РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС ОСПОВАКЦИНЫ, ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЕЛАНОМЫ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

https://doi.org/10.17116/molgen20203802190

Рекомбинантный вирус осповакцины, перспективный для лечения меланомы

© Т.В. БАУЭР1, Т.В. ТРЕГУБЧАК1, А.З. МАКСЮТОВ1, О.С. ТАРАНОВ1, О.И. СОЛОВЬЕВА2, И.А. РАЗУМОВ2, Е.Л. ЗАВЬЯЛОВ2, Р.А. МАКСЮТОВ1, Е.В. ГАВРИЛОВА1

'Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; 2Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия

Резюме

Введение. Меланома — злокачественная опухоль, образующаяся при перерождении пигментных клеток, продуцирующих меланины, является наиболее агрессивной разновидностью онкологических заболеваний кожи и характеризуется высокой резистентностью к химиотерапевтическим препаратам, что обусловливает необходимость поиска альтернативных методов терапии данного заболевания. В настоящее время активно развиваются новые направления в терапии рака, одним из которых является онколитическая иммунотерапия, заключающаяся в применении вирусов в качестве онкоселек-тивных цитолитических агентов, способных стимулировать как опухоль-специфичный, так и неспецифичный иммунный ответ организма. Значительная доля современных научных работ посвящена повышению иммуностимулирующих свойств вирусов путем встройки в состав вирусных геномов генов, кодирующих белки-иммуномодуляторы или антигенные детерминанты, характерные для опухолевых клеток. Для меланомы идентифицировано наибольшее количество опухоль-ассо-циированных антигенов (ОАА), на основе которых ведут разработки противоопухолевых ДНК-вакцин. Иммуногенность и эффективность таких препаратов остаются на низком уровне. Проблемой в использовании ДНК-вакцин для лечения рака может быть несовершенный дизайн полиэпитопной конструкции, а также неэффективная доставка терапевтических молекул непосредственно в целевые клетки. Частичным решением данной проблемы является использование в качестве способа доставки искусственных иммуногенов онколитических вирусов.

Материал и методы. Рекомбинантный вирус осповакцины получен при помощи метода временной доминантной селекции. Цитолитическую эффективность полученного вируса оценивали в МТТ-тесте. Онколитическую эффективность полученного вируса оценивали с помощью мышиной модели ксенографтов с использованием злокачественных клеток SK-Mel-28. Результаты и обсуждение. В данной работе на основе вируса осповакцины штамма L-IVP был получен рекомбинантный вирус L-IVP_oncoM, представляющий собой онколитический вирус, обеспечивающий доставку противораковых терапевтических генов в клетки организма. С этой целью в геном вируса были встроены ген, кодирующий гранулоцит-макрофа-гальный колониестимулирующий фактор, и искусственный ген, кодирующий полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующихся в клетках меланомы. Данные инсерции проведены в районе генов, кодирующих тимидинкиназу (J2R), и вирусный фактор роста (C11L) соответственно. Изучены свойства L-IVP_oncoM в экспериментах in vitro на культурах клеток различного генеза и in vivo в мышиной модели ксенографтов.

Заключение. Проведены основные эксперименты по оценке биологических свойств полученного L-IVP_oncoM, которые являются необходимыми для характеризации онколитического вируса.

Ключевые слова: меланома, онколитическая иммунотерапия, опухоль-ассоциированный антиген, вирус осповакцины, ксе-нографт.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:

Бауэр Т.В. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-4954-9905 Трегубчак Т.В. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0001-9608-2044 Максютов А.З. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-4027-8299 Таранов О.С. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-6746-8092 Соловьева О.И. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-8218-2690 Разумов И.А. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-6756-1457 Завьялов Е.Л. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-9412-3874 Максютов Р.А. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0003-1314-281X Гаврилова Е.В. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-7118-5749 Автор, ответственный за переписку: Бауэр Т.В. — e-mail: [email protected]

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Бауэр Т.В., Трегубчак Т.В., Максютов А.З., Таранов О.С., Соловьева О.И., Разумов И.А., Завьялов Е.Л., Максютов Р.А., Гаврилова Е.В. Рекомбинантный вирус осповакцины, перспективный для лечения меланомы. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020;38(2):90-98. https://doi.org/10.17116/molgen20203802190

Recombinant vaccinia virus perspective for the treatment of melanoma

© T.V. BAUER1, T.V. TREGUBCHAK1, A.Z. MAKSYUTOV1, O.S. TARANOV1, O.I. SOLOVIEVA2, I.A. RAZUMOV 2, E.L. ZAVJALOV2, R.A. MAKSYUTOV1, E.V. GAVRILOVA1

1State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being, Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia;

2The Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics The Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia Abstract

Introduction. Melanoma aggressive and fatal form of skin cancer that originates in the pigment-producing cells (melanocyte), have a high mortality rate due to the resistance of most tumors to chemotherapy. This is a reason to explore alternate therapies for this disease. One of cancer treatments that has seen intensive development recently is oncolytic immunotherapy. The essence of this approach is that use of viruses as tumor-specific cytolytic agents capable of stimulating both the tumor-specific and non-specific immune response. There is considerable research devoted to improving the immunostimulating properties of viruses by insert into the viral genome the genes encoding immunomodulatory proteins or the artificial tumor-specific polyepitopic immunogens. The highest number of tumor-associated antigens was identified for melanoma, on the basis of which anti-tumor DNA vaccines are developed. Immunogenicity and efficacy of such drugs remain low. The problem with the use of DNA vaccines for treating cancer may be the incorrect design of the polyepitopic construct, as well as the inefficient delivery of therapeutic molecules directly to the target cells. A partial solution to this problem may be use of oncolytic viruses as a vector to deliver artificial immunogens. Materials and methods. MTT test, methods of transient dominant selection, murine xenograft model using malignant cells SK-Mel-28. Results and discussion. In this study, a recombinant L-IVP_oncoM virus was obtained on the basis of the vaccinia virus strain L-IVP, which is an oncolytic virus that delivers anticancer therapeutic genes to the cells of the body. For this purpose, a gene encoding GM-CSF and an artificial gene encoding a polyepitopic immunogen consisting of epitopes of antigens over-expressed in melanoma cells were inserted into the genome of the virus. These insertions were performed in the region of the genes encoding thymidine kinase (J2R) and viral growth factor (C11L), respectively. The properties of L-IVP_oncoM were studied in a series of in vitro/in vivo experiments.

Conclusion. The basic experiments on the evaluation of the biological properties of the obtained L-IVP_oncoM, which are necessary for the characterization of the oncolytic virus, have been carried out.

Keywords: melanoma, oncolytic immunotherapy, tumor-associated antigen, vaccinia virus, xenograft. INFORMATION ABOUT AUTHORS:

Bauer T.V. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-4954-9905 Tregubchak T.V. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0001-9608-2044 Maksyutov A.Z. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-4027-8299 Taranov O.S. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-6746-8092 Solovieva O.I. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-8218-2690 Razumov I.A. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-6756-1457 Zavjalov E.L. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-9412-3874 Maksyutov R.A. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0003-1314-281X Gavrilova E.V. — e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-7118-5749 Corresponding author: Bauer T.V. — e-mail: [email protected]

TO CITE THIS ARTICLE:

Bauer TV, Tregubchak TV, Maksyutov AZ, Taranov OS, Solovieva OI, Razumov IA, Zavjalov EL, Maksyutov RA, Gavrilova EV. Recombinant vaccinia virus perspective for the treatment of melanoma. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2020;38(2):90-98. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen20203802190

Введение

Во всем мире ежегодно возрастает заболеваемость меланомой, по аналитическим данным, прогнозируемый ежегодный прирост новых случаев заболевания составляет более 87 тыс. [1]. При этом в последнее десятилетие наблюдается положительная динамика по увеличению средней выживаемости пациентов больных меланомой — в 2011 г. данный показатель составлял 9 мес, в 2018 г. прогнозируемый показатель — 2 года [2]. Данное явление в значительной степени обусловлено введением в клиническую практику средств иммунотерапии [3]: с 2011 г. FDA и EMA одобрили новые препараты для лечения меланомы, в том числе антитела против CTLA-4 ipilimumab (Yervoy), антитела против PD-1 nivolumab (Opdivo), пембролизумаб (Keytruda), онколитический генетически модифицированный вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) Talimogenelaherparepvec (T-VEC, Imlygic), онколитиче-

ский рекомбинантный вирус осповакцины (ОпеоУех), что стало большим достижением в области терапии злокачественных новообразований при меланоме.

Среди активно развивающихся методов иммунотерапии выделяют онколитическую иммунотерапию, заключающуюся в применении вирусов, обладающих естественным тропизмом к неопластическим клеткам, либо с генетическими модификациями, приводящими к повышению антиканцерогенных свойств самого вируса и регуляции иммунной системы пациента [4]. Опухолевые клетки не имеют мощного противовирусного ответа, что делает их чувствительными к вирусной инфекции, которая приводит к регрессии опухоли через 2 разных механизма: лизис опухолевых клеток и стимуляцию противоопухолевого иммунного ответа [5].

Была показана эффективность онколитических вирусов не только в качестве литического агента,

но и в качестве мощного стимулятора противоопухолевых процессов, опосредованных иммунной системой [6]. Онколитический реовирус способен устранять метастазы в лимфатическом узле и селезенке. На примере линии клеток мышиной меланомы B16Ova показано, что именно иммунные ответы, вызванные вирусом, а не опосредованный вирусом он-колиз, имеют решающее значение для противоопухолевой эффективности реовируса. Также обнаружено, что локальное введение онколитического вируса болезни Ньюкасла у иммунокомпетентных мышей может значительно замедлить рост опухолей.

Важно отметить, что в некоторых случаях введение инактивированного вируса приводит к регрессии опухолей в иммунокомпетентных моделях животных, подчеркивая влияние иммунной системы на опосредованный вирусом противоопухолевый эффект [7, 8]. Поэтому онколитические вирусы рассматриваются не только в качестве агента, лизирующе-го опухолевые клетки, но и в качестве иммуномоду-лирующего препарата, либо способа доставки иммунотерапевтических молекул.

Цель исследования — получение онколитического вируса на основе вируса осповакцины (ВОВ) штамм L-IVP, в геном которого дополнительно введены гены, кодирующие гранулоцит-макрофагальный коло-ниестимулирующий фактор (GM-CSF) и искусственный полиэпитопный иммуноген, а также изучение свойств полученного вируса in vitro и in vivo.

Материал и методы

Штамм Л-ИВП ВОВ получен из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотреб-надзора.

Эукариотические культуры клеток 4647 и CV-1 получены из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Культуры клеток SW 620, A 431, OVCAR-3, C33A, MDA-MB-231, DU-145, SK-Mel-5, SK-Mel-28 получены из коллекции Института цитологии и генетики СО РАН.

Предсказание эпитопов проводили на сервере IEDB с использованием метода ANN.

Вестерн-блот анализ. Вестерн-блот анализ проводили в соответствии со стандартным протоколом [9]. Осуществляли электроперенос исследуемых белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлоз-ную мембрану с помощью прибора фирмы «BioRad» (США). Центры неспецифического связывания блокировали инкубацией нитроцеллюлозной мембраны в растворе 0,5% бычьего сывороточного альбумина в PBST-буфере. В качестве первичных антител использовали иммунную сыворотку, полученную иммунизацией кроликов целевыми реком-бинантными белками, полученными в прокариоти-

ческой системе экспрессии E. coli (GM-CSF, полиэпитопный иммуноген). Конъюгат пероксидазы хрена с антикроличьим иммуноглобулином козы (BioRad, США) использовали в разведении 1:5000. Детекцию иммунных комплексов проводили окрашиванием свежеприготовленным раствором 4-хлор-1-нафтол («Aldrich», США) в 0,1 М фосфатно-цитратном буфере рН 4,7 с концентрацией 500 мкг/мл, содержащем 0,0015% перекиси водорода.

МТТ-тест. Сравнительное изучение цитолитиче-ских свойств вариантов ВОВ проводили, используя МТТ-тест. 50% монослой клеток заражали изучаемыми вирусами с множественностью заражения 0,001 БОЕ/кл, 0,01 БОЕ/кл, 0,1 БОЕ/кл, 1 БОЕ/кл, 10 БОЕ/кл. Через 72 ч добавляли 5 мг/мл МТТ (Sigma, США), и инкубировали 4 ч при 37 °С, после чего добавляли 200 мкл диметилсульфоксида и инкубировали в течение 1 ч. Затем измеряли оптическую плотность спектрофотометрически при длине волны 540 нм на приборе Multiskan FC (Thermo Scientific, США) и определяли дозы исследуемых вирусов, при которых жизнеспособными остаются 50% клеток (ЦПД50).

Оценка ростовых свойств L-IVP _oncoM. Для изучения динамики роста L-IVP_oncoM 90% монослой клеток линий 4647 и CV-1, полученный на 6-луноч-ных планшетах, инфицировали с множественностью заражения 1 БОЕ/клетка в трех повторах с инкубацией 0, 24, 48, 72 ч при 37 °С в условиях 5% CO2. После трехкратного замораживания-оттаивания содержащие вирус препараты титровали методом бляшек в монослое клеток CV-1. Помимо линии клеток CV-1 использовали линию 4647, которая аттестована для производства иммунобиологических препаратов.

Изучение онколитических свойств L-IVP_oncoM in vivo. Для получения солидных подкожных опухолей суспензию клеток SK-Mel-28 в количестве 1-107 клетка/мышь (объем 100 мкл) вводили самкам линии SCID (всего 26 животных) подкожно в область правой лопатки и вычисляли объем опухоли (V) по формуле: V=(a*b2)/2, где a — наибольший диаметр опухоли, b — наименьший диаметр опухоли [10].

Для оценки онколитического эффекта L-IVP_ oncoM по достижению объема опухоли 200 мм3 вводили вирусный материал интротуморально в дозе 1107 БОЕ/мышь в 100 мкл физиологического раствора («Биолот», Россия), в качестве контроля вводили 100 мкл физиологического раствора.

Сравнительную оценку изменения объема опухоли проводили каждые 3 сут от даты инъекции вирусного материала. Забой мышей в количестве 2 головы на точку проводили на 4, 8, 12, 16 и 32-е сутки после введения препаратов и производили забор органов (селезенка, печень, легкие, почки, яичники, кровь) для оценки распределения вируса по жизненно важным органам. На 47-е сутки выводили всех оставшихся животных из эксперимента.

Гистологические исследования проводили согласно протоколу [11].

Результаты и обсуждение

Получение рекомбинантного вируса L-IVP_oncoM.

При помощи биоинформатического анализа была проведена оптимизация и конструирование полиэпи-топного иммуногена, состоящего из эпитопов ОАА, для которых согласно литературным данным показан высокий уровень экспрессии в опухолевых клетках при меланоме. На первом этапе работы была проведена оптимизация состава эпитопов полиэпитопного имуногена и подобраны спейсерные последовательности, обеспечивающие доставку целевой конструкции в клетки организма для последующей эффективной презентации иммунной системе.

Оптимизацию состава полиэпитопного иммуногена проводили при использовании данных, опубликованных в реферируемых журналах и базах данных. В ходе работы были выбраны аллельные варианты молекул MHC I класса HLA-A*0201 — как наиболее распространенные и изученные в человеческой популяции [12]. Были отобраны пептиды, для которых предсказанное значение pIC50 (характеристика аффинности взаимодействия пептида с молекулой MHC) выше, чем 6,8. Согласно литературным данным значение IC50<50 нМ соответствует высокоэффективному связыванию, от 50 до 500 — низкоэффективному. Из-за клональной селекции для эпитопов с IC50<50 нМ отсутствуют распознающие их T-клетки, поэтому для каждого антигена было выбрано несколько эпитопов. Таким образом, в состав конструкции вошли эпитопы, принадлежащие к семействам: NY-ESO-1, MART-1, MADE-A1, MAGE-A3, MAGE-C1, gp-100, 1уго8ша8е, TRP-2, TRAG-3. Рассчитанная полиэпитопная конструкция для улучшения протеосомной деградации и дополнительной стимуляции цитотоксического ответа на все включенные в состав конструкции антигенные детерминанты на N-конце содержит убиквитин с замененной С-концевой аминокислотой (Gly76-Val) [13].В качестве спейсера на С-конце ЦТЛ-эпитопов расположен дипептид «AD» [14]. Для лучшего узнавания на С-конец конструкции добавлены универсальные Т-хэлперные эпитопы (p2, PADRE), которые отделены друг от друга спейсерным трипепти-дом «ARY».

Затем рестриктазно-лигазным методом получали плазмиду интеграции, содержащую последовательность ДНК, кодирующую искусственный имму-ноген, гомологичные участки вирусного генома, в район которого запланирована целевая встройка, а также ген gpt, кодирующий ксантин-гуанин-фос-форибозилтрансферазу E. coli. Наличие гена gpt в составе плазмиды интеграции обеспечивает жизнеспособность рекомбинантных вариантов вируса при

встройке плазмиды в состав вирусного генома на среде, содержащей микофеноловую кислоту.

Методом временно доминантной селекции [15] на основе полученного ранее вируса Е-1УР_ТК(-)_ GM-CSF(+)_A34R(D110N_K151E) был получен он-колитический ВОВ, содержащий в своем геноме ген, кодирующий полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов опухолевых антигенов, экспресси-рующихся опухолевыми клетками при меланоме (Е-ГУР_опсоМ).

Была подтверждена продукция полиэпитопного иммуногена и GM-CSF в составе вирусного генома при помощи вестерн-блот анализа (рис. 1).

Ростовые свойства L-ГVP_oncoM. Проведенный эксперимент не выявил значимых различий в ростовых характеристиках исследуемого рекомбинантно-го Е-ГУР_опсоМ в сравнении с исходным вариантом вируса в культуре клеток СУ-1, 4647 (рис. 2).

Оценка цитолитической активности L-ГVP_oncoM на раковых культурах клеток различного генеза. Выявлено, что линии клеток SW 620, А431, ОУСАЯ-3, С33А, MDA-MB-231, DU-145, SK-Mel-5, SK-Mel-28 чувствительны к исследуемым вариантам ВОВ (рис. 3).

ЦПД50 исследуемых вариантов ВОВ в среднем варьирует в пределах 1—5 БОЕ/клетка, что соответствует значению ЦПД50 для культуры клеток СУ-1, которая является высокочувствительной к ВОВ.

Онколитическое действие L-ГVP_oncoM. Оценку эффективности онколитического действия вируса оценивали в модели ксенографтов опухоли человека на иммунодефицитных мышах линии SCГD, образованных клетками меланомы человека SK-Mel-28. Данная клеточная линия характеризуется высокой эффективностью формирования опухолевого узла и его активным ростом.

Полученные данные свидетельствуют о выраженном замедлении опухолевого роста у животных экспериментальной группы по сравнению с животными контрольной группы (рис. 4). Достоверные различия наблюдаются на 45-е сутки после введения препарата в опухолевый узел.

Для изучения изменений в опухолевом узле, вызванных Е-ГУР_опсоМ, проводили гистологическое исследование (рис. 5). Опухолевый трансплантат SK-Mel-28 в контрольной группе характеризуется наличием тонкой капсулы, развитой сети новообразованных сосудов и небольших редких зон некрозов опухоли. Большая часть среза опухолевого узла представляет собой обширные поля гемо- и плазморра-гии с включением клеток опухоли.

У животных обеих опытных групп в отношении некротических изменений опухолевой ткани морфологическая картина схожа. Исключение наблюдалось, начиная с 8-х суток после введения Е-ГУР_ опсоМ, когда у исследованных животных обнаруживались очаги некроза опухолевой ткани (см. рис. 4, в, г).

Рис. 1. Результаты вестерн-блот анализов лизатов клеток линии ^-1, зараженных L-IVP_oncoM.

а — анализ на наличие продукции полиэпитопного иммуногена в составе вирусного генома. М — маркер молекулярной массы белков; 1 — укороченный вариант полиэпитопного иммуногена, полученного в прокариотической системе экспрессии (30,7 кД); 2— лизат клеток ОУ-1, зараженных Л-ИВП_опсоМ (66 кД); 3 — супернатант клеток ОУ-1, зараженных Л-ИВП_опсоМ; 4-лизат клеток CV-1; б — анализ на наличие продукции GM-CSF в составе вирусного генома. М — маркер молекулярной массы белков, 1 — лизат клеток ОУ-1, зараженных Ь-ГУР_опсоМ (23 кД); 2 — супернатант клеток СУ-1, зараженных Ь-1УР_опсоМ; 3 — белок GM-CSF (23 кД); 4 — лизат клеток СУ-1, 5супернатант клеток СУ-1.

Рис. 2. Динамика роста L-IVP_oncoM на культурах клеток 4647 и ^-1 в сравнении с исходным вариантом вируса, не содержащего целевых инсерций и замен (L-IVP 5 Ы).

По оси абсцисс указано время инкубации монослоя клеток после заражения вирусом, ч; по оси ординат — титр вируса, ^ БОЕ/мл.

Также среди клеточного детрита опухоли обнаружены структуры, морфологически схожие со структурами, возникающими на различных этапах морфогенеза вирусов семейства Orthopoxvirus (ви-росома) (см. рис. 4, а, б). В каждом случае исследовали около 200 профилей клеток. В основном репродукция наблюдалась в клетках SK-Mel-28, что свидетельствует об избирательной репликации исследуемого вируса в клетках опухоли. Также это подтверждают результаты титрования 10% гомоге-натов опухолей, где по мере роста опухоли сохранялся титр вирусных частиц в пределах 104— 105 БОЕ/мл на протяжении всего времени эксперимента.

Частота спонтанной регрессии метастатической меланомы, включающая полную и частичную клиническую ремиссию, составляет, по данным разных авторов, от 0,25 до 1,0% [16]. Клинические исследования свидетельствуют о корреляции регрессии меланомы и активации опухоль-специфичных CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов, которые обнаруживают в периферической крови и метастазах. Их активация происходит за счет гиперэкспрессии ОАА на поверхности неопластических клеток. В этой связи в настоящее время появляется все больше исследований по изучению противоопухолевых препаратов, активирующих Т-клеточный иммунный ответ.

Рис. 3. Определение полулетальной дозы вариантов ВОВ для раковых культур клеток различного генеза (и.ПД50 — доза вируса, лизирующая 50% клеток в лунке 96-луночного планшета через 72 ч после инфицирования).

По оси абсцисс расположены культуры клеток, используемых в эксперименте; по оси ординат — значения ЦПД50, БОЕ/клетка.

Рис. 4. Динамика изменения объемов опухолей при введении ЫУР_опсоМ и физиологического раствора.

* — различия достоверны прир<0,025. По оси абсцисс указано время, прошедшее после введения препарата в опухолевый узел, сут; по оси ординат — отношение объемов опухоли (экспериментальный/исходный).

В данной работе нами при помощи метода временной доминантной селекции был получен онко-литический ВОВЬ-1УР_опеоМ, содержащий в своем геноме ген, кодирующий полиэпитопный иммуно-ген, состоящий из эпитопов опухолевых антигенов, экспрессирующихся клетками меланомы. Рекомби-нантный ВОВ Ь-ТУР_опеоМ был получен на основе

ВОВ L-IVP_TK(-)_GM-CSF(+)_A34R(D110N_ К151Е) (неопубликованные данные), характеризующегося нарушенным геном, кодирующим тимидин-киназу, в район которого встроен ген, кодирующий GM-CSF. Кроме того, данный вирус характеризуется повышенной способностью образовывать внеклеточные оболочечные вирионы, за счет введенных на-

Рис. 5. Гистологическое исследование ткани опухолевого узла после введения L-IVP_oncoM в дозе 107 БОЕ/мышь.

а — вирусная фабрика, незрелый и зрелый внутриклеточный ВОВ в клетках опухолевого узла; б — незрелый ВОВ; в — очаги некроза опухолевой ткани через 8 сут после введения Ь-ГУР_опсоМ (окрашевание гематоксилином и эозином); г — клетки опухолевого узла на фоне обширных зон кровоизлияния (окрашивание гематоксилином и эозином).

ми ранее нуклеотидных замен в гене Л34Я, приводящих к аминокислотным заменам Б110М и К151Е в мембранном гликопротеине Л34 [17].

Предположительный механизм действия данного вируса заключается в синергетическом эффекте онколитических и иммуностимулирующих свойств. Стратегия является уникальной: в настоящее время не существует ни одной кандидатной противоопухолевой терапии на основе онколитического вируса, экспрессирующего полиэпитопные конструкции. Использование искусственных полиэпитопных конструкций нацелено на стимуляцию высокого уровня иммунного ответа не только на доминантные, но и на субдоминантные эпитопы опухоль-ассоциирован-ных антигенов (ОАА). Для лучшего представления опухоль-специфичных эпитопов иммунной системе и исправления цитокинового дисбаланса в микроокружении опухоли в состав ВОВ одновременно встроен ген, кодирующий GM-CSF. Для обеспечения более высокой эффективности репликации вируса в опухолевых клетках дополнительно инактиви-рованы гены ВОВ, кодирующие тимидинкиназу и ви-

русный ростовой фактор. Селективность при этом будет обеспечиваться наличием в опухолевых клетках, в отличие от здоровых клеток организма, высоких уровней клеточной тимидинкиназы и различных ростовых факторов. Для эффективного распространения вируса по организму с целью усиления онколитического потенциала ВОВ относительно метастазов полученный вирус содержит ген, кодирующий гликопротеин A34 с двумя нуклеотидными заменами K151E и D110N. Данные замены увеличивают эффективность формирования внеклеточных оболочеч-ных вирионов, которые способны обеспечить большую эффективность распространения вируса в межклеточном пространстве и по кровеносному руслу в целом, так как обладают низкой иммуноген-ностью.

Следует заметить, что в настоящее время является затруднительной проверка биологических эффектов, опосредованных экспрессией полиэпитопной конструкции в составе вирусного генома (в том числе GM-CSF) в экспериментальных моделях in vivo, так как дизайн конструкции производился исходя

из последовательностей ОАА человека. Оценку индукции опухоль-ассоциированного иммунного ответа через стимуляцию CD4+ и CD8+ Т-клеток возможно будет осуществить только на стадии клинических исследований.

Подходы к онкотерапии, основывающиеся на использовании биологических эффектов GM-CSF и применении ДНК-вакцин, содержащих ОАА, активно развиваются, что свидетельствует о перспективности использования данных белков либо кодирующих их генов в составе вектора доставки, в случае данной работы — использование ВОВ.

Таким образом, на первом этапе работы по ха-рактеризации полученного вируса L-IVP_oncoM необходимо провести эксперименты in vitro, демонстрирующие биологические свойства вируса, для дальнейшей возможности проведения доклинических и клинических исследований.

Поскольку встройка целевой последовательности производилась в участок генома, ответственного за ростовые свойства вируса, это могло повлиять на репродукцию вируса на культурах клеток. Эксперимент по изучению ростовых свойств L-IVP_on-coM был проведен относительно исходного клоно-вого варианта ВОВ, не содержащего встройки генов, кодирующих GM-CSF и полиэпитопный иммуноген.

В ходе эксперимента не выявлено достоверно значимых различий между ростовыми свойствами Л-ИВП_опсоМ и L-IVP 5cl. Это свидетельствует о том, что проведенные модификации вирусного генома не повлияли на его репродукцию в эукариоти-ческих культурах клеток 4647 и CV-1, что позволит в дальнейшем использовать данные клетки для наработки рекомбинантного вируса.

Наличие продукции полиэпитопного иммуноге-на и GM-CSF в составе вирусного генома свидетельствует о способности данных белков продуцироваться в эукариотических клетках при попадании в них вирусного вектора, содержащего гены, кодирующие GM-CSF и полиэпитопный иммуноген.

Кроме того, при помощи МТТ-теста нами была изучена чувствительность раковых культур клеток SW 620, A431, OVCAR-3,C33A, MDA-MB-231, DU-145, SK-Mel-5, SK-Mel-28 к полученному L-IVP_oncoM.

Выявлено, что линии клеток, используемые в эксперименте, чувствительны к исследуемым вариантам ВОВ, что свидетельствует о широком тропизме L-IVP_oncoM в отношении опухолевых клеток человека различного генеза. Данное свойство полученного вируса может оказать положительный эффект при терапии метастазирующих форм меланомы, чтов дальнейшем требует дополнительного изучения.

Ключевым требованием для улучшения результатов исследований препаратов против меланомы является применение моделей, повторяющих биологические и молекулярные характеристики заболевания

человека. Формирование у иммунодефицитных мышей ксенотрансплантантов на основе культуры раковых клеток человека позволяет частично смоделировать состояние онкопатологии и оценить онколи-тический потенциал вируса [18].

Для формирования ксенотрансплантантов была выбрана культура клеток меланомы человека SK-Mel-28, которая обладает чувствительностью к изучаемому ВОВ, что было подтверждено результатами МТТ-теста.

Полученные данные in vivo свидетельствуют о выраженном замедлении опухолевого роста у животных экспериментальной группы по сравнению с животными контрольной группы, что подтверждают результаты гистологического исследования, где обнаружена продукция исследуемого вируса в опухолевых клетках, а также участки разрушения опухолевой ткани. Вероятно, некрозы в опухолевом узле вызваны не только действием вируса, но и нарушенной трофикой клеток вследствие активной пролиферации и недостаточной скорости роста кровеносных сосудов.

Полная редукция опухолевого узла не была достигнута, вероятно, вследствие активной пролиферации клеток SK-Mel-28 и однократной инъекции вируса. В дальнейшем необходимо провести эксперименты для подбора наиболее эффективной дозы препарата, количества инъекций, а также временных промежутков между инъекциями.

Заключение

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что, возможно, ключевую роль в механизме действия онколитических вирусов играет не вирус-опосредованный цитодеструктивный эффект, а именно иммуностимулирующий эффект. При заражении вирусом происходит изменение иммунного статуса организма, в том числе изменяется профиль продукции цитокинов, ростовых факторов и др., что может приводить к устранению опухоль-ассоциированной иммуносупрессии.

Полученные нами данные в экспериментах in vitro и in vivo свидетельствуют о перспективности использования вируса L-IVP_oncoM в качестве онколити-ческого агента, иммуностимулирующие свойства которого будут исследованы в дальнейшем.

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №16-15-10101).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare that they have no competing interests.

Соблюдение этических стандартов. Все применимые международные, национальные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Society AC. Cancer Facts & Figures. Atlanta, GA. 2017.

2. Luke JJ, Flaherty KT, Ribas A, Long GV. Targeted agents and immunotherapies: optimizing outcomes in melanoma. Nature reviews Clinical oncology. 2017;14:463-482.

3. Axelrod ML, Johnson DB, Balko JM. Emerging biomarkers for cancer immunotherapy in melanoma. Seminars in Cancer Biology. 2018;52:207-215.

4. Kaufman HL, Kohlhapp FJ, Zloza A. Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs. Nat Rev Drug Discov. 2015;14(9):642-662.

5. Ricca JM, Oseledchyk A, Walther T, Liu C, Mangarin L, Merghoub T. et al. Pre-existing Immunity to Oncolytic Virus Potentiates Its Immunotherapeutic Efficacy. Molecular Therapy. 2018;26:1008-1019.

6. Prestwich RJ, Ilett EJ, Errington F, Diaz RM, Steele LP, Kottke T, et al. Immune-mediated antitumor activity of reovirus is required for therapy and is independent of direct viral oncolysis and replication. Clin Cancer Res. 2009;15(13):4374-4381.

7. Kurooka M, Kaneda Y. Inactivated Sendai Virus Particles Eradicate Tumors by Inducing Immune Responses through Blocking Regulatory T Cells. Cancer Res. 2007;1:227-236.

8. Chaurasiya S, Chen NG, Fong Y. Oncolytic viruses and immunity. Current Opinion in Immunology. 2018;51:83-90.

9. Burnette WN. «Western blotting»: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulpate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 1981;112:195-132.

10. Siegel R, Ma J, Zou Z, Jemal A. Cancer statistics 2014. CA Cancer J Clin. 2014;64:9-29.

Поступила в редакцию 16.11.18 Received 16.11.18 После доработки 18.03.19 Revised 18.03.19 Принята к публикации 18.04.19 Accepted 18.04.19

11. Sergeev AA, Kabanov AS, Bulychev LE, Sergeev AA, Pyankov OV, Bodnev SA, et al. The Possibility of Using the ICR Mouse as an Animal Model to Assess Antimonkeypox Drug Efficacy. TransboundEmergDis. 2016;63:419-430.

12. Gonzälez-Galarza FF, Takeshita LY, Santos EJ, Kempson F, Maia MH, et al. Allele frequency net 2015 update: new features for HLA epitopes, KIR and disease and HLA adverse drug reaction associations. Nucleic Acids Res. 2014;43:784-788.

13. Duan X, Hisaeda H, Shen J, Tu L, Imai T, Chou B, et al. The ubiquitin — proteasome system plays essential roles in presenting an 8-mer CTL epitope expressed in APC to corresponding CD8+ T cells. Int Immunol. 2006;18:679-687.

14. Seyed N, Taheri T, Vauchy C, Dosset M, Godet Y, Eslamifar A, et al. Im-munogenicity Evaluation of a Rationally Designed Polytope Construct Encoding HLA-A*0201 Restricted Epitopes Derived from Leishmania major Related Proteins in HLA-A2/DR1 Transgenic Mice: Steps toward Polytope Vaccine. PLoS ONE. 2014;9(10):e108848.

15. Falkner FG, Moss B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J Virol. 1990;64:3108-3111.

16. Cizkova J, Sinkorova Z, Strnadova K, Cervinkova M, Horak V, Sinkora J, et al. The role of aß T-cells in spontaneous regression of melanoma tumors in swine. Developmental & Comparative Immunology. 2018;92:60-68.

17. Smith GL, Vanderplasschen A, Law M. The formation and function of extracellular enveloped vaccinia virus. General Virology. 2002;12:2915-2931.

18. Saleh J. Murine models of melanoma. Pathology — Research and Practice. 2018;214:1235-1238.