CC BY
89
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ОБЗОРЫ
Регенеративная медицина в лечении диабета
А. Матвеенко1, 1 Отдел физиологии и биомедицинской инженерии Клиники Майо,
А. Вема2 Рочестер, Миннесота, США
2 Отделения эндокринологии, диабета, метаболизма и питания Клиники Майо, Рочестер, Миннесота, США
Целевую аудиторию для курсов клиники Майо в первую очередь составляют врачи-специалисты в области внутренней медицины и клиницисты иного профиля, желающие улучшить свои знания в области клинической медицины и идти в ногу с достижениями современных медицинских исследований.
Обоснование необходимости. Врачи общей практики и врачи-специалисты по оказанию первичной помощи обязаны обладать широкой базой знаний по обширному спектру вопросов, касающихся как всех систем организма человека, так и часто и нечасто встречающихся заболеваний. Курсы Клиники Майо направлены на использование клинического опыта их авторов, для того чтобы помочь врачам общей практики понять передовые методики диагностики и ведения различных патологических состояний, встречающихся в клинической практике.
Аккредитация. Аккредитационный совет по непрерывному медицинскому образованию аккредитовал Медицинский колледж Клиники Майо на право проведения курсов повышения квалификации для врачей общей практики.
Образовательные кредиты. Медицинский колледж Клиники Майо определяет данный вид проводимого через журнальные публикации непрерывного медицинского образования (НМО) как дающий максимально кредит(ы) 1-й категории™ по правилам 1.0 AMA PRA.
Цели обучения. После изучения данной статьи вы должны уметь: 1) определять характеристики функционирующих зрелых р-клеток; 2) различать разные подходы, использующиеся для проведения заместительной клеточной терапии при сахарном диабете типа 1; 3) оценивать возможность клинического применения текущих достижений по внедрению методов заместительной р-клеточной терапии.
Публикуемая информация. Как предоставляющая услугу и аккредитованная АСНМО организация Медицинский колледж Клиники Майо (Школа непрерывного профессионального развития Майо) обязан обеспечить сбалансированность, независимость, объективность и научную обоснованность предоставляемых образовательных услуг. Руководители курса, члены Комиссии по планированию, представители факультета и все другие лица, в обязанность которых входит контроль содержимого данной образовательной услуги, обязаны предоставить общественности полную информацию о финансовых взаимоотношениях, содержащих коммерческий интерес, касающийся предмета данной образовательной услуги. Задействована защита от обусловленных коммерческими интересами субъективных отклонений. Кроме того, факультет предоставит информацию о любом применении обсуждаемых в их учебных материалах медикаментов и инструментария, которое осуществлялось вне зарегистрированных показаний или с исследовательской целью. Указанная информация будет опубликована в материалах курса, чтобы получатели данной услуги могли составить собственное суждение о преподанном им материале.
Учитывая свое редакторское и административное положение, Уильям Ланье (мл.), Терри Л. Хопке, Кимберли Д. Санки и Ники М. Смит, MPA осуществляют контроль содержимого данной программы, но не состоят в имеющих отношение к данному вопросу финансовых взаимоотношениях с представителями промышленного производства.
Regenerative medicine in diabetes
A. Matveyenko1, A. Vella2 1 Department of Physiology and Biomedical Engineering Mayo Clinic,
Rochester, MN, USA
2 Division of Endocrinology, Diabetes, Metabolism and Nutrition, Mayo
Clinic, Rochester, MN, USA
Diabetes is a common multisystem disease that results in hyperglycemia due to a relative or absolute insulin deficiency. Improved glycemic control decreases the risk of development and progression of microvascular and, to a lesser extent, macrovascular complications and prevents symptomatic hyperglycemia. However, complex treatment regimens aimed at improving glycemic control are associated with an increased incidence of hypoglycemia. On paper at least, cellular therapies arising from reprogramed stem cells or other somatic cell types would provide ideal therapy for diabetes and the prevention of its complications. This hypothesis has led to intensive efforts to grow p-cells from various sources. In this review, we provide an overview of p-cell development as well as the efforts reported to date in terms of cellular therapy for diabetes. Engineering p-cell replacement therapy requires an understanding of how p-cells respond to other metabolites such as amino acids, free fatty acids, and ketones. Indeed, efforts thus far have been characterized by an inability of cellular replacement products to adequately respond to metabolites that normally couple the metabolic state to p-cell function and insulin secretion. Efforts to date intended to capitalize on current knowledge of islet cell development and stimulus-secretion coupling of the p-cell are encouraging but as yet of little clinical relevance.
Mayo Clin. Proc. 2015. Vol. 90 (4): 546-554.
Диабет - распространенное мультисистемное заболевание, которое проявляется развитием гипергликемии в результате относительной или абсолютной недостаточности инсулина. Улучшение контроля гликемии снижает риск развития и прогрессирования микрососудистых и при дальнейшем прогрессировании заболевания ма-крососудистых осложнений и предотвращает возникновение клинических проявлений гипергликемии. Однако применение режима комплексной терапии, направленной на улучшение контроля гликемии, связано с повышенной частотой возникновения гипогликемических эпизодов. По крайней мере в теории различные виды клеточной терапии, берущие свое начало в применении перепрограммированных стволовых клеток или других типов соматических клеток, должны представлять собой идеальные возможности для лечения диабета и предотвращения его осложнений. Подобные гипотезы привели к усилению попыток вырастить р-клетки из различных источников. В данном обзоре мы представляем описание развития р-клеток, а также обзор описанных к настоящему моменту попыток их использования в клеточной терапии диабета. Проектирование и разработка р-клеточной заместительной терапии требуют понимания того, каким образом р-клетки реагируют на воздействие других метаболитов, таких как аминокислоты, свободные жирные кислоты и кетоны. На самом деле до сих пор подобные работы характеризовались неспособностью продуктов клеточного замещения адекватно реагировать на действие тех продуктов обмена, которые в обычных условиях связывают метаболическое состояние с функцией р-клеток и выработкой инсулина. Результаты предпринимавшихся до настоящего времени усилий, направленных на извлечение пользы из текущих знаний о развитии клеток островковой части поджелудочной железы и о функционировании в р-клетках системы сопряжения «стимул-секреция», являются обнадеживающими, но в настоящий момент имеют довольно низкую клиническую значимость.
Диабет - распространенное мультисистемное заболевание, которое проявляется развитием гипергликемии в результате относительной или абсолютной недостаточности инсулина и развивается в результате комплексного взаимодействия генетических факторов и влияния окру-
жающей среды [1]. Наличие или отсутствие заболевания определяется проявлением гипергликемии, выраженность и продолжительность которой ведет к образованию таких микрососудистых осложнений, как ретинопатия, нефропатия и нейропатия. Абсолютная недостаточность инсулина обычно встречается при иммунно-опосредованном диабете типа 1 (СД1), при котором иммунная реакция приводит к разрушению р-клеток, являющихся местом выработки эндогенного инсулина. В отличие от этого, при диабете типа 2 (СД2) недостаточность инсулина, которая хоть и возникает частично в результате утраты функционально активных р-клеток, является не абсолютной, а относительной, проявляющейся вследствие развивающегося при данной патологии нарушения сигнальных систем инсулина [2].
Улучшение контроля гликемии снижает риск развития и прогрессирования вышеописанных осложнений и предотвращает возникновение клинических проявлений гипергликемии. Однако применение режима комплексной терапии, направленной на улучшение контроля гликемии, связано с повышенной частотой возникновения гипогликемических эпизодов. Гипогликемия является одним из наиболее серьезных осложнений терапии диабета, способным привести к возникновению нейрокогнитивных расстройств и к нарушению качества жизни пациента. Данная проблема привела к поиску альтернативных терапевтических стратегий. По крайней мере в теории различные виды клеточной терапии, берущие свое начало в применении перепрограммированных стволовых клеток или других типов соматических клеток, должны представлять собой идеальные возможности для лечения диабета и предотвращения его осложнений.
Клиническая необходимость
При СД1 и при, в определенном смысле, длительно протекающем СД2 для достижения достаточного контроля гликемии ежедневно необходимо применение множественных инъекций инсулина, что, в свою очередь, требует от пациента значительной обязательности и психологической устойчивости. На самом деле для некоторых пациентов поддержание контроля гликемии с одновременным избеганием гипогликемических эпизодов может быть сложной задачей. Наиболее
пугающим осложнением, сопровождающим продолжительное течение СД1, является отсутствие ранних настораживающих проявлений гипогликемии, которое развивается в том случае, когда дефектная антагонистическая реакция на гипогликемию приводит к частому проявлению гипогликемии с небольшим количеством продромальных симптомов. Как следствие этого, у страдающего подобным нарушением пациента возникают риск когнитивной дисфункции, гипоглике-мические судороги и часто развивается неспособность к выполнению работы или управлению транспортным средством [3, 4]. До настоящего времени терапия в подобных случаях заключалась в трансплантации поджелудочной железы или ее островковых клеток, что способствовало восстановлению эндогенной секреции инсулина и улучшало течение микрососудистых осложнений. Однако применение подобных процедур подвергает пациента как риску хирургических осложнений, так и негативному влиянию последующей иммуносупрессии, включая риск развития оппортунистических инфекций и токсическое действие иммуносупрессивных средств [5].
Дополнительно к необходимости достижения и поддержания контроля гликемии микрососудистые осложнения, в особенности нейропатия и ее последствия, позволяют применять различные виды заместительной клеточной терапии. Диабетическая нейропатия является частой причиной образования язв на стопах, с их деформацией и последующей ампутацией. Вегетативные расстройства, особенно в области желудочно-кишечного тракта, ведут к нарушению привычного образа жизни, а в дальнейшем могут затруднят контроль гликемии и увеличивать смертность [6]. В данном контексте необходимо разрабатывать лучшие стратегии терапии диабета и его осложнений.
Эмбриональное развитие р-клеток
Поджелудочная железа развивается из дорсальной и вентральной эпителиальных почек, сформированных энтодермой задней части головной кишки, приблизительно на 10-е сутки эмбрионального развития (сроки указаны применительно к грызунам). Эпителиальные клетки выпячиваются в окружающую мезенхиму, формируя нарост мультипотент-ных прогениторных клеток (МПК), окружающих центральный просвет. Все последующие прогениторные клетки, а также клетки других типов, присутствующие в поджелудочной железе взрослых особей (т.е. клетки ацинусов, протоков, островков), формируются из подобных наростов [7]. К 13-м суткам эмбрионального развития происходит слияние дорсальной и вентральной панкреатических почек, сопровождающееся экспансией МПК с клетками, которые демонстрируют апикобазальную полярность и формирование микропросветов. Количество МПК, расположенных в первичных панкреатических почках, по-видимому, обусловливает окончательные размеры органа, давая основание полагать, что МПК, из которых развивается взрослая поджелудочная железа, уже являются в некотором смысле преддифференциро-ванными и ограниченными в количестве клеточных циклов, которые они способны пройти для увеличения объема ткани, развития органной структуры и дифференцировки в определенные клеточные линии [8]. В первой волне дифферен-
цировки эндокринных клеток происходит преимущественно формирование а-клеток, хотя некоторые клетки выделяют грелин (е-клетки), панкреатический полипептид и сомато-статин (5-клетки). Дальнейшее развитие ведет к расслоению и почкообразованию эндокринных клеток, напоминающему структуру взрослой поджелудочной железы. Было высказано предположение, что большая часть ß-клеток происходит из области дорсальной, а не вентральной панкреатической почки, что подразумевает возможность большей пригодности микросреды для дифференцировки МПК в полноценно функционирующие ß-клетки [9].
Что направляет развитие эндокринных клеток в эмбриональной поджелудочной железе? Очевидно, что множество факторов взаимодействуют на различных стадиях развития, включая те факторы, которые являются внешними по отношению к МПК и происходят из прилежащей мезенхимы. Имеются также такие сигналы, которые являются внутренними для развивающегося эпителия, приобретающего паракрин-ные характеристики. Время воздействия и комбинации данных сигналов активируют ряд генетических регуляторных сетей, опосредующих свое действие через многообразие факторов транскрипции, роль которых в определении дальнейшей судьбы клетки зависит от контекста. Ngn3 - основной фактор транскрипции типа «спираль-петля-спираль», который определяется на ранних этапах формирования дорсальной панкреатической почки. У мышей с недостаточностью Ngn3 нарушается формирование эндокринных клеток поджелудочной железы, и они умирают от постнатального диабета. Мыши с Ngn3-/- имеют недостаточную экспрессию факторов ISL1, PAX4, PAX6 и NEUROD, что подразумевает, что Ngn3 является апстрим-регулятором указанных факторов транскрипции [10].
Для транскрипции множества генов ß-клетки, включая те, которые отвечают за синтез инсулина и глюкокиназы (фермента, фосфорилирующего глюкозу), и те, которые ответственны за формирование железы в целом, необходимо присутствие фактора транскрипции гомеобокса PDX1. У мышей, гомозиготных по нулевой мутации PDX1, поджелудочная железа не формируется, тогда как ограниченная инактивация PDX1 в ß-клетках мышей приводит к дефициту инсулина и развитию диабета. Агенез поджелудочной железы также отмечен у людей, гомозиготных по мутации, связанной с нарушением функции PDX1, а у лиц, гетерозиготных по PDX1, развивается юношеский диабет взрослого типа (ЮДВТ, юношеский инсулинонезависимый сахарный диабет ) [11]. Генетические мутации, связанные с развитием ЮДВТ, в той или иной мере дают представление об особенностях развития ß-клеток. Участки связывания для ответственных за возникновение ЮДВТ генов PDX1, HNF1A и HNF4A были обнаружены в молекуле - промоторе PAX4, что дает основание полагать, что гены ЮДВТ могут являться апстрим-регуляторами генов, критичных для формирования островков и функционирования поджелудочной железы [12]. Мутации, затрагивающие фактор NEUROD1, вызывают у человека форму ЮДВТ, характеризующуюся неполноценной секрецией инсулина [13]. У мышей с недостаточностью NEUROD1 отмечается выраженное уменьшение количества клеток в островках и остановка развития ß-клеток.
Характеристика зрелых р-клеток и секреция инсулина
У здоровых индивидуумов концентрация глюкозы натощак тщательно регулируется таким образом, чтобы оставаться в относительно узком диапазоне. На протяжении «голодных» периодов находящаяся в кровотоке глюкоза поступает из печени, которая находится в состоянии тонического угнетения инсулином. Сама по себе глюкоза стимулирует ее периферический захват и угнетает собственную выработку. Контррегуляторные гормоны, как, например, катехоламины и глюкагон, при необходимости могут повысить концентрацию глюкозы. Во время «голодания» секреция инсулина осуществляется в пульсирующем режиме, с увеличением амплитуды и частоты пульсации при нарастании концентрации глюкозы [2] (рис. 1). На самом деле р-клетки реагируют и на действие других метаболитов, например аминокислот, свободных жирных кислот и кетонов. В ответ на поступление в организм пищи секреция инсулина экспоненциально возрастает таким образом, что постпрандиальный прирост концентрации глюкозы (и других вышеупомянутых метаболитов) сохраняется и возвращается к концентрациям, близким к таковым в состоянии натощак, в течение 2 ч. Для поддержания гомеостатического равновесия метаболитов первостепенную важность имеет функция р-клеток, которая опосредована их способностью реагировать на воздействия метаболитов, иногда именуемых факторами сопряжения метаболитов, поскольку они являются продуктами промежуточного обмена веществ, связывающими метаболическое состояние с функцией р-клеток путем выработки инсулина [14].
Изолированные р-клетки перфузируемых поджелудочных желез в моделях на грызунах и других животных, а также у человека демонстрируют двухфазный тип реакции на внутривенное введение глюкозы. I фаза быстрая, но не стойкая, и считается, что она соответствует высвобождению заранее сформированных секреторных гранул в ответ на быстрое увеличение концентрации глюкозы (рис. 2). II фаза, по-видимому, отражает синтез и секрецию инсулина в ответ на развитие гипергликемии. Хотя отмеченные фазы секреции инсулина у человека не отделяются друг от друга в общей
реакции на пероральную провокацию, при математическом моделировании все же существует возможность разделить статический (синтез и секреция) и динамический (высвобождение заранее сформированных секреторных гранул) компоненты секреции инсулина. Оба компонента необходимы для поддержания гомеостатического состояния глюкозы, хотя при диабете чаще наблюдается нарушение статической фазы секреции инсулина. Фармакологические средства, такие как агонисты рецепторов глюкагонподобного пептида-1, воздействуют преимущественно на статический компонент инсулиновой секреции [15].
Общегеномные исследования, изучающие предрасположенность к возникновению СД2 позволили выявить несколько генов, способных нарушать функцию р-клеток, причем одни из них играют важную роль при сборке инсулиновых гранул, а другие регулируют сопряжение «стимул-секреция» [1]. Уникальность метаболизма глюкозы в р-клетках заключается в том, что он регулируется доступностью субстрата, которая становится возможной у человека благодаря быстрому выравниванию внутри- и внеклеточной концентрации глюкозы за счет действия транспортера глюкозы 1. В дополнение к этому гликолиз и последующее введение углерода в цикл трикарбоновых кислот, что является обычным метаболическим путем глюкозы в р-клетках, регулируются глюко-киназой - гексокиназой с низким сродством к глюкозе. На самом деле интенсивность процесса, составляющая половину от максимальной, достигается при концентрациях глюкозы приблизительно 8 ммоль/л [14]. Другие гексо-киназы, активные при более низких концентрациях глюкозы, угнетаются в процессе созревания функциональных р-клеток [16]. В конечном итоге скорость фосфорилиро-вания глюкозы определяет скорость продукции аденозин-трифосфата, контролирующего мембранный потенциал и высвобождение инсулина с помощью тандемных операций в нуклеотид-зависимом комплексе каналов КЛТФ/511К1 и в потенциал-зависимом Са2+ канале 1_-типа, которые опосредуют экзоцитоз гранул инсулина [14].
Конечной целью восстанавливающихся р-клеток на функциональном уровне может быть, как минимум повторное обретение способности реагировать на воздействие глюко-
Острая регуляция секреции инсулина
Реактивность глюкозы Отклик инкретина
Частая пульсация Циркадный контроль У
Долгосрочная регуляция секреции инсулина
(-7--
Отклик на ^ требования метаболизма (например, ожирение)
Отклик на у требования метаболизма (например, нагрузка)
* М
Внутриостровковые эффекты Внеостровковые эффекты
Супрессия высвобождения глюкагона Аутокринные и паракринные эффекты
Супрессия эндогенной глюкозы
Продукция Стимуляция захвата глюкозы
Клиренс инсулина
Рис. 1. Функциональные характеристики р-клеток, имеющие первостепенное значение для нормального контроля уровня глюкозы in vivo
зы на зрелые клетки островков, сопряженное со способностью синтезировать и секретировать биоактивный инсулин в количествах, необходимых для поддержания гомеостаза глюкозы. Гипогликемические нарушения, обусловленные генетически или приобретенные, проявляются нефизиологичной секрецией инсулина из-за преобладающей концентрации глюкозы и иллюстрируют опасность неуправляемой инсулиновой секреции. И наоборот, хотя островковые клетки пациентов с долготекущим СД2 по-прежнему способны вырабатывать инсулин, они демонстрируют замедленную и сниженную реакцию в ответ на действие различных секре-тагогов и на пероральную провокацию. Заместительная клеточная терапия при СД1 должна будет проложить путь между Сциллой нерегулируемой секреции инсулина и Харибдой нарушенной реактивности на действие метаболитов.
Доклинические исследования различных подходов к заместительной клеточной терапии при диабете
Абсолютная или относительная утрата р-клеток поджелудочной железы (снижение р-клеточной массы) является ключевым патофизиологическим явлением, ускоряющим развитие гипергликемии как при СД1, так и при СД2. В то время как при СД1 утрата р-клеток происходит вследствие аутоиммунных атак, ведущих к практически полной потере р-клеточной массы, при СД2 утрата р-клеток происходит постепенно и начинает проявляться клинически, когда снижение р-клеточной массы достигает 50-65% по сравнению с недиабетическим контролем [17]. Принимая во внимание критическое значение поддержания р-клеточной массы на приемлемом уровне для контроля гликемии и предотвращения развития в дальнейшем хронических осложнений, императивом стало развитие новых стратегий терапии, направленных на восполнение при диабете дефицита р-клеточной массы. За несколько прошедших десятилетий появилось множество регенеративных подходов. Указанные подходы включают заместительную р-клеточную терапию
с использованием: 1) эмбриональных плюрипотентных стволовых клеток (ЭПСК); 2) индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК); 3) мезенхимальных стволовых клеток взрослых (МСК), а также 4) перепрограммиро-вание/трансдифференцировку различных не-р-клеточных типов (например, клеток ацинусов или энтероэндокрин-ных клеток) и 5) индукцию репликации существующих р-клеток. В некоторых недавних общих обзорах внимание было сосредоточено на межклеточных сигнальных механизмах, активирующих индукцию р-клеточной пролиферации [19, 20]. Следовательно, основное внимание в данном обсуждении будет направлено на изучение недавних достижений терапевтических подходов, основанных на применении стволовых клеток и клеточном перепрограммировании (рис. 3).
Эмбриональные плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и мезенхимальные стволовые клетки
Эмбриональные плюрипотентные стволовые клетки, выделенные из внутренней клеточной массы преимпланта-ционной бластоцисты, представляют собой плюрипотентные клеточные линии со способностью к неограниченной пролиферации, что отражает их уникальную способность дифференцироваться в соматические клеточные типы всех трех герминативных слоев [21]. Разработка методик по выделению и последующей дифференцировке ЭПСК в специфические клеточные типы породила огромный интерес и надежду на то, что удачная дифференцировка ЭПСК в функциональные р-клетки сможет реализовать терапевтически значимую стратегию по замещению утраченных р-клеток, улучшить ситуацию с зависимостью от инсулина у пациентов, страдающих диабетом [22, 23]. Протоколы исследований, направленных на поиск путей успешной in vitro дифференцировки ЭПСК в линии р-клеток, обычно используют стратегию повторной индукции биологических
Натощак Глюкоза внутривенно
Подход к применению стволовых клеток
Подход к перепрограммированию клеток
1 Г
(^ЭПС^ (^ИПС^ (^МСК^)
^■Р-Клетка'
Секреция инсулина
Контроль содержания глюкозы
Рис. 3. Методологические подходы к заместительной Р-клеточной терапии при диабете. ЭПСК - эмбриональные плюрипотентные стволовые клетки; ИПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; МСК - мезенхимальные стволовые клетки взрослых
сигнальных путей, предназначенных для воспроизведения естественных стадий развития эндокринной части поджелудочной железы [24, 25]. Течение данного процесса достигается путем последовательного добавления различных факторов роста (например, активин А, фактор роста фи-бробластов) и активаторов сигнальных путей (например, ретиноевая кислота), которые применяются для того, чтобы изменить предназначение и дифференцировку стволовой клетки, направляя ее, таким образом, по пути развития р-клетки [26, 27]. В своей особенности данный процесс использует повторение ключевых стадий формирования поджелудочной железы, которые включают: 1) формирование дефинитивной энтодермы, характеризующееся экспрессией факторов SOX17 и FOXA2 [28]; 2) индукцию панкреатической энтодермы, сопровождающуюся экспрессией факторов PDX1 и HNF6 [29]; 3) формирование эндокринных предшественников, отмеченное индукцией NGN3 и NEUROD1 [10], и 4) окончательное развитие р-клеточной линии, отмеченное экспрессией инсулина, NKX6-1 и MAFA [30, 31]. Несмотря на непрерывное обновление протокола, р-клеточная in vitro дифференцировка в полноценные зрелые р-клетки по-прежнему представляет собой область активных исследований.
В отчетах многочисленных исследований, сообщающих о получении in vitro инсулин-продуцирующих клеток из человеческих ЭПСК, речь идет о незрелых р-клеточных фенотипах, которые скорее напоминают эмбриональные р-клетки человека, нежели зрелые функционирующие р-клетки взрослого [32, 33]. Важно отметить, что данные клетки часто характеризуются недостаточной секрецией инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой, неправильной экспрессией основных р-клеточных факторов транскрипции (например, NKX6-1) и аномальными полигормональными фенотипами [32, 33]. Совсем недавно 2 независимые группы исследователей предоставили отчеты об обновлениях протоколов дифференцировки с использованием нескольких новых малых молекул, разработанных, чтобы усилить предрасположенность клеток к дифференцировке в сторону образова-
ния зрелых р-клеточных линий [30, 31]. В частности, PagLiuca и соавт. [30] сообщили об обновлении протокола по генерации р-клеток из человеческих ЭПСК in vitro. Новый протокол описывает генерацию р-клеток, которые 1) обогащены транскрипторными факторами созревания р-клеток (например, NKX6-1), 2) демонстрируют in vitro глюкозоре-активное высвобождение инсулина и увеличение внутриклеточного содержания кальция, 3) содержат инсулино-вые гранулы, структурно сходные с таковыми в первичных человеческих р-клетках и 4) способны снижать уровень гипергликемии после их трансплантации мышам, которые страдают диабетом [30]. Интересно заметить, что в протоколе также описывается новый метод скейлинга (ранжирования) выработки р-клеток, имеющий потенциальное применение в терапевтической практике. Несмотря на достигнутый существенный прогресс в обновлении протокола дифференцировки ЭПСК в р-клетки, требуется проведение дальнейших исследований для решения критического вопроса о том, даст ли имплантация полученных in vitro р-клеток значительный терапевтический результат относительно возможности поддержания приемлемых уровней их функции и массы при диабете.
Для in vitro производства р-клеток из ЭПСК некоторые исследователи прибегают к использованию альтернативного подхода. Данный подход заключается в дифференцировке ЭПСК в направлении стадии панкреатических прогениторных клеток PDX1+ с последующим приживлением/имплантацией этих панкреатических прогениторов в живой организм (обычно, мыши или крысы), позволяя, таким образом, процессу созревания происходить in vivo, при помощи микроокружения реципиента [34-36]. На самом деле данный подход использовался в значительном количестве исследований, по результатам которых сообщалось о потенциальном созревании происходящих из ЭПСК панкреатических прогениторов в инсулин-продуцирующие клетки, экспрессирующие основные факторы созревания р-клеток и способные оказывать обращающее действие на прогрессирование гипергликемии после их имплантации страдающим диабетом мышам и крысам [35, 36]. Некоторые недоработки данного подхода включают длительное созревание, которое, по сообщениям, продолжается от 2 до 3 мес, несогласованное формирование и функционирование р-клеток и потенциальную склонность к образованию тератом [26, 37]. Тем не менее первое проведенное у человека исследование, изучающее возможности человеческих ЭПСК по возмещению утраченных при СД1 р-клеток, на самом деле будет использовать методику имплантации панкреатических прогениторных клеток PDX1+, с размещением клеток в имплантированное под кожу иммуноизолирующее устройство.
В 2007 г. в своей фундаментальной статье Takahashi и соавт. [38] описали успешный опыт вирусного перепрограммирования человеческих фибробластов в человеческие ИПСК с использованием для этого 4 основных транс-крипторных факторов стволовых клеток: OCT3/4, SOX2, KLF4 и c-MYC. Данное открытие раскрыло перспективы для изоген-ной клеточной терапии, избегая таким образом осложнений, связанных с иммунным отторжением, а также обходя опре-
деленные этические ограничения, связанные с получением эмбриональных стволовых клеток человека. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки демонстрируют способность к дифференцировке и пролиферации, сходную с таковой у ЭПСК, и поэтому они были успешно использованы для создания in vitro клеточных кластеров, подобных островкам поджелудочной железы, сформированных из соматических клеток, способных к глюкозостимулированному выделению инсулина и к экспрессии основных факторов созревания р-клеток [39-42]. Более того, подход с использованием ИПСК использовался для создания специфических для данного заболевания ИПСК и инсулин-продуцирующих клеток из материала, полученного от пациентов, страдающих диабетом [39]. Таким образом, применение ИПСК дает дополнительные преимущества при осуществлении пациент-специфической клеточной терапии, а также предоставляет возможности для пациент-специфического моделирования заболевания и диагностики. При этом также остаются вопросы, касающиеся того, сохраняют ли р-клетки, произошедшие от полученных у страдающего диабетом пациента ИПСК, те характерные молекулярные нарушения, которые в конечном итоге приведут их к недостаточности функционирования и повторному аутоиммунному поражению р-клеток. Возможности применения ИПСК-индуцированной р-клеточной регенерации, направленной на предотвращение утраты р-клеток, по-прежнему входят в область интенсивных исследований [25].
Применение мезенхимальных стволовых клеток открывают еще одну потенциальную перспективу в производстве р-клеток для возмещения дефицита инсулина при диабете. МСК являются наиболее распространенными стволовыми клетками взрослых и могут быть получены из многих тканей организма, включая ткани протоков и ацинусов поджелудочной железы [43]. Применение МСК также позволяет избежать некоторых проблем этического характера, которые связаны с использованием ЭПСК. Однако до настоящего времени результаты доклинических исследований не подтвердили мнение о том, что МСК будут являться полноценным источником получения р-клеток, а для установления терапевтического потенциала МСК в области заместительной р-клеточной терапии необходимы дальнейшие исследования [24].
Клеточное перепрограммирование
Вышедшая недавно, выполненная преимущественно на мышиных моделях работа представляет обоснование возможности непосредственного перепрограммирования in vitro не-р-клеточных типов в направлении вырабатывающих и секретирующих инсулин линий. В ранних исследованиях была применена стратегия вынужденной эктопической экспрессии (обычно опосредованной аденовирусным переносчиком) факторов транскрипции, опосредующих ключевые звенья развития панкреатических р-клеток (например, PDX1, NGN3 и инсулин). Например, было показано, что вынужденная экспрессия PDX1 и NGN3 способствует выработке инсулина и частичному изменению в сторону р-клеточных линий у гепатоцитов и а-клеток поджелудочной
железы [44, 45]. Совсем недавно Zhou и соавт. [46] сообщили о перепрограммировании экзокринных клеток ацинусов в направлении р-клеточных линий in vivo, с использованием для этого доставки с помощью аденовирусного переносчика 3 ключевых факторов транскрипции (NGN3, PDX1 и MAFA), которые были внедрены непосредственно в экзокринную часть поджелудочной железы мыши. Эти вновь запрограммированные р-клетки экспрессировали ключевые маркеры развития р-клеток (например, GLUT2, GCK и NKX6-1), демонстрировали ультраструктурные характеристики зрелых р-клеток и снижали уровень гликемии после введения мышам стреп-тозоцина [46].
Применив альтернативный подход, TaLchai и соавт. [47] недавно сообщили о возможности перепрограммирования судьбы энтероэндокринных клеток кишечника в направлении образования р-клеточных линий путем клеточно-специфической делеции гена, кодирующего образование фактора FOXO1. В частности данная исследовательская группа зафиксировала, что разрушение FOXO1 в энтероэн-докринных клетках NGN3+ прогениторных популяций как у эмбриона, так и у взрослой особи стимулирует перепрограммирование кишечных клеток в направлении образования р-клеточных линий. Важно отметить, что указанные инсулин-продуцирующие клетки, происходящие из кишечного эпителия, характеризовались экспрессией факторов созревания р-клеток, способностью к глюкозостимулированному высвобождению инсулина, а также способностью снижать уровень гипергликемии после введения мышам стрептозоцина [47]. Результаты данного исследования дают основания полагать, что осуществленное через воздействие на генетические механизмы угнетение естественных, определяющих судьбу клетки программ транскрипции представляет собой альтернативный подход к управляемой дифференцировке клеточного развития в направлении образования р-клеточных линий. Хотя исследования по перепрограммированию и демонстрируют интригующий способ получения возможного источника новых р-клеток, терапевтический потенциал и долгосрочная реализуемость данного подходав качестве стратегии по возмещению недостатка р-клеток при диабете требует дальнейшего изучения.
Заключение
Регуляция секреции инсулина в ответ на изменение метаболических условий является комплексной и зависит от взаимодействия множества сигнальных систем. Более того, при условии правильной интеграции указанных сигналов, реакция р-клеток требует способности синтезировать и секретировать функционально полноценные молекулы инсулина. Результаты предпринимавшихся до настоящего времени усилий, направленных на извлечение пользы из текущих знаний о развитии клеток островковой части поджелудочной железы и о функционировании в р-клетках системы сопряжения «стимул-секреция», являются обнадеживающими, но в настоящий момент имеют довольно низкую клиническую значимость. Учитывая сказанное, понимание значительности поставленной перед нами задачи
является необходимым этапом пути в направлении разработки перспективной стратегии заместительной клеточной терапии для борьбы с заболеваниями, характеризующимися отсутствием или дисфункцией клеток островков поджелудочной железы.
Конфликт интересов
Статья содержит точку зрения авторов и не в обязательной мере отражает позицию Национального института здравоохранения.
Грантовая поддержка. Данная работа частично поддерживается за счет грантов DK98468 (A.M.), DK78646 (А.В.) и DK82396 (А.В.) Национального института здравоохранения.
Возможный конфликт интересов. Д-р Велла являлся консультантом Genentech, Inc.
Отдельные копии данной статьи и сброшюрованные материалы всего «Симпозиума по регенеративной медицине» доступны для приобретения на веб-сайте www. mayocLinicproceedings.org.
Грантовая поддержка. Данная работа частично поддерживается за счет грантов DK98468 (A.M.), DK78646 (А.В.) и DK82396 (A.B.) Национального института здравоохранения.
Возможный конфликт интересов. Д-р Велла являлся консультантом Genentech, Inc.
Способ участия. Чтобы заявить права на получение образовательного кредита, участники должны выполнить следующие условия:
1. Прочитать содержимое курса.
2. Пройти онлайн НМО-тестирование и оценку. Результат участника по НМО-тесту должен составлять не менее 80%. Разрешена 1 повторная попытка.
Посетите сайт www.mayocLinicproceedings.com, выберите сначала раздел «НМО» (CME), затем раздел «Статьи НМО» (CME articLes), чтобы найти там данную статью и получить доступ к работе онлайн. Сразу после успешного прохождения он-лайн-тестирования и оценки вы сможете загрузить и распечатать сертификат о получении кредита.
Расчетное время. Расчетное время для завершения работы с каждой статьей составляет приблизительно 1 ч.
Оборудование/программное обеспечение. PC или MAC с доступом в Интернет.
Дата выпуска. 01.04.2015.
Срок действия. До 31.03.2017 (По истечении срока действия предложение о получении кредита не будет действовать).
Политика конфиденциальности. http://www.mayocLinic.org/gLobaL/privacy.htmL.
Вопросы? Обратитесь по адресу: dLetcsupport@mayo.edu.
СВЕДЕНИЯ О ВЕДУШЕМ АВТОРЕ
Адриан Велла Vella) - Мй, Отдел эндокринологических исследований Клиники Майо, Рочестер, Миннесота, США Е-таИ: veLLa.adrian@mayo.edu
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Smushkin G., VeLLa A. Genetics of type 2 diabetes. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2010; VoL. 13 (4): 471-7.
2. Smushkin G., VeLLa A. What is type 2 diabetes? Medicine (Abingdon). 2010; VoL. 38 (11): 597-601.
3. ArbeLaez A.M., Xing D., Cryer P.E. et aL; Diabetes Research in ChiLdren Network (DirecNet) Study Group. BLunted gLucagon but not epinephrine responses to hypogLycemia occurs in youth with Less than 1 yr duration of type 1 diabetes meLLitus. Pediatr Diabetes. 2014; VoL. 15 (2): 127-134.
4. Cryer P.E. Mechanisms of hypogLycemia-associated autonomic faiLure in diabetes. N EngL J Med. 2013; VoL. 369 (4): 362-72.
5. Robertson R.P. IsLet transpLantation a decade Later and strategies for fiLLing a haLf-fuLL gLass. Diabetes. 2010; VoL. 59 (6): 1285-91.
6. Jung H.K., Choung R.S., Locke G.R. III et aL. The incidence, prevaLence, and outcomes of patients with gastroparesis in OLmsted County, Minnesota, from 1996 to 2006. GastroenteroLogy. 2009; VoL. 136 (4): 1225-33.
7. Rieck S., Bankaitis E.D., Wright C.V.E. Lineage determinants in earLy endocrine deveLopment. Semin CeLL Dev BioL. 2012; VoL. 23 (6): 673-84.
8. Stanger B.Z., Tanaka A.J., Melton D.A. Organ size is limited by the number of embryonic progenitor cells in the pancreas but not the liver. Nature. 2007; Vol. 445 (7130): 886-91.
9. Cabrera O., Berman D.M., Kenyon N.S., Ricordi C. et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; Vol. 103 (7): 2334-9.
10. Gradwohl G., Dierich A., LeMeur M., Guillemot F. neurogenin3 Is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; Vol. 97 (4): 1607-11.
11. Stoffers D.A., Zinkin N.T., Stanojevic V., Clarke W.L., Habener J.F. Pancreatic agenesis attributable to a single nucleotide deletion in the human IPF1 gene coding sequence. Nat Genet. 1997; Vol. 15 (1): 106-10.
12. Dohrmann C., Gruss P., Lemaire L. Pax genes and the differentiation of hormone-producing endocrine cells in the pancreas. Mech Dev. 2000; Vol. 92 (1): 47-54.
13. Malecki M.T., Jhala U.S., Antonellis A. et al. Mutations in NEUROD1 are associated with the development of type 2 diabetes mellitus. Nat Genet. 1999; Vol. 23 (3): 323-8.
14. Prentki M., Matschinsky F.M., Madiraju S.R.M. Metabolic signaling in fuel-induced insulin secretion. Cell Metab. 2013; Vol. 18 (2): 162-85.
15. CobeLLi C., DaLLa Man C., ToffoLo G., Basu R. et aL. The oral minimal model method. Diabetes. 2014; VoL. 63 (4): 1203-13.
16. Schuit F., Van LommeL L., Granvik M. et aL. b-CeLL-specific gene repression: a mechanism to protect against inappropriate or maLadjusted insuLin secretion? Diabetes. 2012; VoL. 61 (5): 969-75.
17. ButLer A.E., Janson J., Bonner-Weir S., RitzeL R. et aL. b-CeLL deficit and increased b-ceLL apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 2003; VoL. 52 (1): 102-10.
18. RitzeL R.A., ButLer A.E., Rizza R.A., VeLdhuis J.D., ButLer P.C. ReLationship between b-ceLL mass and fasting bLood gLucose concentration in humans. Diabetes Care. 2006; VoL. 29 (3): 717-8.
19. BernaL-Mizrachi E., KuLkarni R.N., Scott D.K., Mauvais-Jarvis F. et aL. Human b-ceLL proLiferation and intraceLLuLar signaLing part 2: stiLL driving in the dark without a road map. Diabetes. 2014; VoL. 63 (3): 819-31.
20. KuLkarni R.N., Mizrachi E.B., Ocana A.G., Stewart A.F. Human b-ceLL proLiferation and intraceLLuLar signaLing: driving in the dark without a road map. Diabetes. 2012; VoL. 61 (9): 2205-13.
21. BradLey A., Evans M., Kaufman M.H., Robertson E. Formation of germ-Line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma ceLL Lines. Nature. 1984; VoL. 309 (5965): 255-6.
22. Reubinoff B.E., Pera M.F., Fong C.Y., Trounson A., Bongso A. Embryonic stem ceLL Lines from human bLastocysts: somatic differentiation in vitro [pubLished correction appears in Nat BiotechnoL. 2000; VoL. 18 (5): 559. Nat BiotechnoL. 2000; VoL. 18 (4): 399-404.
23. Thomson J.A., Itskovitz-ELdor J., Shapiro S.S. et aL. Embryonic stem ceLL Lines derived from human bLastocysts. Science. 1998; VoL. 282 (5391): 1145-7.
24. Dominguez-BendaLa J., Lanzoni G., Inverardi L., Ricordi C. Concise review: mesenchymaL stem ceLLs for diabetes. Stem CeLLs TransL Med. 2012; VoL. 1 (1): 59-63.
25. HoLditch S.J., Terzic A., Ikeda Y. Concise review: pLuripotent stem ceLL-based regenerative appLications for faiLing b-ceLL function. Stem CeLLs TransL Med. 2014; VoL. 3 (5): 653-661.
26. OrLando G., GianeLLo P., SaLvatori M. et aL. CeLL repLacement strategies aimed at reconstitution of the b-ceLL compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 2014; VoL. 63 (5): 1433-44.
27. Schiesser J.V., WeLLs J.M. Generation of b ceLLs from human pLuripotent stem ceLLs: are we there yet? Ann NY Acad Sci. 2014; VoL. 1311: 124-37.
28. Green M.D., Chen A., Nostro M.C. et aL. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pLuripotent stem ceLLs. Nat BiotechnoL. 2011; VoL. 29 (3): 267-72.
29. Nostro M.C., Sarangi F., Ogawa S. et aL. Stage-specific signaLing through TGFb famiLy members and WNT reguLates patterning and pancreatic specification of human pLuripotent stem ceLLs. DeveLopment. 2011; VoL. 138 (5): 861-71.
30. PagLiuca F.W., MiLLman J.R., GurtLer M. et aL. Generation of functionaL human pancreatic b-ceLLs in vitro. CeLL. 2014; VoL. 159 (2): 428-439.
31. Rezania A., Bruin J.E., Arora P. et aL. ReversaL of diabetes with insuLin-producing ceLLs derived in vitro from human pLuripotent stem ceLLs. Nat BiotechnoL. 2014; VoL. 32 (11): 1121-33.
32. Basford C.L, Prentice K.J, Hardy A.B. et al. The functional and molecular characterisation of human embryonic stem cellderived insulinpositive cells compared with adult pancreatic beta cells. Diabetologia. 2012; Vol. 55 (2): 358-371.
33. Hrvatin S., O'Donnell C.W., Deng F. et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, b-celts. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; Vol. 111 (8): 3038-43.
34. Kelly O.G., Chan M.Y., Martinson L.A. et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2011; Vol. 29 (8): 750-6.
35. Kroon E., Martinson L.A., Kadoya K. et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucoseresponsive insulin-secreting celts in vivo. Nat Biotechnol. 2008; Vol. 26 (4): 443-52.
36. Rezania A., Bruin J.E., Riedel M.J. et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 2012; Vol. 61 (8): 2016 29.
37. Matveyenko A.V., Georgia S., Bhushan A., Butler P.C. Inconsistent formation and nonfunction of insulin-positive cells from pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells in athymic nude rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2010; Vol. 299 (5): E713 20.
38. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007; Vol. 131 (5): 861 72.
39. Kudva Y.C., Ohmine S., Greder L.V. et al. Transgene-free disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with type 1 and type 2 diabetes. Stem Cells Transl Med. 2012; Vol. 1 (6): 451 461.
40. Tateishi K., He J., Taranova O., Liang G., D'Alessio A.C., Zhang Y. Generation of insulin-secreting islet-like clusters from human skin fibroblasts. J Biol Chem. 2008; Vol. 283 (46): 31601 7.
41. Thatava T., Kudva Y.C., Edukulla R. et al. Intrapatient variations in type 1 diabetes-specific iPS cell differentiation into insulinproducing cells. Mol Ther. 2013; Vol. 21 (1): 228-39.
42. Thatava T., Nelson T.J., Edukulla R. et al. Indolactam V/GLP-1-mediated differentiation of human iPS cells into glucoseresponsive insulin-secreting progeny. Gene Ther. 2011; Vol. 18 (3): 283-93.
43. Baertschiger R.M., Bosco D., Morel P. et al. Mesenchymal stem cells derived from human exocrine pancreas express transcription factors implicated in beta-cell development. Pancreas. 2008; Vol. 37 (1): 75-84.
44. Wang A.Y., Ehrhardt A., Xu H., Kay M.A. Adenovirus transduction is required for the correction of diabetes using Pdx-1 or Neurogenin-3 in the liver. Mol Ther. 2007; Vol. 15 (2): 255-63.
45. Yang Y.P., Thorel F., Boyer D.F., Herrera P.L., Wright C.V. Contextspecific a-to-b-cell reprogramming by forced Pdx1 expression. Genes Dev. 2011; Vol. 25 (16): 1680-5.
46. Zhou Q., Brown J., Kanarek A., Rajagopal J., Melton D.A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to b-cells. Nature. 2008; 455 (7213): 627-32.
47. Talchai C., Xuan S., Kitamura T., DePinho R.A., Accili D. Generation of functional insulin-producing cells in the gut by Foxo1 ablation. Nat Genet. 2012; Vol. 44 (4): 406-12, S1.
