CC BY
54
https://doi.org/10.17116/molgen20193702183
Таргетная терапия глиобластомы человека с использованием онколитического потенциала парвовируса и аттенуированных штаммов вируса осповакцины
А.В. ТКАЧЕВА1, Г.Ф. СИВОЛОБОВА1, А.А. ГРАЖДАНЦЕВА1, О.Б. ШЕВЕЛЕВ2, И.А. РАЗУМОВ2, Е.Л. ЗАВЬЯЛОВ2, В.Б. ЛОКТЕВ1, Г.В. КОЧНЕВА1
1ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, 630559, Кольцово, Россия; 2ФГБУН «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики» СО РАН, 630090, Новосибирск, Россия
РЕЗЮМЕ
Вирус осповакцины и парвовирус крыс Н-1 в настоящее время используются для создания препаратов, которые продемонстрировали свою эффективность против ряда опухолей человека. В доклинических исследованиях было показано, что главным фактором, ответственным за онколитическую активность парвовирусов, является белок NS1, причем опухолевые клетки мозга оказались особенно уязвимы к его прямому цитотоксическому действию. Мы использовали встройку гена NS1 с целью направленной модификации двух аттенуированных штаммов вируса осповакцины для виротерапии глио-бластомы: VV-NS1-dGF и MVA-NS1. Рекомбинант VV-NS1-dGF был сконструирован на основе репликативно-компетент-ного штамма Л-ИВП, аттенуированного путем делеции гена вирусного ростового фактора. MVA-NS1 сконструирован на основе высокоаттенуированного штамма MVA, который является репликативно-некомпетентным для клеток млекопитающих. Экспрессия трансгена NS1 значимо усиливает литическую активность обоих рекомбинантных вирусов в отношении клеток глиобластомы U87MG in vitro независимо от уровня аттенуации исходных штаммов вируса. Однако в экспериментах in vivo рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF более эффективно разрушает подкожные ксенографты клеток U87MG у мышей линии Nu/Nu по сравнению со штаммом MVA-NS1 при однократном введении вирусов в район опухоли. Оба рекомбинантных штамма избирательно размножаются в опухолевых клетках, однако репликативная активность штамма VV-NS1-dGF выше, что обеспечивает его быстрое накопление в ксенографтах и их последующую деструкцию. В орто-топической модели установившейся глиобластомы U87MG продемонстрированы увеличение продолжительности жизни мышей и значимое уменьшение объема опухолей при системном введении штамма VV-NS1-dGF. Полученные данные показывают, что рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF обладает хорошим терапевтическим потенциалом в отношении глиобластомы человека.
Ключевые слова: вирус осповакцины, парвовирус, рекомбинант, аттенуация, онколитические вирусы, белок NS1, глио-бластома.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ: Ткачева А.В. — https://orcid.org/0000-0001-7767-0537 Сиволобова Г.Ф. — https://orcid.org/0000-0002-8362-0314 Гражданцева А.А. — https://orcid.org/0000-0001-7712-3699 Шевелев О.Б. — https://orcid.org/0000-0003-3200-958X Разумов И.А. — https://orcid.org/0000-0002-6756-1457 Завьялов Е.Л. — https://orcid.org/0000-0002-9412-3874 Локтев В.Б. — https://orcid.org/0000-0002-0229-321X Кочнева Г.В. — https://orcid.org/0000-0002-2420-0483
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Ткачева А.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Шевелев О.Б., Разумов И.А., Завьялов Е.Л., Локтев В.Б., Кочнева Г.В. Таргетная терапия глиобластомы человека с использованием онколитического потенциала парвовируса и аттенуированных штаммов вируса осповакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(2):83-91. https://doi.org/10.17116/molgen20193702183
© Коллектив авторов, 2019
Для корреспонденции: Кочнева Галина Вадимовна — д.биол.н., заведующая лабораторией вирусных гепатитов ФБУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Рос-потребнадзора; e-mail: [email protected], e-mail: g.v.kochneva@ yandex.ru
For correspondence: Kochneva G.V. — Dr. Sci. Biol., head of viral hepatitis lab SRC VB «Vector»; e-mail: [email protected], e-mail: [email protected]
Targeted therapy of human glioblastoma combining the oncolytic properties of parvovirus H-1 and attenuated strains of the vaccinia virus
A.V. TKACHEVA1, G.F. SIVOLOBOVA1, A.A. GRAZHDANTSEVA1, O.B. SHEVELEV2, I.A. RAZUMOV2, E.L. ZAVJALOV2, V.B. LOKTEV1, G.V. KOCHNEVA1
'State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Koltsovo, 630559, Novosibirsk, Russia ; 2Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, 630090, Novosibirsk, Russia
ABSTRACT
Both vaccinia virus and rat parvovirus H-1 are currently used to create drugs that have demonstrated their effectiveness against a number of human tumors. In preclinical studies it was demonstrated that the main factor responsible for the oncolytic activity of parvovirus H-1 is the NS1 protein and tumor cells of the brain were especially susceptible to its direct cytotoxic effect. We used NS1 gene insertion to arm two attenuated strains of vaccinia virus for virotherapy of glioblastoma: VV-NS1-dGF and MVA-NS1. Recombinant VV-NS1-dGF was engineered from replicative-competent L-IVP strain attenuated by deletion of the virus growth factor gene. MVA-NS1 was engineered from highly attenuated MVA strain, which is replicative-incompetent for mammalian cells. The NS1 transgene expression significantly enhanced the lytic activity of both recombinants against human U87MG glioblastoma cells regardless of the level of attenuation of the original virus strains in vitro. However, in in vivo experiments, the recombinant VV-NS1-dGF more effectively destroys the subcutaneous xenografts of U87MG cells in Nu/Nu mice compared with the strain MVA-NS1 after a single injection of viruses into the tumor region. Both recombinants selectively replicate in tumor cells, but reproductive capacity of the VV-NS1-dGF is higher, which ensures its rapid accumulation in xenografts and their subsequent destruction. Investigation of the antitumor properties of recombinants in the orthotopic model of U87MG human glioblastoma demonstrated an increase in the lifetime of mice and a significant decrease in tumor volume when treated with VV-NS1-dGF. The data obtained demonstrate that recombinant VV-NS1-dGF has good therapeutic potential against human glioblastoma.
Keywords: vaccinia virus, parvovirus, recombinant, attenuation, oncolytic viruses, NS1 protein, glioblastoma.
INFORMATION ABOUT AUTHORS: Tkacheva A.V. — https://orcid.org/0000-0001-7767-0537 Sivolobova G.F. — https://orcid.org/0000-0002-8362-0314 Grazhdantseva A.A. — https://orcid.org/0000-0001-7712-3699 Shevelev O.B. — https://orcid.org/0000-0003-3200-958X Razumov I.A. — https://orcid.org/0000-0002-6756-1457 Zavjalov E.L. — https://orcid.org/0000-0002-9412-3874 Loktev V.B. — https://orcid.org/0000-0002-0229-321X Kochneva G.V. — http://orcid.org/0000-0002-2420-0483
TO CITE THIS ARTICLE:
Tkacheva AV, Sivolobova GF, Grazhdantseva AA, Shevelev OB, Razumov IA, Zavjalov EL, Loktev VB, Kochneva GV. Targeted therapy of human glioblastoma combining the oncolytic properties of parvovirus H-1 and attenuated strains of the vaccinia virus. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2019;37(2):83-91 (Russian). https://doi.org/10.17116/molgen20193702183
Введение
Применение онколитических вирусов является одним из перспективных инновационных подходов к терапии опухолей, в частности, к терапии глиобластом, которые представляют собой агрессивные первичные опухоли головного мозга человека с крайне неблагоприятным прогнозом [1, 2]. Обнадеживающие результаты в I—II фазе клинических испытаний показал препарат ParvOryx, созданный на основе парвовируса H1 [3]. По результатам доклинических испытаний этого препарата до 80% животных с глиомой С6 после локального, системного или интраназального лечения препаратом ParvOryx полностью выздоравливали [4].
Еще одним фаворитом среди онколитических вирусов является вирус осповакцины (VACV) [5]. Онколитический потенциал VACV зависит от штамма вируса [6]. Высоковирулентные штаммы, такие как Western Reserve, демонстрируют больший онколитический эффект [7], но их использование в терапевтических целях может привести к развитию осложнений, связанных с вирусной инфекцией. Мы в своей работе используем средний по вирулентности российский штамм Л-ИВП, который широко применялся для
вакцинации населения против натуральной оспы и обладает высокой природной онкоселективностью [8]. Штамм Л-ИВП является репликативно-компетентным в отношении клеток человека, поэтому существующий риск развития осложнений при использовании данного штамма для противоопухолевой терапии определяет необходимость его аттенуации (ослабления). Аттенуация может быть достигнута удалением одного или нескольких генов факторов вирулентности VACV, в частности, гена вирусного ростового фактора (VGF) [9].
Перспективным считается подход к созданию онколитических вариантов VACV, основанный на использовании высокоаттенуированных штаммов в качестве вектора для доставки противоопухолевых белков, адресно усиливающих их литические свойства [7]. Наиболее известным среди таких штаммов является MVA (modified vaccinia virus Ankara) [10]. Штамм MVA способен реплицироваться в культурах клеток птиц, но является репликативно-неком-петентным для нормальных клеток млекопитающих, однако малигнизация последних способствует повышению их чувствительности к MVA [11]. Показано также, что при вак-
цитации экспериментальных животных или людей реком-бинантными вариантами MVA наблюдается эффективная экспрессия чужеродных белков, гены которых встроены в вирусный геном [12].
Мы в своей работе решили объединить онколитиче-ский потенциал парвовируса Н-1 и аттенуированных штаммов VACV в отношении глиобластомы человека. При доклиническом исследовании ParvOryx было показано, что главным фактором, ответственным за онколитическую активность парвовирусов, является белок NS1 (первый неструктурный белок парвовируса H-1), причем опухолевые клетки мозга оказались особенно уязвимы к его прямому цитотоксическому действию [13].
Рекомбинантные штаммы Л-ИВП и MVA в настоящее время используют для создания противоопухолевых препаратов [14], однако данных прямого сравнения их противоопухолевого действия не опубликовано. Целью настоящего исследования являлось сравнение противоопухолевого эффекта рекомбинантных штаммов VACV Л-ИВП и MVA, имеющих одинаковую встройку трансгена онкоток-сического белка NS1 парвовируса H-1. В качестве модели для оценки онколитической активности рекомбинантных штаммов Л-ИВП и MVA мы использовали клетки глиобластомы человека в экспериментах in vitro и in vivo.
Материалы и методы
Вирусы и культуры клеток. Штаммы MVA (GenBank, AY603355.1) и Л-ИВП (GenBank, KP233807) получены из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспо-требнадзора (Кольцово, Новосибирская обл.). Рекомбинантный штамм VVdGF2/6 был получен нами ранее [9].
Для культивирования исходного и рекомбинантных штаммов Л-ИВП использовали клетки почки африканской зеленой мартышки CV-1. Для культивирования исходного и рекомбинантного штаммов MVA использовали линию клеток CER, являющуюся гибридом клеток сирийского хомячка BHK-21 и куриных фибробластов. Линии клеток CV-1 и CER получены из Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Культура клеток глиобластомы человека U87MG получена из коллекции АТСС. Клетки выращивали в ростовой среде ДМЕМ («Invitrogen», США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («HyClone», США) при температуре 37 °C.
Титр вируса определяли методом бляшек на монослое клеток CV-1 (для штамма Л-ИВП) или CER (для штамма MVA), окрашенном фиксирующим раствором кристаллического фиолетового (2 г/л кристаллический фиолетовый, 50 мл/л формальдегид, 100 мл/л этанол, вода). Титр выражали в числе бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл суспензии.
Конструирование инсерционных плазмид. Ген NS1 парвовируса Н-1 получен синтетическим путем в соответствии со структурой, представленной в GenBank под номером X01457.1, позиции нуклеотидов 264—2280. К С-концу гена NS1 была добавлена последовательность, кодирующая эпитоп FLAG с мотивом DYKDDDDK, для иммунодетек-ции синтезируемого NS1 с помощью коммерческих антител. Ген NS1 был клонирован в плазмиду pGEM-Puro-UN-DS [9] под контроль ранне-позднего синтетического промотора РЕ/L VACV c получением плазмиды pGEM-Puro-NS1-Flag. Эта плазмида использована для
встройки гена NS1 и одновременной делеции гена VGF штамма Л-ИВП ВОВ.
Для получения рекомбинантных вариантов штамма MVA нами была сконструирована плазмида pDel2-Pat. В качестве базовой была использована плазмидная ДНК pGEM-4Z (Promega, P2161), в которую были встроены фрагменты генома MVA, фланкирующие делецию II (Del II) [15]. Фрагмент длиной 568 н.п. (GenBank AY603355.1, позиции нуклеотидов 14928—15495) был получен методом ПЦР на матрице ДНК штамма MVA и встроен в pGEM-4Z по KpnI—EcoRI сайтам. Далее в эту же плазмиду был встроен фрагмент генома MVA, расположенный слева от Del II длиной 695 пар нуклеотидов (GenBank AY603355.1, позиции нуклеотидов 14182—14876) по сайтам SphI—PstI.
На следующем этапе в сконструированную ДНК был введен ген устойчивости к пуромицину pat под контролем промотора VACV по NarI сайту c получением плазмиды pDel2-Pat. Оперон, кодирующий промотор и ген pat, получен из плазмиды pVGF-PE/L-Pat [16] путем обработки плазмидной ДНК рестриктазой ClaI, имеющей аналогичные липкие концы с NarI. На основе плазмиды pDel2-Pat была сконструирована инсерционная плазмида pDel2-NSI-Flag-Pat путем встройки по XmaI сайту оперона, состоящего из гена NS1 под контролем PE/L VACV. Оперон был получен методом ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК плазмиды pGEM-Puro-NS1-Flag (см выше) и пары праймеров 32_U и 34_L с заложенными в них сайтами рестрикции XmaI (выделены подчеркиванием):
32_U — 5'-ATCGGCCCGGGAAACACACACTGAGG-CCAAAA-3',
34_L — 5'-ATCGGCCCGGGTTACTTATCGTCGTC-GTCCTTGT-3'.
Инсерционная плазмида pDel2-NSI-Flag-Pat позволяет проводить встройку гена NS1 в район Del II штамма MVA.
Конструирование рекомбинантньх вирусов. Рекомбинантные варианты штаммов Л-ИВП и MVA со встройкой трансгена NS1 получали методом временной доминантной селекции с использованием в качестве маркера гена устойчивости к пуромицину [9] и инсерционных плазмид pGEM-Puro-NS1-Flag и pDel2-NSI-Flag-Pat. Вирус клонировали методом бляшек под твердым агаровым покрытием и анализировали на наличие встройки трансгена NS1 методом ПЦР. Для детекции рекомбинантов штамма Л-ИВП использовали праймеры, фланкирующие ген VGF слева и справа на геноме вируса: Up35 5'-GTAAGCAAAGAATATA-AGAATGAAGCGGTAATGAT и Apa-L22 5'-CGAGCA-CAATACCGGGAGATGG [16]. Размер амплифицирован-ного фрагмента ДНК исходного штамма Л-ИВП составлял 583 п.н., рекомбинантного варианта с делецией гена VGF и встройкой трансгена NS1 VV-NS1-dGF — 2456 п.н. Для детекции рекомбинантов штамма MVA использовали праймеры, специфичные к районам генома, фланкирующим Del II: MVA_F1 5'-CATGCTACTACCTTCGGGTAAA и MVA_R7 5'-TGCGTCTAGTATGTACGTTGTT. Размер ам-плифицированного фрагмента исходного штамма MVA составлял 285 п.н., рекомбинантного варианта со встройкой трансгена NS1 в районе делеции II MVA-NS1 — 2600 п.н. Отобранные рекомбинантные варианты дважды реклони-ровали, чтобы избежать следовых примесей исходного вируса. Структуру районов встройки вирусного генома подтверждали секвенированием. Готовые рекомбинантные штаммы VV-NS1-dGF и MVA-NS1 с титром 108—9 БОЕ/мл
хранили в расфасованном виде при —80 °С до использования.
Анализ экспрессии трансгена NS1 в составе рекомбинантных VACV. Детекцию белка NS1 в клетках U87MG, инфицированных рекомбинантными VACV, анализировали методом Вестерн-блоттинга с использованием в качестве первичных антител ANTI-FLAG BioM2 («Sigma-Aldrich», США) как описано в [9].
Оценка онколитической активности рекомбинантных вирусов в культуре клеток U87MG. Онколитическую активность рекомбинантных вариантов VACV определяли микрометодом на 96-луночных планшетах («Greiner», США) с использованием 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-суль-фо-фенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида (реагент XTT, «Sigma-Aldrich», США), как описано в [9]. Онколитическую активность выражали как 50% цитотоксическую дозу (ЦТД50) — концентрацию вируса, вызывающую гибель 50% клеток. Чем выше ЦТД50, тем ниже онколитическая активность вируса.
Эксперименты in vivo. Исследование подкожных ксе-нотрансплантатов клеток U87MG проводили на самках мышей линии Nu/Nu в возрасте 6—7 нед. С этой целью мышам вводили суспензию клеток U87MG (1,0Т08 клеток/мл) в 0,9% NaCl, предварительно смешанную с ледяным Matrigel («BD Bioscience», США) в соотношении 2:1, в объеме 100 мкл подкожно в правый бок мыши ближе к бедру. Время формирования опухолей (ксенографтов) составляло 11 дней, когда объем опухолей достигал 80—120 мкл. Мышей со сформировавшимися опухолями (n=60) разделили на три равные группы. Животным первых двух групп однократно подкожно в область опухоли вводили рекомби-нантные вирусы в дозе 107 БОЕ/мл в 100 мкл стерильного 0,9% NaCl. Мышам контрольной группы аналогично вводили 100 мкл 0,9% NaCl. Мониторинг состояния мышей осуществляли 2 раза в неделю, объем опухоли рассчитывали по формуле LxW2^0,5 [17]. Общий период наблюдения после введения вируса составил 24 дня.
Для анализа репродукции вируса в органах мышей на 2, 5, 10, 15 и 24-е сутки после введения вируса животных умерщвляли (по 2 мыши в каждой экспериментальной группе) и забирали селезенку, печень, легкие, почки и кровь. 10% гомогенаты органов и тканей (v/v) готовили в 0,9% растворе NaCl, обрабатывали ультразвуком, осветляли центрифугированием и титровали методом бляшек на монослое клеток CV-1 (для VV-NS1-dGF) и CER (для MVA-NS1). Титр вируса в органах мышей выражали в количестве БОЕ на мл 10% гомогената соответствующего органа или ткани.
Исследование ортотопических ксенотрансплантатов клеток U87MG проводили на самцах мышей линии SCID (SHO-PrkdcscidHrhr). Перед операцией по ортотопической ксенотрансплантации клеток U87MG каждое животное помещали в камеру с протоком воздуха 350—400 мл/мин и 1,5% концентрацией изофлюрана. Через 3 мин животное переносили на подогреваемый операционный столик с температурой поверхности 37 °С и помещали под наркозную маску с 1,5% изофлюрана. Суспензию клеток вводили при помощи шприца Hamilton в подкорковые структуры мозга через отверстие в черепной коробке животного. Для этого на голове в каудально-краниальном направлении делали надрез кожи 3—4 мм длиной в районе брегмы и через отверстие в черепной коробке вводили 5 мкл суспензии клеток (500 тыс. клеток на одно животное). Динамику роста опухолей исследовали с помощью магнитно-резонанс-
ной томографии (МРТ) на томографе BioSpec 117/16 USR («Bruker», Германия) — 11,7 Тесла. Всего в эксперименте было использовано 19 животных. На 24, 27 и 30-е сутки после внутримозгового введения клеток глиобластомы человека U87MG мышам вводили внутривенно (в ретроорби-тальный синус) вирусы в дозе 107 БОЕ/мл в 50 мкл стерильного 0,9% NaCl. Мышам контрольной группы аналогично вводили 50 мкл 0,9% NaCl. Каждая группа, включая контроль, состояла из 6—7 животных. Первое МРТ исследование головного мозга мышей было выполнено на 21-е сутки после инокуляции клеток U87MG, и далее проводили МРТ-оценку размеров опухоли каждые 5—7 дней. Размер опухоли высчитывали с помощью пакета программ Paravision 5.0, основываясь на разнице в контрасте между окружающими тканями и опухолью.
Статистический анализ. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием статистического пакета Statistica 10. Все значения выражали как среднее ±SE. Различия между средними значениями объема опухоли у животных из разных групп оценивали непараметрическим критерием Манна—Уитни (Mann—Whitney U-test).
Результаты
Конструирование и анализ рекомбинантных вариантов
VACV
Структура рекомбинантных вариантов представлена на рис. 1, а. Рекомбинантные варианты VV-NS1-dGF и MVA-NS1 образуются за счет кроссинговера между гомологичными участками плазмидной и вирусной ДНК, фланкирующими район встройки трансгена слева и справа. Ре-комбинантный вариант VV-NS1-dGF содержит встройку трансгена NS1 в районе делеции гена VGF штамма Л-ИВП (см. рис. 1, б, дорожка 4, фрагмент 2456 п.н.). Рекомбинант-ный вариант MVA-NS1 несет встройку трансгена NS1 в районе делеции II (см. рис. 1, б, дорожка 2, фрагмент 2600 п.н.).
Экспрессию трансгена NS1 в составе рекомбинантов анализировали методом Вестерн-блот с использованием коммерческих антител на эпитоп FLAG, введенный в С-ко-нец рекомбинантного белка (см. Материалы и методы). Результаты эксперимента представлены на рис. 1, с, из которого следует, что в лизатах клеток, инфицированных рекомбинантными вариантами VV-NS1-dGF и MVA-NS1, выявляется белок с молекулярной массой 100 кДа, который позитивно реагирует с антителами к эпитопу FLAG. Размер транскрипта, включающего последовательность гена NS1 и эпитопа FLAG, составляет 2163 п.н. Расчетная молекулярная масса полипептида составляет 75—80 кДа. По данным литературы, в инфицированных парвовирусом Н-1 клетках регистрируется 2 формы белка NS1 — с молекулярной массой 84 и 100 кДа [18]. Увеличение молекулярной массы обусловливается разной степенью фосфорили-рования белка. Таким образом, сконструированные нами рекомбинантные штаммы VACV экспрессируют белок NS1 в форме, наиболее близкой к его природной полноразмерной модификации.
Онколитическая активность рекомбинантных
вариантов VACV in vitro
На рис. 2 представлены результаты определения ци-тотоксической активности рекомбинантных штаммов VV-NS1-dGF и MVA-NS1 в отношении клеток глиобласто-
Рис. 1. Анализ рекомбинантных вариантов VACV.
а — схема структуры рекомбинантных вариантов VV-NS1-dGF и MVA-NS1 с указанием позиций праймеров, использованных в ПЦР-анализе рекомбинантных вирусных ДНК. L-flank и R-flank — фрагменты генома VACV, штамм Л-ИВП, фланкирующие ген VGF слева и справа соответственно; L-del II и R-del II — фрагменты генома штамма MVA, фланкирующие район природной делеции II; PE/L — ранне-поздний синтетический промотор VACV ; NS1 — ген первого неструктурного белка парвовируса крыс H-1; б — ПЦР-анализ рекомбинантных вариантов с использованием пар праймеров F1—R7 (дорожки 1, 2) и Up35—ApaL22 (дорожки 3, 4). М — маркер молекулярного веса, 1 — исходный штамм MVA — 285 п.н., 2 — рекомбинант MVA-NS1 — 2600 п.н., 3 — исходный штамм Л-ИВП — 583 п.н., 4 — рекомбинант NS1 VV-NS1-dGF — 2456 п.н.; с — Вестерн-блот-анализ с использованием коммерческих антител на эпи-топ FLAG, введенный в С-конец рекомбинантного белка NS1. 1—4 — лизаты клеток, инфицированные: 1 — VV-NS1-dGF., 2 — MVA-NS1, 3 — Л-ИВП, 4 — MVA.
Up35
Лpa L22 б
VV-NS1 -dGF 4
L-flank ' NS1 R-flank
PE/L
район гена VGF
MVA-NS1 4
L-del II NS1 R-del
PE/L
район делеции
Ш .". • :
а
в
мы человека U87MG. В качестве группы сравнения для оценки активности рекомбинанта VV-NS1-dGF использовали аналогичным образом аттенуированный рекомбинант VVdGF2/6 с делецией гена VGF, но не содержащий встройку трансгена NS1 [9]. Рекомбинантный штамм VVdGF2/6 является более адекватным контролем для оценки онколи-тической активности рекомбинанта VV-NS1-dGF, чем родительский неаттенуированный штамм Л-ИВП. Как следует из рис. 2, а, встройка трансгена NS1 значимо усиливает цитотоксическую активность вируса в отношении клеток глиобластомы (р<0,05). ЦТД50 рекомбинантных штаммов VV-NS1-dGF и VVdGF2/6 составляет 0,082 и 0,3 БОЕ/клетку соответственно. Аналогичный эффект наблюдается для рекомбинантного штамма MVA-NS1 (см. рис. 2, б). В данном случае в качестве контроля использован родительский штамм MVA, структура ДНК которого полностью соответствует векторной последовательности рекомбинанта MVA-NS1.
Противоопухолевая активность рекомбинантных
вариантов VACV in vivo
На первом этапе оценку противоопухолевой активности рекомбинантных вариантов VACV проводили на модели подкожных ксенографтов глиобластомы человека
U87MG, привитых мышам линии Nu/Nu. Как следует из рис. 3, в течение эксперимента размеры ксенографтов у мышей контрольной группы, не подвергавшейся виротера-пии, постепенно увеличивались, достигая в среднем 170 мкл к концу эксперимента (23 сут п.и.). Однократное введение в район опухоли рекомбинантного штамма MVA-NS1 (107 БОЕ/мышь) приводит к полному торможению роста ксенографтов. Введение же штамма VV-NS1-dGF в той же самой дозе приводит не только к торможению роста, но и к значимому уменьшению размеров ксенографтов.
Распространение рекомбинантных штаммов VACV
в организме
Метод биотитрования выявил присутствие обоих штаммов VACV в крови мышей (102—3 БОЕ/мл) через 2 сут после введения, что указывает на возможность системного распространения вируса по организму и достижения метастазов, отдаленных от места прививки опухолей [19]. Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF регистрируется в органах мышей (титр <104 БОЕ/мл) через 5—10 сут после его введения в опухоль, аналогично исходному штамму Л-ИВП [8] и аттенуированным вариантам на его основе [19]. Рекомбинантный штамм MVA-NS1 не выявлен во внутренних органах мышей, что говорит о большем снижении его
Рис. 2. Онколитическая активность рекомбинантных вариантов VACV, экспрессируюших трансген NS1 белка парво-вируса, in vitro.
а — штаммы MVA и MVA-NS1; б — варианты штамма Л-ИВП VV-NS1-dGF и VVdGF2/6. Клетки глиобластомы человека U87MG инфицировали вирусом с множественностью 0,001—10 БОЕ/клетка для вариантов штамма Л-ИВП, и 0,01 — 100 БОЕ/клетка для вариантов штамма MVA (ось X), инкубировали в течение 48 ч и определяли процент выживших клеток в ХТТ-тесте (ось Y) по сравнению с контролем (неинфицированные клетки, 100% выживаемость). ЦТД50 для каждого вирусного штамма определяли в ХТТ-тесте (помечено пунктирной линией на оси Х). Статистический анализ включал результаты трех независимых экспериментов. ЦТД50 рекомбинантных штаммов VV-NS 1-dGF и MVA-NS1 были значимо ниже по сравнению с соответствующими контрольными штаммами VVdGF2/6 и MVA (р<0,05).
инфекционности по сравнению со штаммом VV-NS1-dGF. При этом оба рекомбинантных штамма в высоком титре детектируются в гомогенатах ксенографтов U87MG. Максимальный титр штамма VV-NS1-dGF составляет 108 БОЕ/мл 10% гомогената опухоли и отмечается в ксенографтах через 15 сут после введения вируса, тогда как максимальный титр штамма MVA-NS1 на порядок меньше — 107 БОЕ/мл 10% гомогената опухоли и отмечается лишь через 24 сут.
Противоопухолевый эффект рекомбинантных штаммов VACV в ортотопической модели глиобластомы человека
Ранее авторами была показана возможность ортотопической ксенотрансплантации клеток U87MG мышам линии SCID [20]. Эта модель более приближена к клинической картине заболевания, чем подкожные ксенотранс-плантаты клеток U87MG, описанные выше. Вирус
вводили внутривенно трехкратно с интервалом 3 дня, начиная с 24-х суток после инокуляции клеток. В эксперимент были отобраны животные с детектируемыми опухолями объемом 5 мкл и более. Наличие опухолей и их размер контролировали с применением МРТ. Результаты представлены на рис. 4.
Как следует из рис. 4, а, время жизни мышей, леченных штаммом МУЛ-№1, не увеличивается по сравнению с контролем. Мыши этих обеих групп погибают к 51-му дню эксперимента. В то же время в группе мышей, леченных штаммом УУ-К81^ОЕ, 33% животных оставались живы на 51-е сутки. МРТ головного мозга этих мышей показала практически полное торможение роста опухоли к этому времени. Одно животное из этой группы прожило более 90 сут и было выведено из эксперимента эвтаназией на 96-е сутки после его начала. На рис. 4, б показаны значения объема опухолей мозга у мышей, выживших через
s
с о
о г 0Ï fi ю О
250
200
150
100
50
7 11 14
Дни наблюдения
-о—MVA-NS1 W-NS1-dGF -л—Контроль
[ ^ i *
i г——■ f. —-- У-*-
i Frfcx:
18
23
Рис. 3. Ингибирование роста ксенографтов глиобластомы человека U87MG рекомбинантными штаммами VV-NS1-dGF и MVA-NS1.
Стрелкой указана точка введения вируса и начала измерения (1-е сутки). * — различия между всеми группами достоверны на 23-и сутки эксперимента на уровне значимости р<0,05.
36 сут после инокуляции клеток U87MG, когда в контрольной группе гибель составила более 50%. Как следует из этого рисунка, объем глиобластом у мышей, леченных штаммом VV-NS1-dGF, значимо отличается от контроля (р=0,037). Лечение глиобластомы штаммом MVA-NS1 не приводило к значимому эффекту (см. рис. 4).
Обсуждение
Синтетический ген NSI парвовируса крыс Н-1 был использован нами в качестве трансгена для встройки в геном двух аттенуированных штаммов VACV, VV-NS1-dGF и MVA-NS1, с целью усиления их противоопухолевой активности. Рекомбинант VV-NS1-dGF сконструирован на основе репликативно-компетентного для клеток млекопитающих штамма Л-ИВП, имеет делецию гена VGF (фактор вирулентности) и на месте этой делеции — встройку трансгена белка NS1. В качестве исходного для конструирования рекомбинанта MVA-NS1 был взят высокоаттену-ированный репликативно-некомпетентный для клеток млекопитающих штамм MVA, в геном которого в район делеции II мы встроили аналогичный трансген белка NS1. Оба рекомбинантных штамма VACV эффективно продуцируют NS1 в клетках глиобластомы человека U87MG. Молекулярная масса рекомбинантного белка NS1 составляет 100 кДа, что соответствует форме, наиболее близкой к его природной полноразмерной модификации. Такая модификация позволяет сохранить многочисленные и разнообразные онкотоксические активности белка [18, 21].
Встройка трансгена NSI значимо усиливает литиче-скую активность VACV в отношении клеток глиобластомы человека U87MG in vitro. При этом литическая активность вариантов штамма MVA (MVA-NS1 и контроль MVA) не отличалась от соответствующих показателей вариантов вирусов на основе более вирулентного штамма Л-ИВП (VV-
NS1-dGF и контроль VVdGF2/6). Это для нас явилось неожиданностью, потому что известна отрицательная связь между аттенуацией VACV и его онколитической активностью — чем больше аттенуация вируса, тем меньше его он-колитическая активность [6]. Очевидно, что клетки U87MG являются высокочувствительными для штамма MVA и, в отличие от нормальных клеток млекопитающих, могут эффективно поддерживать его репликацию. Однако в экспериментах in vivo, где U87MG клетки представлены не в виде хорошо доступного для вируса монослоя, а в виде опу-холеподобных ксенографтов с многослойной плотной массой клеток, были выявлены существенные отличия между штаммами MVA-NS1 и VV-NS1-dGF.
Рекомбинантный штамм VV-NS1-dGF более эффективно разрушает подкожные ксенографты клеток U87MG у мышей линии Nu/Nu по сравнению со штаммом MVA-NS1 при однократном введении вирусов в район опухоли. Оба штамма избирательно размножаются в опухолевых клетках, однако репликативная активность штамма VV-NS1-dGF выше, что обеспечивает его быстрое накопление в ксенографтах и их последующую деструкцию.
Исследование противоопухолевых свойств рекомбинантных штаммов в ортотопической модели установившейся глиобластомы U87MG продемонстрировало увеличение продолжительности жизни мышей и значимое уменьшение объема опухолей при лечении штаммом VV-NS1-dGF. Виротерапию проводили, начиная с 21-х суток после прививки клеток U87MG, и только для мышей с установившимися ксенотрансплантатами, средний объем которых к этому времени составлял 5,7 мкл. Такой подход моделирует опухоли мозга человека достаточно поздних стадий, на которых чаще всего заболевание и выявляется. Важно отметить, что в данном случае использовалось системное введение вируса, что наиболее предпочтительно для терапии труднодоступных опухолей мозга. Счита-
Рис. 4. Эффект системного введения рекомбинантных штаммов VV-NS1-dGF и MVA-NS1 на выживаемость (а) и ин-гибирование роста внутримозговых ксенографтов глиобластомы человека U87MG, привитых мышам линии SCID (б).
а — стрелкой указаны дни введения вируса. Точка начала эксперимента (1-й день) — день интрацеребральной прививки суспензии клеток U87MG; б — объем опухолей в группах мышей, измеренный методом МРТ, 36-е сутки эксперимента.
ill
MVA-NS1
-W-NS1-dGF
-Контроль
100 В
ф
.
_ 90 -
о.
m ВО -
X
jj 70 -
Е
60 -
s
* 50 -
X
гл 40 -
ч
*
30 -
20 -
10 -
0 -
к—о—■
1
_
1 —1
,
24 27 30 33 36 39 42 45 43 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96
Дни после трансплантации опухоли
а
б
ется, что VACV вследствие своего большого размера не преодолевает гематоэнцефалический барьер [22], однако аномальная структура и повышенная проницаемость сосудов опухолей [23] снимают эти ограничения и обеспечивают дополнительную онкоселективность вируса.
Заключение
Проведенные исследования показали, что рекомбинант VV-NS1-dGF, сконструированный на основе репли-кативно-компетентного штамма вируса осповакцины Л-ИВП, обладает более высоким противоопухолевым потенциалом в сравнении с рекомбинантом MVA-NS1, сконструированным на основе репликативно-некомпе-тентного штамма MVA, и может рассматриваться в качестве перспективного препарата для лечения опухолей мозга человека.
Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП «Центр генетических ресурсов лабораторных животных» ФИЦ ИЦиГ СО РАН.
The studies are implemented using the equipment of the Center for Genetic Resources of Laboratory Animals at ICG SB RAS.
Работа с лабораторными животными проводилась при поддержке Министерства образования и науки России (Уникальный идентификатор проекта RFMEFI62117X0015). Работа по конструированию рекомбинантных вирусов проведена с использованием средств гранта РФФИ№18-29-09044/18.
The work with laboratory animals was supported by the Ministry of Education and Science of Russia (Unique identifier of the project RFMEFI62117X0015). The work on the construction of recombinant viruses was carried out using the grant of the Russian Foundation for Basic Research No. 18-2909044/18.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для проведения экспериментов использовали имму-нодефицитных мышей. Животных содержали в ЦКП «SPF-виварий» Института цитологии и генетики СО РАН. Эксперименты были выполнены с соблюдением принципов гуманности в соответствии с директивой Европейского сообщества (86/609/ЕЕС).
The authors declare no conflicts of interest.
In this study, we used immunodeficient mice. The animals were kept at the SPF-Vivarium Joint Use center of the Institute of Cytology and Genetics, Russian Academy of Sciences. All
AMTEPATYPA/REFERENCES
1. Wollmann G, Ozduman K, van den Pol AN. Oncolytic Virus Therapy for Glioblastoma Multiforme. Cancer J. 2012;18(1):69-81.
2. Cheema TA, Wakimoto H, Fecci PE, Ning J, Kuroda T, Jeyaretna DS, et al. Multifaceted oncolytic virus therapy for glioblastoma in an immunocompetent cancer stem cell model. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110(29):12006-12011.
3. Geletneky K, Huesing J, Rommelaere J, Schlehofer JR, Leuchs B, Dahm M, et al. Phase I/IIa study of intratumoral/intracerebral or intravenous/intra-cerebral administration of Parvovirus H-1 (ParvOryx) in patients with progressive primary or recurrent glioblastoma multiforme: Parv0ryx01 protocol. BMC Cancer. 2012;12(99). https://doi.org/10.1186/1471-2407-12-99
4. Rommelaere J, Geletneky K, Angelova AL, Daeffler L, Dinsart C, Kipri-anova I, et al. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 2010;21(2-3):185-195.
5. Kirn DH, Thorne SH. Targeted and armed oncolytic poxviruses: A novel multi-mechanistic therapeutic class for cancer. Nat Rev Cancer. 2009;9(1):64-71.
6. Thorne SH, Hwang THH, O'Gorman WE, Bartlett DL, Sei S, Kanji F, et al. Rational strain selection and engineering creates a broad-spectrum, sys-temically effective oncolytic poxvirus, JX-963. J Clin Invest. 2007;117(11):3350-3358.
7. Guse K, Cerullo V, Hemminki A. Oncolytic vaccinia virus for the treatment of cancer. Expert Opin Biol Ther. 2011;11(5):595-608.
8. Zonov E, Kochneva G, Yunusova A, Grazhdantseva A, Richter V, Ryabchi-kova E. Features of the Antitumor Effect of Vaccinia Virus Lister Strain. Viruses. 2016;8(1):20.
9. Kochneva GV, Babkina IN, Lupan TA, Grazhdantseva AA, Yudin PV, Sivolo-bova GF, et al. Apoptin enhances the oncolytic activity of vaccinia virus in vitro. Mol Biol. 2013;47(5):733-742.
10. Verheust C, Goossens M, Pauwels K, Breyer D. Biosafety aspects of modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vectors used for gene therapy or vaccination. Vaccine. 2012;30(16):2623-2632.
11. Greiner S, Humrich JY, Thuman P, Sauter B, Schuler G, Jenne L. The highly attenuated vaccinia virus strain modified virus Ankara induces apoptosis in melanoma cells and allows bystander dendritic cells to generate a potent anti-tumoral immunity. Clin Exp Immunol. 2006;146(2):344-353.
12. Sutter G, Marion O, Volker E. Recombinant MVA virus and the use thereof. US8197825B2, 2012.
13. Geletneky K, Hajda J, Angelova AL, Leuchs B, Capper D, Bartsch AJ, et al. Oncolytic H-1 Parvovirus Shows Safety and Signs of Immunogenic Activi-
animal experiments were carried out in compliance with the protocols and recommendations for the proper use and care of laboratory animals (ECC Directive 86/609/EEC).
ty in a First Phase I/IIa Glioblastoma Trial. Mol Ther. 2017;25(12):2620-2634.
14. Kim M. Replicating poxviruses for human cancer therapy. J Microbiol.
2015;53(4):209-218.
15. Meyer H, Sutter G, Mayr A. Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence. J Gen Virol. 1991;72(Pt 5):1031-1038.
16. Kochneva G, Sivolobova G, Tkacheva A, Grazhdantseva A, Troitskaya O, Nushtaeva A, et al. Engineering of double recombinant vaccinia virus with enhanced oncolytic potential for solid tumor virotherapy. Oncotarget. 2016;7(45):74171-74188. https://doi.org/10.18632/oncotarget.12367
17. Yu Z, Li S, Brader P, Chen N, Yu YA, Zhang Q, et al. Oncolytic vaccinia therapy of squamous cell carcinoma. Mol Cancer. 2009;8(45). https://doi.org/10.1186/1476-4598-8-45
18. Nuesch JPF, Lacroix J, Marchini A, Rommelaere J. Molecular pathways: Rodent parvoviruses — Mechanisms of oncolysis and prospects for clinical cancer treatment. Clin Cancer Res. 2012;18(13):3516-3523.
19. Kochneva GV, Grazhdantseva AA, Sivolobova GF, Tkacheva AV, Shvalov AN, Unusova AY, et al. Model of artificial metastasis of human epidermoid carcinoma A431 in nude mice for the examination of oncolytic activity of the vaccinia virus. Russ J Genet Appl Res. 2016;6(4):469-476.
20. Zavjalov EL, Razumov IA, Gerlinskaya LA, Romashchenko AV. In vivo MRI visualization of U87 glioblastoma development dynamics in the model of orthotopic xenotransplantation to the SCID mouse. Russ J Genet Appl Res. 2016;6(4):448-453.
21. Marchini A, Bonifati S, Scott EM, Angelova AL, Rommelaere J. Oncolytic parvoviruses: From basic virology to clinical applications. Virol J. 2015;12(1):1-16.
22. Kaufman HL, Kohlhapp FJ, Zloza A. Oncolytic viruses: A new class of immunotherapy drugs. Nat Rev Drug Discov. 2015;14(9):642-662.
23. De Bock K, Cauwenberghs S, Carmeliet P. Vessel abnormalization: another hallmark of cancer? Molecular mechanisms and therapeutic implications. Curr Opin Genet Dev. 2011;21(1):73-79.
Поступила 09.11.18 Received 09.11.18 После доработки 15.01.19 Revised 15.01.19 Принята к печати 23.02.19 Accepted 23.02.19
