CC BY
45
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
В случае использования только Н-2с)-специфичных Тгедэ пересаженные сердца сокращались весь период наблюдения, однако при гистологическом исследовании выявлялись признаки умеренного или тяжелого хронического отторжения в виде выраженной диффузной инфильтрации макрофагами и эозинофилами, деструкции кардиомиоцитов, утолщения интимы, артериосклероза и больших областей фиброза. Напротив, введение аутогенных Тгедэ, предварительно культивированных с Р1 ШВА/2ЧВ6) АПК, предотвращало все признаки хронического отторжения.
Авторы показали, что эффекты введения Тгедэ во всех случаях не являются результатом неспецифической иммуносупрессии. В описанных экспериментах замена трансплантатов кожи или сердца мышей линии ОВА/2 (Н-2с)) на аналогичные трансплантаты мышей линии БЛ (Н-2э) всегда приводила к реакции острого отторжения трансплантата
Данные всех исследований были воспроизведены и подтверждены и для других комбинаций линий мышей с экспрессией разных молекул МНС II.
Таким образом, в работе было показано, что CD4+CD25+Foxp3 регуляторные лимфоциты, при подходящей стимуляции и экспансии in vitro, могут быть успешно использованы для индукции иммунологической толерантности к клеткам костного мозга и последующим аллотрансплантатам кожи и сердца у мышей, подвергнутых предварительному облучению. Предотвращение отторжения, вероятно, обусловлено супрессией аллоспецифичных Т-лимфоцитов вводимыми Tregs. Остается неясным значение химерного гемопоэтичес-кого статуса. С одной стороны его роль может ограничиваться обеспечением важной для выживания Tregs антиген-специфической стимуляцией. С другой — дифференцирующиеся гемопоэтические клетки могут самостоятельно участвовать в индукции центральной и периферической иммунологической толерантности [2].
Использованный в исследовании режим кондиционирования имеет приемлемую для клинического применения токсичность. Авторы считают, что после адаптации протокол может быть использован для индукции специфической иммунологической толерантности у людей.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Coulombe М., Yang Н., Wolf L., Gill R. Tolerance to antigen-presenting cell-depleted islet allografts is CD4T cell dependent. J. Immunol. 1999; 162: 2503-10.
2. Sykes M. Mechanisms of tolerance induced via mixed chimerism. Front. Biosci. 2007; 12: 2922-34.
3. Roncarolo M.-G., Battaglia M. Regulatory T-cell immunotherapy for tolerance to self antigens and alloantigens in humans. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: 585-98.
4. Morelli A., Thomson A. Tolerogenic dendritic cells and the quest for transplant tolerance. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: 610—21.
5. Sakaguchi, S. Ono М., Setoguchi R. et al. Foxp3 1 CD25 1 CD4 1 natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease. Immunol. Rev. 2006; 212, 8-27.
6. Belkaid Y., Blank, R., Suffa I. Natural regulatory T-cells and parasites: a common quest for host homeostasis. Immunol. Rev. 2006; 212: 287-300.
7. Rouse B., Sarangi P., Suvas S. Regulatory T-cells in virus infections. Immunol. Rev. 2006; 212: 272-86.
8. Aluvihare V., Kallikourdis M., Betz A. Regulatory T-cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat. Immunol. 2004; 5: 266—71.
9. Beyer M., Schultze J. Regulatory T-cells in cancer. Blood 2006; 108: 804-11.
10. Bluestone J., Thomson A, Shevach E., Weiner H. What does the future hold for cell-based tolerogenic therapy? Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: 650^1.
11. Joffre 0., Gorsse T., Romagnoli P., Hudrisier D., van Meerwijk J. Induction of antigen-specific tolerance to bone marrow allografts with CD4 1 CD25 1 T lymphocytes. Blood 2004; 103: 4216—21.
Подготовил B.C. Сергеев
По материалам: Joffre О., Santolaria T„ Calise D. et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with
CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T4ymphocytes. Nat. Med. 2008; 14: 88-92
Репрограммирование панкреатических экзокриноцитов в функционально-активные р-клетки
Сахарный диабет (СД) 1 -го типа (называемый также инсулинзависимым СД) — наиболее частое заболевание эндокринной системы человека, и наряду с онкологическими и сердечно-сосудистыми заболеваниями — одна из главных проблем здравоохранения во всем мире. В основе патогенеза СД 1 -го типа лежит аутоиммунная атака секретирующих инсулин р-клеток островков Лан-герганса поджелудочной железы (ПЖ), что приводит к гибели последних и прогрессирующей недостаточности инсулина. До недавнего времени постоянные инъекции инсулина с контролем глюкозы крови и гликогемоглобина были единственным способом компенсации СД 1. Разработанный в конце 90-х годов и прошедший к 2006 году первые клинические испытания Эдмонтоновский протокол аллогенной трансплантации островковых клеток для лечения лабильного («ЬпШе-Ьуре») СД 1 с частыми эпизодами гипогликемии открыл новую страницу
в истории СД, дав миллионам пациентов надежду на адекватную компенсацию без необходимости постоянных инъекций инсулина [1, 2]. Однако в используемых на настоящий момент вариантах данного протокола лишь менее половины пациентов сохраняют независимость от инсулина через год после трансплантации. Помимо этого, подобное лечение связано с необходимостью пожизненной иммуносупрессивной терапии для предотвращения алло- (реакция «хозяин против транпланта-та») и аутоиммунного (продолжающаяся эндогенная аутоиммунная атака) отторжения трансплантированных р
новых методов лечения СД 1, неуклонно увеличивается.
Одним из потенциальных способов лечения различных заболеваний, связанных с утратой клеток определенного генеза (в частности, СД 1) является «репрограммирование» дифференцированных, присутствующих
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, ІУ» 4, 2008
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
в больших количествах клеток взрослого организма в плюрипотентные стволовые клетки с последующей их дифференцировкой в клетки с необходимым фенотипом, в случае СД 1 — в продуцирующие инсулин р-клетки. Альтернативой подобному подходу является прямое репрограммирование одного типа дифференцированных клеток в другой. Авторам опубликованной в Nature статьи «In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine р
генов трех транскрипционных факторов, специфичных р
лых экзокринных клеток ПЖ в полностью функциональ-
р
мирования были выбраны экзокринные клетки ПЖ,
р
мальный предшественник [3], а также в связи с тем, что при культивировании экзокринных клеток in vitro эндокринная программа «включается» в них спонтанно [4, 5]. Помимо этого, было показано, что аденовирусные векторы преимущественно инфицируют именно экзокринные клетки [6], и поскольку булыиая часть естер
р
могут быть легко идентифицированы при иммунофлуо-рецсентном анализе тканевых срезов как инсулинпози-тивные клетки вне островков Лангерганса.
В ранее опубликованных работах той же группы при помощи in situ гибридизации был проведен скрининг более 1100 транскрипционных факторов, что позволило идентифицировать группы транскрипционных факторов, специфично экспрессирующихся в различных типах клеток эмбриональной ПЖ [7]. В частности, была идентифицирована группа, состоящая по меньшей мере из 20 транскрипционных факторов, экспрессия которых в эмбриональной поджелудочной железе ограничена р
ми. Для дальнейшего анализа были выбраны 9 транскрипционных факторов (Pdx1, Ngn3, NeuroD, Nkx2.2, Nkx6.1, Pax4, Pax6, Isl1 и MafA), поскольку только соответствующие мутантные гены демонстрировали
р
В ходе первоначальных экспериментов, смесь из 9 аденовирусных бицистронных векторов (М9), каждый из которых содержит разделенные IRES-элементом индивидуальный транскрипционный фактор и GFP, слитый с сигналом ядерной локализации (nGFP), транскутанно вводили в поджелудочные железы двухмесячных им-мунодефицитных RAG-нокаутных мышей. Через месяц после инъекции умеренное повышение содержания нео-
р
поджелудочных железах двух из трех инфицированных животных. Для определения минимального набора транскрипционных факторов, необходимых для конверсии эк-р
векторов удаляли по одному вектору, и полученные смеси 8 векторов снова вводили в поджелудочные железы животных. Было показано, что удаление векторов, кодирующих Nkx2.2, Nkx6.1 или Рах4 не оказывает существен-
р
Данные, полученные при удалении каждого из остальных векторов, были слабоинтерпретируемыми. Смесь этих шести векторов (Мб) авторы подвергли второму раунду поочередной деплеции составляющих, в результате чего было выяснено, что абсолютно необходимыми для конверсии инфицированных nGFP-позитивных
р
ляются три транскрипционных фактора — Ngn3, Mafa и
Pdx1 (смесь М3): удаление каждого из соответствующих векторов из пула Мб приводило к снижению процента инсулинпозитивных клеток среди инфицированных nGFP-позитивных клеток к уровню, наблюдаемому при инфицировании животных контрольным вектором, кодирующим только nGFP. Напротив, удаление векторов, кодирующих Рахб и Isl1, не приводило к снижению
р
числу клеток, инфицированных смесью векторов. Удаление вектора, кодирующего NeuroD, умеренно снижало процент инсулинпозитивных клеток, а замена Ngn3 на NeuroD в смеси М3 приводила к получению смеси, статистически значимо отличающейся от контроля по эффективности генерирования инсулинпозитивных клеток, однако намного менее эффективной, чем изначальная смесь М3.
Репрограммирующий эффект М3, по-видимому, достаточно специфичен для экзокринных клеток ПЖ, поскольку эффективное (коэкспрессия всех трех факторов) инфицирование этой смесью тканей скелетных мышц in vivo и фибробластов in vitro не приводило к появлению инсулинпозитивных клеток. Происхождение р
было подтверждено двумя способами. Так, было показано, что >95% инфицированных контрольным вектором клеток ПЖ коэкспрессируют nGFP и амилазу (маркер экзокринных клеток), в то время как клетки, коэкспрес-сирующие nGFP и маркеры других типов клеток, в норме присутствующих в ПЖ, суммарно составляли менее 5% инфицированных nGFP-позитивных клеток.
Прямое доказательство происхождения генерирован-р
с использованием генетического подхода. Гомозиготных мышей линии Cpa1CreERT2 [7], под действием Та-моксифена индуцибельно экспрессирующих Сге-рекомби-назу селективно в экзокринных клетках ПЖ, скрещивали с гомозиготными мышами репортерной линии R26R, в
р
ен в убиквитарно экспрессируемый локус R0SA26 и отделен от промоторной области стоп-кассетой, фланкированной loxP-сайтами. После введения в полученных «двойных» гетерозиготных мышей тамоксифена, экспрессируемая только в экзокринных клетках Сге-ре-комбиназа вырезала фланкированную loxP-сайтами стоп-кассету перед LacZ, приводя к селективной эксп-р
их потомства. Последующая инъекция М3 приводила к
р
лактозидазу и инсулин, что однозначно подтверждает
р
ных клеток ПЖ.
Полученные инсулинпродуцирующие клетки демон-
р
in situ в тканевых срезах, так и при диссоциации в культуре. Иммунофлуоресцентный анализ продемонстрировал экспрессию всех основных генов, продукты которых
р р
ных факторов (NeuroD, Nkx2.2 и Nkx6.1). Индуциро-р
фичных для других типов клеток ПЖ, в том числе других гормонов ПЖ. По данным сравнительного анализа экс-прессионного профиля nGFP-позитивных клеток мышей, инфицированных М3, и клеток островков Лангерганса тех же мышей, количество транскриптов, сверхэкспрес-сированых в этих клеточных популяциях по сравнению с не-островковыми GFP-негативными клетками, составило
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
2051 и 2060 соответственно, из них число транскрип-тов, перекрывающихся между этими двумя популяциями, составило 1501, т.е. более 70%.
р
ки, индуцированные инсулинпозитиваные клетки вызывают локальное ремоделирование васкулярной сети для облегчения высвобождения инсулина в кровь. Подобно р
позитивные клетки экспрессируют VEGF и через 10 и 30 сут. после инфекции М3, периваскулярное расположение демонстрировали 61% и 83% индуцированных nGFP-положительных клеток, в то время как при инфекции контрольным вектором этот показатель составил 32%.
р
нии секреции инсулина в кровь была показана с использованием индукции диабета при помощи специфичес-
р
(STZ) с последующей (спустя неделю после инъекции STZ) инфекцией животных смесью векторов М3. С момента инфицирования животных М3 или контрольным вектором, уровень глюкозы крови (натощак) у мышей, получавших М3, был значительно ниже по сравнению с мышами, получавшими контрольный вектор с nGFP, причем этот эффект был стабилен даже через 9 нед. после инъекции стрептозотоцина. По сравнению с мышами, получавшими контрольный вектор, животные, получавшие М3, демонстрировали булыиую толерантность к глюкозе и более высокие сывороточные уровни инсулина. Таким образом, генерированные de novo ин-сулинпозитивные клетки являются полноценными функ-р
Важным результатом является также то, что, индуци-р
присутствуют в инфицированных клетках лишь временно. Так, при помощи RT-PCR анализа экспрессии вирусных трансгенов (по одному прямому праймеру на каждый из трех трансгенов и один и тот же обратный праймер, специфичный к IRES-элементу) было показано, что экпрес-сия всех трех трансгенов в поджелудочных железах экспериментальных животных значительно снижена через месяц после инфекции и не детектируется через 2 мес. после инфекции. Иммунофлуоресцентный анализ продемонстрировал отсутствие экспрессии белко-
р
месяц после инфекции, однако экспрессия Pdx1 и Mafa оставалась по-прежнему выраженной, что с учетом данных RT-PCR — анализа (см. выше) указывает на активацию эндогенных генов. Важно отметить, что эти данные находятся в согласии с тем фактом, что зрелые диффе-р
экспрессируют Pdx1 и Mafa [8, 9], т.е. Ngn3 необходим для индукции трансдифференцировки, но не для р
Главными достоинствами данного исследования по сравнению с предыдущими попытками репрограммирования дифференцированных клеток (гепатоциты [10—13], экзокринные клетки ПЖ [14—17], эпителий протока ПЖ р
модальные (микроскопия, иммуногистохимия, RT-PCR, экспрессионный профиль) доказательства «чистой» р
да как в большинстве других исследований репрограммирование было либо явно частичным (экспрессия некото-р
р
ток), либо проведенный анализ не исключал гибридного фенотипа.
В то же время, по данным других авторов, для «вклю-р
in vitro, по-видимому, достаточно простой диссоциации в культуре [14—17]. Механизм этого эффекта неясен,
р
рирует гибридный фенотип, экспрессируя маркеры эк-
р
дуцируют инсулин и эффективно восстанавливают нормогликемию в модели аллоксан-индуцированного диабета. Поэтому на данном этапе исследований, при всей ценности данной работы в качестве «proof-of-рппар1е»-исследования, демонстрирующего конверсию дифференцированных экзокринных клеток ПЖ в пол-
р
при помощи транзиторной коэкспрессии всего трех транскрипционных факторов, потенциальные практические преимущества подобного подхода перед простой диссоциацией экзокринных клеток ПЖ в культуре пока не вполне ясны. В любом случае, помимо своей академической ценности, данная работа привнесла в арсенал потенциальных способов лечения СД 1 типа еще одну интересную модальность.
Проблемой, связанной с потенциальным практическим применением как описанного Q. Zhou с соавт., так и других подобных способов лечения СД 1типа, является
р
отличие, например, от инфаркта миокарда, при котором поражение ткани носит одномоментный характер, и генерированным подобным образом кардиомиоцитам может угрожать только следующий инфаркт, СД 1 типа — хроническое аутоиммунное заболевание, и генериро-р
р
этому несмотря на «пациент-специфичность» подобных подходов, вопрос посттрансплантационной иммуносупрессии стоит столь же остро, как и в Здмонтоновском протоколе, с той лишь разницей, что во втором случае на первый план выходит коррекция аллоиммунной реакции «хозяин против трансплантанта». Одними из наиболее перспективных способов иммунокоррекции в подобных случаях являются различные протоколы аутотрансплантации/индукции/увеличения пула циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов. Вполне возможно, что именно сочетания двух параллельных протоколов клеточной терапии, один из которых направлен на р
мунологических нарушений, лежащих в основе аутоиммунной атаки островковых клеток ПЖ, являются наиболее перспективными и оптимальными для этиотропного и патогенетического лечения СД 1типа.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Shapiro A.M., Ricordi С., Hering B.J. et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. N. Engl. J. Med. 2006; 355(13]: 1318-30.
2. Srinivasan P., Huang G.C., Amiel S.A. et al. Islet cell transplantation. Postgrad. Med. J. 2DD7; 83(978): 224-9.
3. Gu G., Dubauskaite J., Melton D.A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN31 cells are islet progenitors and are distinct from
duct progenitors. Development 2DD2; 129(10], 2447-57.
4. Baeyens L., De Breuck S., Lardon J. et al. In vitro generation of insulin-producing beta cells from adult exocrine pancreatic cells. Diabetologia 2005; 48(1): 49-57.
5. Minami K., Okuno M., Miyawaki K. et al. Lineage tracing and characterization of insulin-secreting cells generated from adult pancreatic acinar cells. PNAS 2005; 102(421: 15116-21.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
6. Wang A.Y., Peng P.D., Ehrhardt A. et al. Comparison of adenoviral and adeno-associated viral vectors for pancreatic gene delivery in vivo. Hum Gene Ther. 2004; 15C4): 405-13.
7. Zhou Q, Law AC, Rajagopal J et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev. Cell. 2007; 13t11:103-14.
8. Murtaugh L.C., Melton D.A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2003; 19: 71-89
9. Jensen J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Dev Dyn. 2004; 229C1]; 176-200.
10. Wang A. Y., Ehrhardt A., Xu H. et al. Adenovirus transduction is required for the correction of diabetes using Pdx-1 or Neurogenin-3 in the liver. Mol. Ther. 2007; 15C2]; 255-63.
n.Ferber S., Halkin A., Cohen H. et al. Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces expression of insulin genes in liver and ameliorates streptozotocin-induced hyperglycemia. Nature Med. 2000; 6t5]: 568-72.
12. Kaneto H., Nakatani Y., Miyatsuka T. et al. PDX-1/VP16 fusion protein, together with NeuroD or Ngn3, markedly induces insulin gene transcription and ameliorates glucose tolerance. Diabetes 2005; 54t4]; 1009-22.
13. MiyatsukaT., Kaneto H., Kajimoto Y. et al. Ectopically expressed PDX-1 in liver initiates endocrine and exocrine pancreas differentiation but
causes dysmorphogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 310(31: 1017-25.
14. Baeyens L., De Breuck S., Lardon J. et al. In vitro generation of insulin-producing beta cells from adult exocrine pancreatic cells. Diabetologia 2005; 48(11: 49-57.
15. Minami K., Okuno M., Miyawaki K. et al. Lineage tracing and characterization of insulin-secreting cells generated from adult pancreatic acinar cells. PNAS 2005; 102C42]: 15116-21.
16. Minami K., Seino S. Pancreatic acinar-to-beta cell transdifferentiation in vitro. Front. Biosci. 2008; 13: 5824—37.
17. Okuno M., Minami K., Okumachi A. et al. Generation of insulin-secreting cells from pancreatic acinar cells of animal models of type 1 diabetes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2007; 292Ш: E158—E165.
18. SapirT., Shternhall K., Meivar-Levy I. etal. Cell-replacementtherapy for diabetes: generating functional insulin-producing tissue from adult human liver cells. PNAS 2005; 102: 7964-9.
19. Heremans Y., Van De Casteele M., in’t Veld P. et al. Recapitulation of embryonic neuroendocrine differentiation in adult human pancreatic duct cells expressing neurogenin 3. J. Cell Biol. 2002; 159C2): 303—12.
20. Gasa R., Mrejen C., Leachman N. et al. Proendocrine genes coordinate the pancreatic islet differentiation program in vitro. PNAS 2004; 101 [361: 13245-50.
Подготовил П.В. Белоусов По материалам: Zhou Q„ Brown J„ Kanarek A„ Rajagopal J„ Melton D. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to fl-cells, Nature 2008; 455: 627-32
«Мезенхимальный резерв» - новые данные или «хорошо забытое старое»?
С развитием клеточных технологий все большее число исследователей занимается вопросами биологии, культивирования, экспериментального и клинического применения постнатальных стволовых клеток. Об этой тенденции свидетельствует интенсивный рост количества публикаций, связанных с биотехнологическим направлением. При этом ключевую позицию занимают исследования мезенхимальных мультипотентных стро-мальных клеток (ММСК), что обусловлено доступностью методик их получения, экспансии in vitro и наличием ряда специфических полезных свойств [1]. Помимо способности к дифференцировке в нескольких ортодоксальных направлениях, ММСК принимают участие в регуляции иммунного ответа [2].
Несмотря на наличие отработанных методик культивирования и анализа ММСК in vitro, остается актуальным вопрос о естественной локализации этих клеток в организме. Как метко отмечают Е.Б. Владимирская с соавт., «биология мезенхимальных стволовых клеток в настоящее время остается биологией вне окружения» [3]. Иными словами, до настоящего времени в должной степени не охарактеризована специфическая тканевая ниша ММСК, однако клетки, со свойствами ММСК получены из многих тканей и органов. Основными источниками ММСК являются красный костный мозг [4] и жировая ткань [5], хотя эти клетки выделены также из печени, селезенки, почек, поджелудочной железы [6], синовиальных оболочек [7], легких [8], кожи [9]. Это отличает их, например, от гемопоэтических стволовых клеток, локализующихся в специфических костномозговых нишах. Можно ли утверждать, что ММСК рассредоточены («рассредоточенный камбий») по разным тканям, где ассоциированы с индивидуальным микро-
окружением, или же это клетки, эмигрирующие из единого места своей локализации, например из костного мозга? Ясно одно — обнаружение специфических тканевых ниш ММСК in vivo открыло бы путь для более детального изучения свойств этих клеток в своей естественной, физиологической среде, уточнило их функции и дальнейшее практическое применение.
В этой связи, М. Crisan с соавт. в журнале Cell Stem Cell опубликовали результаты исследования, в котором постулировали расположение ММСК в специфических «периваскулярных» нишах. Для доказательства этого положения авторы показали, что перициты (также некорректно называемые ими периваскулярными клетками), полученные из стенок сосудов различных органов и тканей, по ряду основных параметров соответствовали ММСК. В частности, были показаны способность перицитов к лейомиогенезу, остеобластический, хонд-робластический и адипоцитарный дифференцировочный потенциал. Кроме того, исследователи установили соответствия на уровне иммунофенотипа и особенностей хемотаксиса.
Аналогичная гипотеза была выдвинута в работе Meirelles L. da Silva с соавт., фактически одновременно опубликованной в журнале Stem Cells, центральным постулатом которой являлось положение, в соответствии с которым ММСК во всем организме имеют периваску-лярную локализацию, являясь, по меньшей мере, одной из субпопуляций перицитов. Основные усилия для доказательства своей гипотезы авторы направили на определение иммунофенотипических и морфофункциональных соответствий между перицитами и ММСК с привлечением материалов других исследовательских лабораторий.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, ІУ» 4, 2008
