T.W., Bavani J. et al. Profiling genomic copy number changes in retinoblastoma beyond loss of RB1. Genes Chromosomes Cancer. 2007; 46: 118-129.
10. Friend S.H., Bernards R., Rogelj S., Weinberg R.A., Rapaport J.M., Albert D.M., Dryja T.P. A human DNA
segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. Nature. 1986; 323: 643-646.
11. Rushlow D., Piovesan B. et al. Detection of mosaic RB1 mutations in families with retinoblastoma. Hum Mutat. 2009 May; 30 (5): 842-851.
12. Brigitte L. Theriault, Helen Dimaras, Brenda L. Gallie, Thimothy W. Corson. The genomic landscape of retinoblastoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 2014; 42: 33-52.
13. Rushlow D.E., Mol B.M., Kennett J.Y. et al. Characterisation of retinoblastomas without RB1 mutations: genomic, gene expression, and clinical studies. Lancet Oncol. 2013 Apr; 14 (4): 327-334.
14. Mulvihill J.J. Childhood cancer, the environment and heredity. Principles and Practice of Pediatric Oncology. Second Edition. 1993. Р. 11-27.
15. Bartholdi D., Krajewska-Walasek M. et al. Epigenetic mutations of the imprinted IGF2-H19 domain in Silver-Russell syndrome (SRS): results from a large cohort of patients with SRS and SRS-like phenotypes. J Med Genet. 2009; 46 (3): 192-197.
16. Abramson D.H. et al. Second tumors in nonirradiated bilateral retinoblastoma. Am J Ohthalmol. 1979; 87: 624-627.
17. Moll A.C. et al. Second primary tumors in patients with retinoblastoma. A review of the literature. Ophthalmic Genet. 1997; 18: 27-34.
18. Castera L., Dehainault C., Michaux D., Lumbroso-Le Rouic L., Aerts I., Doz F., Pelet A., Couturier J., Stoppa-Lyonnet D., Gauthier-Villars M., Houdayer C. Fine mapping of whole RB1 gene deletions in retinoblastoma patients confirms PCDH8 as a candidate gene for psychomotor delay. Eur J Hum Genet. 2013; 21 (4): 460-464.
37
ОБМЕН ОПЫТОМ
19. Mitter D., Ullmann R., Muradyan A., Klein-Hitpass L. et al. Genotype-phenotype oorrelations in patients with retinoblastoma and interstitial 13q deletions. Eur J Hum Genet. 2011 Sep; 19 (9): 947-958.
20. Satge D. et al. A tumor profile in Down syndrome. Am J Med Genet. 1998; 78: 207-216.
21. Бровкина А.Ф., Залетаев Д.В., Немцова М.В., Бабенко О.И и др. Поиск мутаций в гене RB1 при различных формах ретинобластомы. Восьмая итог. конф. «Геном человека». Черноголовка. 1998.
С. 69-70.
22. Lohmann D.R., Gerick M., Brandt B., Oelschlager U., Lorenz B., Passarge E., Horsthemke B. Constitutional RB1-gene mutations in patients with isolated unilateral retinoblastoma. Am J Hum Genet. 1997; 61: 282-294.
23. D'Elia G., Grotta S., Del Bufalo F. et al. Two novel cases of trilateral retinoblastoma: genetics and review of the literature. Cancer Genet. 2013 Nov; 206 (11): 398-401.
24. Lohmann D.R., Gallie B.L. Retinoblastoma: revisiting the model prototype of inherited cancer. Am J Med Genet. 2004 Aug 15; 129 (1): 23-28.
25. Sahgal A., Millar B.A., Michaels H., Jaywant S., Chan H.S., Heon E., Gallie B., Laperriere N. Focal stereotactic external beam radiotherapy as a vision-sparing method for the treatment of peripapillary and perimacular retinoblastoma: preliminary results. Clin Oncol (R Coll Radiol). 2006; 18: 628-634.
38
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Козлова Валентина Михайловна, врач-генетик лаборатории клинической онкогенетики НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина
Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, тел.: 8 (499)324-70-69, e-mail: [email protected]
Казубская Татьяна Павловна, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической онкогенетики НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, тел.: 8(499)324-26-85.
Соколова Ирина Николаевна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории гистохимии и электронной микроскопии НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, тел.: +7 (499) 324-60-98
Алексеева Екатерина Александровна, научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медикогенетический научный центр»
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1
Бабенко Ольга Владимировна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории эпигенетики ФГБУ «Медико-генетический научный центр»
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1
Близнец Елена Александровна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ «Медико-генетический научный центр»
Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1, тел.: 8 (499) 324-81-10
Ушакова Татьяна Леонидовна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник 1-го хирургического отделения НИИ детской онкологии и гематологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, e-mail: [email protected]
Михайлова Светлана Николаевна, заведующая научно-консультативным отделением НИИ детской онкологии и гематологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина
Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, тел.: +7 (499) 324-43-82, e-mail: [email protected] ЛюбченкоЛюдмила Николаевна, доктор медицинских наук, заведующая лабораторией клинической онкогенетики НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, тел.: +7 (499) 324-43-21
Поляков Владимир Георгиевич, академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», заведующий отделением опухолей головы и шеи, заведующий кафедрой детской онкологии ГБОУ ДПО «РМАПО» МЗ РФ Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24, e-mail: [email protected]
