CC BY
36
ORIGINAL RESEARCH
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Разработка препарата для онколитической иммунотерапии на основе вируса осповакцины (Vaccinia virus, Orthopoxvirus, Chordopoxvirinae, Poxviridae) против рака молочной железы
Бауэр Т.В., Трегубчак Т.В., Максютов А.З., Колосова И.В., Максютов Р.А., Гаврилова Е.В.
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия
Введение. В настоящее время активно развиваются новые направления в лечении рака, одним из которых является онколитическая иммунотерапия. Этот подход заключается в использовании вирусов в качестве он-коселективных цитолитических агентов, способных стимулировать опухолеспецифический и неспецифический иммунный ответ организма.
Цель работы - получение рекомбинантного вируса осповакцины, содержащего в геноме гены, кодирующие иммуностимулирующие молекулы, и изучение его онколитических и иммуностимулирующих свойств в экспериментах in vitro и in vivo.
Материал и методы. Рекомбинантный вирус осповакцины получен с использованием метода временной доминантной селекции. Цитолитическую эффективность вируса оценивали колориметрическим методом (МТТ-тест). Иммуногенность полиэпитопной конструкции в составе вирусного генома оценивали ex vivo стимуляцией клеток цельной крови иммунизированных мышей линии BALB/c в ответ на антигены с последующим определением уровня цитокинов методом иммуноферментного анализа.
Результаты. Получен рекомбинантный вирус осповакцины L-IVP_oncoB, содержащий ген, кодирующий гра-нулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор в области гена J2R, который кодирует тими-динкиназу. Кроме того, данный вирус содержит искусственно синтезированную генетическую конструкцию, кодирующую иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессируемых в злокачественных клетках при раке молочной железы, встроенную в область гена C11L (кодирует вирусный фактор роста). Показано, что проведённые модификации вирусного генома не оказывают влияния на ростовые характеристики вируса при культивировании на культурах клеток CV-1 и 4647, а также определена цитолитическая эффективность вируса в отношении раковых культур клеток различного генеза. В эксперименте in vivo выявлено, что полиэ-питопная конструкция в составе генома L-IVP_oncoB способна инициировать изменение профиля цитокинов. Обсуждение. Полученные данные охарактеризовали L-IVP_oncoB как перспективный цитолитический и иммуностимулирующий агент и показали необходимость дальнейшего изучения его свойств в качестве средства онколитической иммунотерапии.
Заключение. Проведены основные эксперименты по оценке биологических свойств полученного L-IVP_on-coB, которые необходимы для характеризации онколитического вируса.
Ключевые слова: онколитический вирус; вирус осповакцины; опухоль-ассоциированный антиген; цитотокси-ческий Т-лимфоцит.
Для цитирования: Бауэр Т.В., Трегубчак Т.В., Максютов А.З., Колосова И.В., Максютов Р.А., Гаврилова Е.В. Разработка препарата для онколитической иммунотерапии на основе вируса осповакцины (Vaccinia virus, Orthopoxvirus, Chordopoxvirinae, Poxviridae) против рака молочной железы. Вопросы вирусологии. 2020; 65(1): 49-56. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-49-56
Для корреспонденции: Бауэр Татьяна Валерьевна, аспирант, младший научный сотрудник отдела геномных исследований ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область. E-mail: bauer_tv@vector.nsc.ru
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16-15-10101). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Участие авторов в написании статьи: Бауэр Т.В. - 20%; Трегубчак Т.В. - 20%; Максютов А.З. - 10%; Колосова И.В. - 10%; Максютов Р.А. - 20%; Гаврилова Е.В. - 20%.
Поступила 27.06.19 Принята в печать 28.11.19
Development of the drug oncolytic immunotherapy based on vaccinia viruses (Vaccinia virus, Orthopoxvirus, Chordopoxvirinae, Poxviridae) against breast cancer
Bauer T.V., Tregubchak T.V., Maksyutov A.Z., Kolosova I.V., Maksyutov R.A., Gavrilova E.V.
State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559, Russia Introduction. Currently, new directions in cancer therapy are actively developing, one of which is oncolytic immunotherapy. This approach would be to use of viruses as cancer specific cytolytic agents capable of stimulating both the tumor-specific and non-specific immune response.
The objective paper was obtain a recombinant vaccinia virus containing genes encoding immunostimulating molecules and study oncolytic and immunostimulating properties of recombinant virus. Material and methods. MTT test, ELISA, methods of transient dominant selection.
Results. The recombinant vaccinia virus (L-IVP_oncoB) were obtained with deletion of the gene encoding thymidine kinase and had an integrated gene encoding GM-CSF. Also the virus have deletion of the gene encoding
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
viral growth factor and integrated genes encoding synthetic tumor-specific polyepitopic immunogens. It was shown that the modifications made to the viral genome did not affect the growth characteristics of the virus when cultured on CV-1 and 4647 cell cultures, and the cytopathogenic efficacy of the virus was determined in relation to cancer cultures of cells of various genesis. In in vivo experiment, it was revealed that the polyepitopic construct in the genome L-IVP_oncoB is able to initiate a change in the profile of cytokines.
Discussion. The obtained data characterized L-IVP_oncoB as a promising cytopathogenic and immunostimulating agent and showed the need for further study of its properties as means of oncolytic immunotherapy. Conclusion. The basic experiments on the evaluation of the biological properties of the obtained L-IVP_oncoB, which are necessary for the characterization of the oncolytic virus, have been carried out.
Keywords: oncolytic virus; vaccinia virus; tumor-associated antigen; cytotoxic T-lymphocyte; breast cancer.
For citation: Bauer T.V., Tregubchak T.V., Maksyutov A.Z., Kolosova I.V., Maksyutov R.A., Gavrilova E.V. Development of the drug oncolytic immunotherapy based on vaccinia viruses (Vaccinia virus, Orthopoxvirus, Chordopoxvirinae, Poxviridae) against breast cancer. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2020; 65(1): 49-56. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-49-56
For correspondence: Tatyana V. Bauer, PhD student, Junior Research Scientistof the department of genomic research
of the State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559, Russia.
E-mail: bauer_tv@vector.nsc.ru
Information about authors:
Bauer T.V., https://orcid.org/0000-0002-4954-9905
Tregubchak T.V., https://orcid.org/0000-0001-9608-2044
Maksyutov A.Z., https://orcid.org/0000-0002-4027-8299
Maksyutov R.A., https://orcid.org/0000-0003-1314-281X
Kolosova I.V., https://orcid.org/0000-0003-2317-4153
Gavrilova E.V., https://orcid.org/0000-0002-7118-5749
Acknowledgments. The study was carried out for the grant of the Russian Science Foundation (project No. 16-15-10101). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution: Bauer T.V. - 20%; Tregubchak T.V. - 20%; Maksyutov A.Z. - 10%; Kolosova I.V. - 10%; Maksyutov R.A. - 20%; Gavrilova E.V. - 20%.
Received 27 June 2019 Accepted 28 November 2019
Введение
Рак молочной железы является одним из наиболее распространённых видов злокачественных новообразований у женщин во всём мире. На него приходится около 14% летальных исходов, обусловленных онкологическими заболеваниями [1]. Однако за последние несколько десятилетий наблюдается значительное снижение показателей смертности больных раком молочной железы благодаря совершенствованию диагностических средств и разработке новых методов терапии [2]. Накопленные данные о молекулярных механизмах канцерогенеза позволяют применять различные подходы к терапии, учитывающие подтип рака молочной железы, профиль экспрессии генов и мутационный статус неопластических клеток опухолей молочной железы. Данные подходы включают гормональную терапию для больных люминальным раком молочной железы подтипов A и B [3], применение ингибиторов рецептора эпидермального фактора роста 2 (HER2) для лечения больных раком молочной железы, для которого характерна гиперэкспрессия HER2 [4], использование поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP) для таргетного воздействия на клетки опухоли, несущие мутации по BRCA1 (breast cancer gene 1) [5]. Однако применение указанных препаратов часто сопровождается развитием лекарственной устойчивости у пациентов. Её механизм в первую очередь обусловлен наличием популяции неопластических клеток, представляющих собой раковые стволовые клетки, способные адаптироваться к изменяющимся условиям микроокружения опухоли и сохранять способность к пролиферации [6]. Раковые
стволовые клетки при раке молочной железы подвергаются дифференцировке в эндотелиальные клетки, обеспечивая активную васкуляризацию опухолевой ткани [7], что способствует процессам метастазиро-вания и повышает риск рецидива заболевания [8], поэтому возникает острая потребность в разработке новых препаратов и методов лечения.
При поиске новых терапевтических агентов онко-литические вирусы рассматриваются в качестве перспективных основ для создания противоопухолевых средств, о чём свидетельствуют появление и применение в клинической практике препаратов на основе вирусов различных семейств. Так, в 2005 г. в Китае был одобрен первый онколитический препарат на основе аденовируса 5-го типа «Oncorine» для лечения злокачественных опухолей головы и шеи [9]. С 2007 г. в Латвии для терапии меланомы разрешён к использованию в клинической практике препарат «Rigivir» на основе энтеровируса группы ECHO 7-го типа, прошедшего адаптацию путём пассирования на перевиваемых культурах клеток, полученных из биопсийного материала опухолей при диагностированной меланоме [10]. Кроме того, для терапии меланомы применяется препарат на основе вируса простого герпеса 1-го типа Tali-mogene laherparepvec, одобренный в США с 2015 г. [11].
Однако, как и у большинства лекарственных средств, у препаратов на основе вирусов существуют недостатки, ограничивающие их применение. Основная проблема заключается в природных иммуностимулирующих свойствах вирусов, что обусловливает необходимость создания панели препаратов виро-терапии для успешного длительного лечения злока-
ORIGINAL RESEARCH
чественных новообразований и возможности при необходимости проводить замену препарата, чтобы избежать снижения эффективности лечения. Кроме того, иммуностимулирующие свойства вирусов обеспечивают их противоопухолевый эффект, наряду с прямым цитодеструктивным действием на опухолевые клетки. Таким образом, препараты для терапии рака, полученные на основе вирусов, целесообразно относить к средствам онколитической иммунотерапии, что обусловлено их цитолитическими, онкосе-лективными и иммуностимулирующими свойствами.
В данной работе реализуется комплексный подход, включающий использование онколитического вируса и иммунотерапии рака, направленный на снятие иммунологической толерантности и индукцию противоопухолевого иммунитета, результативность которого зависит от подходящего антигена-мишени и эффективного представления данного антигена иммунной системе организма. Сочетание иммуно- и виротера-пии может стать перспективным направлением в разработке препаратов для лечения онкологических заболеваний.
Для реализации данного подхода на основе штамма Л-ИВП вируса осповакцины (ВОВ), принадлежащего к роду Orthopoxvirus, семейству Poxviridae, был создан рекомбинантный онколитический вирус L-IVP_oncoB, содержащий в геноме искусственный ген, кодирующий полиэпитопный иммуноген, состоящий из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующих-ся в опухолевых клетках при раке молочной железы. В результате использования искусственной полиэпи-топной конструкции можно добиться высокого уровня иммунного ответа на доминантные и субдоминантные эпитопы опухолевых антигенов. Для лучшего представления опухолеспецифических эпитопов иммунной системе в состав ВОВ встроен ген, кодирующий иммуностимулирующий белок гранулоци-тарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Целевые встройки осуществлены в участки генов J2R и C11L, кодирующих тимидин-киназу (ТК) и вирусный ростовой фактор (VGF) соответственно. Данные модификации генома обеспечивают высокую эффективность размножения ВОВ в опухолевых клетках и приводят к практически полному подавлению репликации вируса в неделящихся здоровых клетках. В работе оценены цитолитическая эффективность L-IVP_oncoB в отношении раковых культур клеток различного генеза, в том числе рака молочной железы, и эффективность продукции цито-кинов клетками цельной крови мышей, иммунизированных L-IVP_oncoB, в ответ на стимуляцию лизатом раковой культуры клеток MDA-MB-231.
Материал и методы
Материал. В работе использовали ВОВ - штамм Л-ИВП, полученный из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора; эукарио-тические культуры клеток 4647 и CV-1, полученные из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотреб-
надзора; культуры клеток SW 620, A 431, OVCAR-3, C33A, MDA-MB-231, DU-145, SK-Mel-5, SK-Mel-28, полученные из коллекции Института цитологии и генетики СО РАН; мышей линии BALB/c из вивария ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Получение рекомбинантного вируса L-IVP_oncoB. Предсказание эпитопов для конструирования поли-эпитопного иммуногена проводили на сервере IEDB с использованием метода ANN. Рекомбинантный вирус получали при помощи метода временной доминантной селекции [12].
МТТ-тест. Сравнительное изучение цитолити-ческих свойств вариантов ВОВ проводили, используя МТТ-тест. 50% монослой клеток заражали изучаемыми вирусами с множественностью инфекции 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 и 10,0 БОЕ/кл. Через 72 ч добавляли 5 мг/мл МТТ (Sigma, США) и инкубировали 4 ч при 37 °С, после чего добавляли 200 мкл диме-тилсульфоксида и продолжали инкубацию при тех же условиях в течение 1 ч. Затем измеряли оптическую плотность спектрофотометрически при длине волны 540 нм на приборе Multiskan FC (Thermo Scientific, США) и определяли полулетальную дозу (ЦПД50) для исследуемых вирусов.
Оценка ростовых свойств L-IVP_oncoB. Для изучения динамики роста L-IVP_oncoB 90% монослой клеток линий 4647 и CV-1, полученный на 6-луноч-ных планшетах, инфицировали с множественностью заражения 1 БОЕ/кл. в трёх повторах и инкубировали 24, 48, 72 ч при 37 °С в условиях 5% CO2. Далее троекратно замораживали и оттаивали полученные вируссодержащих препараты и определяли концентрацию вируса в них при помощи титрования методом бляшек на монослое клеток линии CV-1. Помимо клеток CV-1 использовали линию 4647, аттестованную для производства иммунобиологических препаратов.
Оценка активации цитотоксических Т-лимфо-цитов. Эффективность индукции CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), специфичной для опухолевых антигенов в составе исследуемого рекомбинант-ного ВОВ, оценивали по изменению уровня продукции цитокинов в ответ на стимуляцию цельной крови животных антигенами. Для этого самок мышей линии BALB/c внутрибрюшинно инфицировали вирусом в дозе 107 БОЕ/мышь в 100 мкл физиологического раствора (6 животных). Мышам контрольной группы (6 животных) внутрибрюшинно вводили 100 мкл физиологического раствора. По истечении 21 сут после инъекции исследуемого препарата брали кровь у животных из ретроорбитального синуса. После этого кровь разводили 1 : 4 раствором, содержащим питательную среду DMEM/F12, стрептомицин 100 мкг/ мл, ампициллин 100 Ед/мл, гепарин 2,5 Ед/мл.
От каждой пробы отбирали аликвоты для дальнейшей стимуляции:
1) митогеном - смесью фитогемагглютинина (0,05 мг/мл) и липополисахарида (0,1 мг/мл);
2) специфичными антигенами - лизатом перевиваемой культуры клеток MDA-MB-231.
Аминокислотная последовательность специфического эпитопа Amino acid sequence of a specific epitope YLEEITGYL, KIFGSLAFL, SIISAVVGI, QLFEDNYAL, QLMPYGCLL, RLLQETELV, YISAWPDSL, YMIMVKCWMI, SIISAVVGILLVVVLGVVFGI
KLLMVLMLAAL, FLNQTDETL, TINPQVSKT, MQLIYDSSLCDL, KLLMVLMLAAL LLSHGAVIEV, SLSKILDTV, YLLHENCML, SLDQKLFQL, SLFESSAKI, AVYSEILSV, KVMEINREV
GLMEEMSALL, FASAMMHALEVL, GLAAAIAGA, LMEEMSALL
RLFFYRKSV, YLFFYRKSV, YLQVNSLQTV, RLVDDFLLV, LLARCALFV, LLDTRTLEV,
ILAKFLHWL
ALGSTAPPVHNV, ALWGQDVTSV, FLLLLLTVLTV, FLSFHISNL, FLLLLLTVLTVV, SLSYTNPAV, ALLVLVCVLVAL
ВОПРОСЫ ВИРУСОЛОГИИ. 2020; 65(1)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-49-56_
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Перечень эпитопов, входящих в состав полиэпитопной конструкции The list of epitopes that make up the polyepitope construct
Опухоль-ассоциированные антигены Tumor-associated antigens
HER2
Mammoglobin-A NY-BR-1
hMena hTERT
MUC-1
Кроме того, отбирали аликвоту пробы, которая не подвергалась стимуляции (контрольные образцы).
Далее инкубировали пробы при 37 °С в течение 20 ч и осаждали клеточные компоненты крови при 0,2g в течение 10 мин. Затем отбирали супернатант и хранили его при -20 °С.
Концентрацию цитокинов в ex vivo обработанных пробах цельной крови определяли методом имму-ноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем «Quantikine Mouse IL-6 ELISA» и «Quantikine Mouse IL-10 ELISA», согласно протоколу фирмы-производителя.
Результаты
Рекомбинантный ВОВ L-IVP_oncoB. На первом этапе работы выбирали антигены для включения в полиэпитопную конструкцию, предназначенную для дальнейшей инсерции в состав рекомбинатного ВОВ. Для выбора антигенов анализировали публикации в реферируемых журналах [13] и в базах данных клинических испытаний ClinicalTrials.gov.
Помимо антигенов, характерных для определённых видов рака, выделяют «метастатические» антигены. Поскольку против крупной первичной опухоли иммунный ответ неэффективен, её всегда иссекают хирургическим путём, существует необходимость бороться с метастазами. К таким «метастатическим» антигенам относятся MUC-1, HER2 [14].
Важным критерием выбора антигенов для включения эпитопов в состав вакцинных конструкций является выполнение следующих условий:
• вакцина, созданная на основе такого антигена, находится на I—III стадиях клинических испытаний;
• проведены испытания вакцины на основе данного антигена на животных;
• для недавно открытых антигенов необходимо подтверждение их высокой иммуногенности в литературе [15].
Для конструирования полиэпитопного иммуно-гена выбрали наиболее часто встречающиеся при раке молочной железы антигенные детерминанты (см. таблицу).
Для улучшения протеосомальной деградации по-лиэпитопных конструкций и дополнительной стиму-
ляции цитотоксического ответа на все включённые в состав конструкции антигенные детерминанты на N-конец полиэпитопа добавлен убиквитин с заменённой C-концевой аминокислотой Gly76-Val [16, 17]. Для усиления ответа ЦТЛ в состав полиэпитопных конструкций добавлены универсальные Т-хелперные эпитопы p2 из Tetanus toxin, PADRE. Универсальные Т-хелперные эпитопы располагаются на C-конце конструкций.
В качестве спейсера на С-конце ЦТЛ-эпитопов использовали дипептид AD [18]. Универсальные Т-хелперные эпитопы p2 из Tetanus toxin и PADRE отделены трипептидом ARY. Использование спейсер-ных последовательностей между всеми эпитопами приводит к более точному и надёжному представлению каждого целевого эпитопа, что в свою очередь повышает общую эффективность вакцинных поли-эпитопных конструкций.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полиэпитопный иммуноген, была синтезирована ЗАО «Евроген» (Россия).
Для получения целевого рекомбинантного ВОВ использовали ранее сконструированный ВОВ_ТК(-)_ GM-CSF(+)_A34R_(K151E_D110N) (неопубликованные данные). Данный вирус получен на основе ВОВ L-IVP 5 cl и содержит две аминокислотные замены в составе мембранного гликопротеина A34R. Введение таких замен в белок A34 в составе ВОВ усиливает формирование внеклеточных оболочечных вирионов, обладающих низкой иммуногенностью и обеспечивающих эффективный транспорт вируса в тканях инфицируемого организма, что может повысить он-колитический потенциал ВОВ относительно первичных опухолей и метастазов, а также частично решает вопрос относительно снижения эффективности терапии онколитическим вирусом вследствие иммунной реакции организма при длительном или повторном применении препарата.
На основе ВОВ_TK(-)_GM-CSF(+)_A34R_(K151E_ D110N) в ходе серии пассажей под селективным давлением был получен рекомбинантный ВОВ_ТК(-)_ GM-CSF(+)_VGF(-)_BC(+)_A34R_(K151E_D110N) (L-IVP_oncoB). Данный штамм депонирован в коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзо-
ORIGINAL RESEARCH
О
LÜ
5,5 5,0 4,5 4,0 3,5
L-IVP oncoB
L-IVP 5 cl
24
48
72
72
Воемя, ч
Воемя, ч
Рис. 1. Анализ динамики размножения L-IVP_oncoB по сравнению c исходным вариантом вируса (L-IVP 5 cl) на эукариотических
культурах клеток 4647 (а) и CV-1 (б).
Fig. 1. Analysis of the propagation dynamics of L-IVP_oncoB comparing the original preserved viruses (L-IVP 5 cl) on eukaryotic cell cultures CV-1, 4647. On the abscissa axis - time of incubation of the monolayer of cells after infection with viruses; on the ordinate axis -
virus titer, lg PFU/ml.
ра под номером У-796. Полная последовательность представлена в GenBank под номером МН341445.1.
Ростовые характеристики L-IVP_oncoB. L-IVP_ опсоВ получен путём модификаций генома исходного варианта вируса ^-ГУР 5 с1) в районах, ответственных за ростовые свойства вируса, его история составляет 18 пассажей под селективным давлением и 10 пассажей без селективного давления. В связи с этим возникает потребность в изучении реплика-тивных свойств полученного L-IVP_oncoB.
В проведённых экспериментах по изучению ростовых характеристик исследуемых ВОВ не выявлено достоверно значимых различий между ростовыми свойствами L-IVP_oncoB и исходным вариантом вируса (рис. 1), что свидетельствует об отсутствии
12
10
го 8
ш
с
< 6
О
LÜ
4
СГ
1_
Z1 2
0
L-IVP_oncoB L-IVP 5 cl
f-
т
шшшшшшяш
9
Рис. 2. Определение полулетальной дозы вариантов вируса осповакцины для раковых культур клеток различного генеза. ЦПД50 - доза вируса, при которой жизнеспособными остаются 50% клеток в лунке 96-луночного планшета через 72 ч после инфицирования. Fig. 2. Determination of a semi-lethal dose of VV variants for cancer cells of various genesis. TCIDJ0 is the dose of virus lysing 50% of cells in a well of a 96-well plate 72 h after infection. On the abscissa axis - cell cultures; on the ordinate axis -values of TCID „, PFU/cell.
влияния модификации генома L-IVP_oncoB на вирусную репродукцию в эукариотических культурах клеток 4647 и СУ-1.
Оценка цитолитической активности L-IVP_on-соВ в раковых культурах клеток различного генеза. При помощи МТТ-теста изучена чувствительность раковых культур клеток различного генеза: SW 620 (ко-лоректальный рак), А 431 (рак кожи), OVCAR-3 (рак яичников), С33А, MDA-MB-231 (рак молочной железы), DU-145 (рак простаты), SK-Mel-5 (меланома), SK-Ме1-28 (меланома) - к L-IVP_oncoB (рис. 2).
Полученные данные свидетельствуют о чувствительности линий клеток, используемых в эксперименте, к исследуемым вариантам ВОВ, что подтверждает широкий тропизм L-IVP_oncoB в отношении опухолевых клеток человека различного генеза. Данное свойство полученного вируса может оказать положительный эффект не только при терапии первичного опухолевого узла, но и при метастазирующих формах рака молочной железы.
Оценка активации ЦТЛв ответ на опухоль-ассоци-ированные антигены (ОАА). На примере ^-6 и ^-10 показана активация продукции цитокинов клетками цельной крови мышей в ответ на стимуляцию лиза-том клеток MDA-MB-231, в связи с чем можно сделать вывод об активации ЦТЛ (рис. 3).
Основным количественным параметром напряжённости специфического клеточного иммунитета является цитокиновый индекс (С1) - отношение ан-тиген-стимулированной продукции к митоген-сти-мулированной. Другим параметром для количественной оценки реакции иммунной системы на целевой антиген является индекс влияния (II) - отношение антиген-стимулированной продукции цитокинов к спонтанной или индекс влияния антигена (МП) -отношение митоген-стимулированной продукции цитокинов к спонтанной. Достоверной считается стимуляция, при которой II > 2, при этом важно, чтобы МП > 2. Данные представлены как отношение средних арифметических разниц значений оптической плотности при 450 и 540 нм.
б
а
ВОПРОСЫ ВИРУСОЛОГИИ. 2020; 65(1)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-49-56 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обсуждение
В ходе жизненного цикла клетки делятся, дифференцируются, мигрируют, подвергаются апоптозу. Соблюдение баланса между этими четырьмя основными клеточными процессами в результате регуляции множества внутриклеточных сигнальных путей обусловливает рост и морфогенез организма, а на более поздних этапах онтогенеза обеспечивает состояние гомеостаза. Когда в клетке происходит ряд мутаций, высвобождающих её от воздействия факторов, регулирующих клеточное деление, запускается активация протоонкогенов, а также снижается экспрессия генов - супрессоров опухолевого роста, что приводит к неуправляемой клеточной пролиферации [19]. В ряде случаев на данном этапе развития онкопатоло-гии иммунная система организма способна бороться с неопластическими клетками и противодействовать развитию новообразований, приводя к спонтанной ремиссии опухоли. Однако вероятность спонтанной ремиссии довольно низкая [20], так как клетки опухоли обладают низкой иммуногенностью и активируют механизмы, позволяющие им избегать иммунного ответа, из чего можно заключить, что течение многих онкологических заболеваний связано с развитием опухоль-ассоциированной иммуносупрессии.
Иммунорезистентность опухоли связывают с различными механизмами, главными из которых являются:
- сдвиг цитокинового баланса в сторону иммуносу-прессорных медиаторов;
- значительное преобладание CD4+CD25+ Т-регу-ляторных лимфоцитов, эффективно подавляющих иммунный ответ на развивающуюся опухоль;
- низкая иммуногенность ОАА.
Низкая иммуногенность ОАА объясняется тем, что они представляют собой нормальные белки организма, хотя и с возможными незначительными изменениями, сверхэкспрессируемые или экспрессируемые в нехарактерных для них тканях или временных промежутках [21].
Для комплексного преодоления механизмов, обеспечивающих иммунорезистентность опухоли и формирование полноценного противоопухолевого иммунитета, нами был получен рекомбинантный ВОВ L-IVP_oncoB и изучены его свойства. Целесообразность использования онколитических вирусов в комбинированной терапии рака обусловлена их способностью, помимо прямого цитодеструктивно-го действия, влиять как на чувствительность опухолевых клеток к терапевтическим воздействиям и эндогенным противоопухолевым механизмам, так и на организм в целом, восстанавливая его естественные антиканцерогенные молекулярные механизмы.
ВОВ способен активировать иммунную систему организма как естественный природный антиген. С целью усилить способность ВОВ стимулировать специфический клеточный противоопухолевый иммунитет нами была создана полиэпитопная конструкция из эпитопов антигенов, гиперэкспрессирующих-ся опухолевыми клетками при раке молочной железы.
£ 3
Физиологический раствор
MDA-MB-231
Физиологический раствор
MDA-MB-231
Рис. 3. Результат измерения уровня продукции цитокинов клетками цельной крови мышей, которым предварительно вводили 107 БОЕ L-IVP_oncoB, в ответ на стимуляцию лизатом клеток MDA-MB-231. Различия между группами достоверны при p < 0,05.
Fig. 3. The result of measuring the level of cytokine production by whole blood cells of mice in response to the stimulation by cell lysate MDA-MB-231. Mice were injected in advance with 107 PFU L-IVP_ oncoB. Differences between groups are significant atp <0.05.
On the abscissa axis - physiological solution; on the ordinate axis -the index of influence of the antigen (II).
Предположительно, полиэпитопная конструкция в составе вирусного генома будет с высокой эффективностью проникать в клетки организма и усиливать иммуногенные свойства вируса, необходимые для стимуляции естественного противоопухолевого иммунитета. Рациональность применения таких конструкций заключается в том, что использование полиэпитопных вакцин, основанных на целом ряде основных ОАА, может преодолеть гетерогенность экспрессии антигенов различными раковыми клетками внутри одной опухоли, запуская механизм контроля роста опухоли посредством презентации ОАА молекулами главного комплекса гистосовместимости класса I (МНС I) ЦТЛ [22].
Таким образом, нами осуществлены дизайн нукле-отидной последовательности, кодирующей полиэпи-топный иммуноген, и его встройка в вирусный геном при помощи метода временной доминантной селекции [12]. Ростовые характеристики полученного ре-комбинантного вируса L-IVP_oncoB были изучены на культурах клеток. При создании онколитического препарата на основе вируса важно, чтобы полученный вариант вируса сохранил репродуктивные свойства на культуре клеток, использование которой планируется при производстве препарата на его основе. Нами было показано, что в ходе длительной пассажной истории ростовые характеристики рекомбинант-ного вируса не изменились относительно исходного варианта.
Одним из главных природных свойств любого вируса является специфический клеточный тропизм, определяющий, какие ткани организма преимущественно будут инфицированы, и, следовательно, какое заболевание будет вызвано. Так, вирус бешенства
6
5
4
2
0
ORIGINAL RESEARCH
повреждает нейроны, вирус гепатита В - гепатоциты, ВИЧ повреждает Т-хелперы, а вирус гриппа - клетки эпителия дыхательных путей. Многие вирусы характеризуются преимущественным, хотя и не исключительным, тропизмом к опухолевым клеткам. В частности, это может объясняться нарушением в системе апоптоза раковых клеток и опухоль-ассоциированной иммуносупрессией, в то время как в здоровых тканях организма запускается процесс апоптоза и формируется специфический противовирусный иммунитет, являющиеся ключевыми механизмами для ограничения вирусной инфекции.
ВОВ характеризуется широким охватом восприимчивых к нему млекопитающих и способностью поражать обширный спектр тканей организма человека. ВОВ способен инфицировать неопластические клетки, образующиеся в разных органах и тканях, несмотря на протекающие в них молекулярные процессы канцерогенеза, что подтвердили результаты проведённого МТТ-теста, определившего высокую цитолитическую активность L-IVP_oncoB в отношении раковых клеток различного генеза.
Кроме того, ключевая роль в виротерапии злокачественных новообразований отведена формированию противоопухолевого иммунитета. Оценить иммунологические эффекты, опосредованные полиэпитопным иммуногеном, встроенным в вирусный геном, в экспериментах in vitro невозможно, а в системах in vivo на животных можно получить только косвенные данные о способности стимулировать Т-клеточный ответ, поскольку искусственно синтезированный иммуноген состоит из эпитопов ОАА, экспрессируемых злокачественными клетками опухолей человека. Поэтому способность полиэпитопа в составе L-IVP_oncoB активировать ЦТЛ проверяли опосредованно - путём оценки уровня секреции цитокинов в цельной крови мышей в ответ на стимуляцию митогенами или лизатом клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231. Полученные данные свидетельствуют о влиянии полиэпи-топного иммуногена на сдвиг цитокинового профиля, что свидетельствует об активации клеток иммунной системы.
Сдвиг цитокинового баланса в микроокружении опухоли имеет большое значение в терапии злокачественных новообразований. Цитокины могут как активировать, так и угнетать рост опухоли [23] в зависимости от её микроокружения [24]. Так, роль IL-10 в патогенезе и развитии опухоли крайне противоречива. В литературе представлены результаты исследований, в которых подтверждено действие IL-10 как иммуносупрессивного цитокина, способного снизить противоопухолевый иммунный ответ в микроокружении опухоли, а также обнаружена способность опухолевых клеток продуцировать IL-10 для ухода из-под иммунного надзора [25]. Наряду с этим получены данные, подтверждающие, что IL-10 оказывает противоопухолевое действие. В мышиной модели опухоли с повышенной экспрессией mIL-10 показано отторжение опухоли, которое усиливалось с повышением секреции mIL-10 [26].
На эффекты, оказываемые тем или иным цитоки-ном, может влиять пул других цитокинов, формирующих цитокиновый профиль крови или микроокружения пухоли. IL-10 при введении в комбинации с IL-4 и/или IL-2 стимулирует пролиферацию зрелых мышиных CD8+ T-клеток in vitro [27]. IL-10 можно использовать в качестве эффективного адъюванта для вакцины на основе поксвируса. При совместном введении вируса и IL-10 показана повышенная активация ЦТЛ у мышей [28].
Таким образом, полученные нами данные, характеризующие рекомбинантный вирус L-IVP_oncoB, свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения свойств вируса и перспективности его использования в качестве средства онколитической иммунотерапии.
Заключение
С развитием молекулярной биологии появились новые направления в терапии рака, одно из которых -онколитическая иммунотерапия, сочетающая действие препаратов на основе вирусов и белков, стимулирующих противоопухолевый иммунитет. Метод онколитической иммунотерапии имеет ряд преимуществ, но нуждается в дальнейших исследованиях.
На данный момент проведены основные эксперименты по оценке биологических свойств полученного L-IVP_oncoB, которые необходимы для характериза-ции онколитического вируса. Предположительно ли-тические способности вируса, эффективная доставка терапевтических молекул посредством ВОВ и активация ЦТЛ эффективной презентацией полиэпитопов ОАА молекулами MHC I должны показать синергиче-ское действие в борьбе со злокачественными опухолевыми тканями при раке молочной железы. Свойства L-IVP_oncoB в дальнейшем будут изучены in vivo на мышиных онкологических моделях - ксенографтах.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Youlden D.R., Cramb S.M., Dunn N.A., Muller J.M., Pyke C.M., Baade P.D. The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality. Cancer Epidemiol. 2012; 36(3): 237-48. DOI: https://doi. org/10.1016/j.canep.2012.02.007
2. Siegel R.L., Miller K.D., Jemal A. Cancer statistics, 2017. CA Cancer J. Clin. 2017; 67(1): 7-30.
DOI: https://doi.org/10.3322/caac.21387
3. Rouzier R., Perou C.M., Symmans W.F., Ibrahim N., Cristofanilli M., Anderson K., et al. Breast cancer molecular subtypes respond differently to preoperative chemotherapy. Clin. Cancer Res. 2005; 11(16): 5678-85.
DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-04-2421
4. Nixon N.A., Hannouf M.B., Verma S. A review of the value of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-targeted therapies in breast cancer. Euro. J. Cancer. 2018; 89: 72-81.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ejca.2017.10.037
5. Fong P.C., Boss D.S., Yap T.A., Tutt A., Wu P., Mergui-Roelvink M., et al. Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase in tumors from BR-CA mutation carriers. N. Engl. J. Med. 2009; 361(2): 123-34.
DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa0900212
6. Butti R., Gunasekaran V.P., Kumar T.V.S., Banerjee P., Kundu G.C. Breast cancer stem cells: Biology and therapeutic implications. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2019; 107: 38-52.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.biocel.2018
7. Delgado-Bellido D., Serrano-Saenz S., Fernández-Cortés M., Oli-
BOnPOCbl BMPyCOflOrMM. 2020; 65(1)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-49-56 OPI/in/IHAflbHblE HCCflEflOBAHHfl
ver F.J. Vasculogenic mimicry signaling revisited: focus on nonvascular VE-cadherin. Mol. Cancer. 2017; 16(1): 65. DOI: https://doi.org/10.1186/s12943-017-0631-x
8. Economopoulou P., Kaklamani V.G., Siziopikou K. The role of Cancer stem cells in breast Cancer initiation and progression: potential Cancer stem cell-directed therapies. Oncologist. 2012; 17(11): 1394-401.
DOI: https://doi.org/10.1634/theoncologist.2012-0163
9. Garber K. China approves world's first oncolytic. J. Natl. Cancer Inst. 2006; 98(5): 298-300.
DOI: https://doi.org/10.1093/jnci/djj111
10. Jaunalksne I., Brokane L., Petroska D., Rasa A., Alberts P. ECHO-7 oncolytic virus Rigvir® in an adjuvant setting for stage I uveal melanoma; A retrospective case report. Am. J. Ophthalmol. Case Rep. 2020; 17: 100615.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.ajoc.2020.100615
11. Adam J., Robertson J., Donegan E., Voicechovskaja I. NICE guidance for talimogene laherparepvec for unresectable metastatic melanoma. Lancet Oncol. 2016; 17(11): 1485-6.
DOI: https://doi.org/10.1016/S1470-2045(16)30489-2
12. Falkner F.G., Moss B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 1990; 64(6): 3108-11.
13. Cheever M.A., Allison J.P., Ferris A.S., Finn O.J., Hastings B.M., Hecht T.T., et al. The Prioritization of Cancer Antigens: A National Cancer Institute Pilot Project for the Acceleration of Translational Research. Clin. Cancer Res. 2009; 15(17): 5323-37.
DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-09-0737
14. Schlom J. Therapeutic Cancer Vaccines: Current Status and Moving Forward. J. Natl. Cancer Inst. 2012; 104(8): 599-613. DOI: https:// doi.org/10.1093/jnci/djs033
15. Milani A., Sangiolo D., Aglietta M., Valabrega G. Recent advances in the development of breast cancer vaccines. Breast Cancer (Dove Med. Press). 2014; 6: 159-68.
DOI: https://doi.org/10.2147/BCTT.S38428
16. Thomson S.A., Khanna R., Gardner J., Burrows S.R., Coupar B., Moss D.J., et al. Minimal epitopes expressed in a recombinant poly-epitope protein are processed and presented to CD8+ cytotoxic T cells: implications for vaccine design. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92(13): 5845-9.
DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.92.13.5845
17. Eslami N.S., Shokrgozar M.A., Mousavi A., Azadmanesh K., No-mani A., Apostolopoulos V., et al. Simultaneous immunisation with a Wilms' tumour 1 epitope and its ubiquitin fusions results in enhanced cell mediated immunity and tumour rejection in C57BL/6 mice. Mol. Immunol. 2012; 51(3-4): 325-31.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.molimm.2012.03.033
18. Seyed N., Taheri T., Vauchy C., Dosset M., Godet Y., Eslamifar A., et al. Immunogenicity Evaluation of a Rationally Designed Poly-tope Construct Encoding HLA-A*0201 Restricted Epitopes Derived from Leishmania major Related Proteins in HLA-A2/DR1 Transgenic Mice: Steps toward Polytope Vaccine. PLoS One. 2014; 9(10): e108848.
DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0108848
19. Nemec A.A., Wallace S.S., Sweasy J.B. Variant base excision repair proteins: Contributors to genomic instability. Semin. Cancer Biol. 2010; 20(5): 320-8.
DOI: https://doi.org/10.1016Zj.semcancer.2010.10.010
20. Horii R., Akiyama F., Kasumi F., Koike M., Sakamoto G. Spontaneous healing of breast cancer. Breast Cancer. 2005; 12(2): 140-4. DOI: https://doi.org/10.2325/jbcs.12.140
21. Allegrezza M.J., Conejo-Garcia J.R. Targeted Therapy and Immunosuppression in the Tumor Microenvironment. Trends Cancer. 2017; 3(1): 19-27.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.trecan.2016.11.009
22. Peres L.P., da Luz F.A., Pultz B.A., Brígido P.C., de Araújo R.A., Goulart L.R. Peptide vaccines in breast cancer: The immunological basis for clinical response. Biotechnol. Adv. 2015; 33(8): 1868-77. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2015.10.013
23. Borsig L., Wolf M.J., Roblek M., Lorentzen A., Heikenwalder M. Inflammatory chemokines and metastasis — tracing the accessory. Oncogene. 2013; 33(25): 3217-24. DOI: https://doi.org/10.1038/ onc.2013.272
24. Salazar-Onfray F., López M.N., Mendoza-Naranjo A. Paradoxical effects of cytokines in tumor immune surveillance and tumor immune escape. Cytokine Growth Factor Rev. 2007; 18(1-2): 171-82.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cytogfr.2007.01.015
25. Chen Q., Daniel V., Maher D.W., Hersey P. Production of IL-10 by melanoma cells: examination of its role in immunosuppression mediated by melanoma. Int. J. Cancer. 1994; 56(5): 755-60.
DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.2910560524
26. Giovarelli M., Musiani P., Modesti A., Dellabona P., Casorati G., Al-lione A., et al. Local release of IL-10 by transfected mouse mammary adenocarcinoma cells does not suppress but enhances antitumor reaction and elicits a strong cytotoxic lymphocyte and antibody-dependent immune memory. J. Immunol. 1995; 155(6): 3112-23.
27. Chen W., Zlotnik A. IL-10: a novel cytotoxic T cell differentiation factor. J. Immunol. 1991; 147(2): 528-34.
28. Kaufman H.L., Rao J.B., Irivine K.R., Bronte V., Rosenberg S.A., Restifo N.P. Interleukin-10 enhances the therapeutic effectiveness of a recombinant poxvirus-based vaccine in an experimental murine tumor model. J. Immunother. 1999; 22(6): 489-96. DOI: https://doi. org/10.1097/00002371-199911000-00003
