CC BY
50
УДК 616-006:577.156.152.344
Т.А. Короленко, С.Я. Жанаева, О.Н. Потеряева, И.Г. Свечникова, О.В. Фаламеева, Т.А. Халикова, Е.С. Ярыгина, И.А. Гончарова
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ЦИСТЕИНОВЫХ ПРОТЕАЗ: РОЛЬ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ПРОТЕАЗ (ПРОФЕРМЕНТОВ)
И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ИНГИБИТОРОВ*
ГУ НИИ физиологии СО РАМН, Новосибирск
Целью исследований было изучение роли цистеиновых протеаз и их ингибиторов при опухолевом росте на экспериментальных моделях мышиных опухолей. Показано, что опухолевая ткань лимфосаркомы Ь8 и аденокарциномы легких Льюис ЬЬЛ характеризуется низкой активностью катепсина В. Однако на примере НА-1 гепатомы показано значительное увеличение активности предшественника катепсина В в асцитической жидкости (в 500-600 раз) и асцитных клетках (в 6 раз) по сравнению с активностью зрелого фермента. Все изученные экспериментальные опухоли характеризовались низким содержанием ингибиторов цистеиновых протеаз лизосом - цистатина С и стефина А. Снижение ингибиторов наблюдалось также в печени, селезенке и сыворотке крови (в 3-9 раз). Корреляционный анализ выявил отрица- тельную взаимосвязь между весом опухоли и содержанием цистатина С в опухолевой ткани и сыворотке крови. Очевидно, концентрация цистатина С в опухолевой ткани, а также в сыворотке крови может рассматриваться как один из маркеров опухолевого роста.
Ключевые слова: цистеиновые протеазы, цистатин С, стефин А, опухоли
Роль протеаз лизосом и их эндогенных ингибиторов в развитии и метастазировании опухолей является предметом многочисленных исследований последнего десятилетия [1, 4-6, 11]. В опухолевых клетках в отличие от нормальных усилена экспрессия цистеиновых (катепси-ны В и Ь), аспартильных (катепсин Б), металлопротеаз; изменена их локализация в клетке; обнаружены различия в составе изоформ, нарушения гликозилирования [8,
15, 16, 20].
Клетки злокачественной опухоли секретируют большое количество протеолитических ферментов лизосом в активной форме и виде неактивных предшественников локально в зоне инвазии, где они оказывают самостоятельное деструктивное воздействие на компоненты внеклеточного матрикса, а также участвуют в активации предшественников металлопротеаз [9, 11, 12, 17]. Прогрессирование ряда опухолей человека (молочной железы, толстого кишечника, печени, пищевода) сопровождается повышением в них концентрации и активности катепсинов В, Ь, Б, что считают плохим прогностическим критерием, коррелирующим с плохой выживаемостью [8, 10, 13, 14, 18].
Эндогенные ингибиторы протеаз выполняют защитную функцию, осуществляя регуляцию активности цис-теиновых протеаз лизосом [3, 19, 21, 22]. К данному моменту выделены и охарактеризованы три основных семейства ингибиторов [21]: стефины, цистатины, кини-ногены. Стефины и цистатины являются низкомолекулярными белками, функционирующими в различных клетках и тканях животных [10, 20-22]. Нарушение баланса между цистатином С, стефином А и цистеиновы-ми протеазами лизосом встречается в клетках карциномы желудка [17], тканях злокачественных новообразований мозга [8].
Цель работы - исследовать активность катепсина В в тканях опухоли и органах, не вовлеченных в опухоле-
вый процесс, при развитии перевиваемых НА-1 гепатомы, аденокарциномы легких Льюис и лимфосаркомы мышей. На примере НА-1 гепатомы оценить активность предшественника катепсина В (прокатепсин В) в асцитных клетках, асцитической жидкости и сыворотке крови. Изучить концентрацию ингибиторов цистеиновых протеаз - внеклеточного цистатина С и внутриклеточного стефина А в тканях опухоли, печени, селезенки и сыворотки крови при развитии экспериментальных опухолей.
Методика. Эксперименты проводили на мы-шах-самцах линий СВА, A/Sn, гибридах первого поколения (CBAxC57B1/6)Fi (Институт физиологии СО РАМН, Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск).
Использовали перевиваемые опухоли мышей НА-1 гепатому, лимфосаркому LS [1], аденокарциному легких Льюис LLA. Опухолевые клетки LS или аденокарциномы легких Льюис LLA перевивали в мышцы бедра в количестве 1-2 млн на мышь. Клетки HA-1 гепатомы перевивали внутрибрюшинно. Модель НА-1 гепатомы мышей представляет интерес с той точки зрения, что позволяет оценивать непосредственно секрецию проформ протеаз и зрелых ферментов внеклеточно, в асцитическую жидкость, и сравнивать показатели со значениями активности ферментов в асцитных клетках, получаемых при центрифугировании цельного асцита.
Мышей с LS забивали на 18-20-ые сут после перевивки опухоли; с асцитной НА-1 гепатомой - на 10-12-ые сут; при аденокарциноме легких Льюис LLA -на 12-ые сут после трансплантации. Во всех случаях оценивали вес опухоли; забирали для исследования сыворотку крови, печень, селезенку, опухолевую ткань.
Концентрацию цистатина С определяли в тканях и сыворотке крови с помощью наборов для иммунофер-ментного анализа (KPKA, Словения) “сэндвич”-мето-
* - работа поддержана грантом ИНТАС 02-0592.
дом. В качестве индикаторного фермента использовали пероксидазу хрена. Визуализацию ферментативной реакции проводили красителем (3,3', 5,5'-тетраметилбен-зидином). Для остановки ферментативной реакции использовали 2М H2SO4. Цветные продукты реакции измеряли на многоканальном спектрофотометре STAR 30 PLATE READER (“Kenstar”, USA) при 450 нм. Нами ранее показано наличие перекрестной реакции мышиных антител с антителами к цистатину С человека [2, 3].
Активность катепсинов В и L определяли по методу
A.J. Barrett and H. Kirschke (1981) [7]; флюоресценцию растворов определяли при помощи флюоресцентного спектрофотометра PERKIN ELMER 650-10S. В качестве субстратов использовали пептиды Z-L-Phe-L-Arg-MCA и Z-L-Arg-L-Arg-MCA (“Sigma”, США). Для определения активности катепсина L использовали селективный ингибитор катепсина B - СА-074. Результаты выражали в нмольметилкумариламида (МКА) / мин на мг белка. Активность прокатепсина В в асцитных клетках, асцитической жидкости и сыворотке крови определяли после преинкубации образцов с пепсином при кислых значениях рН [11]. Инкубация профермента в кислой среде в присутствии пепсина приводит к каталитическому процессингу и активации неактивного профермента.
Результаты. В наших экспериментах было показано, что активность катепсина В в асцитных клетках НА-1 гепатомы была в 1,5-2 раза выше по сравнению с печенью тех же мышей (табл.). Повышенная активность катепсина В в асцитных клетках по сравнению с печенью, возможно, отражает присутствие обогащенных ка-тепсином В макрофагов. Макрофаги, наряду с клетками гепатомы, в большом количестве присутствуют в асцитической жидкости. Опухоленосительство приводило к снижению активности катепсина В в печени и сыворотке мышей по сравнению с интактными животными на 10 сут развития гепатомы.
Активность прокатепсина В в асцитных клетках была сравнима с активностью катепсина В на 10-й день после перевивки HA-1 гепатомы; на 12-й день развития опухоли активность прокатепсина В увеличилась более чем в 6 раз по сравнению с 10-м днем (табл.). В асцитической жидкости активность катепсина В соответствовала значениям этого показателя в сыворотке крови, но активность прокатепсина В была значительно выше (почти в 2000 раз) по сравнению с активностью прока-тепсина В в сыворотке крови тех же мышей (табл.). В целом, учитывая увеличение количества асцитных клеток и объема асцитической жидкости при развитии опухоли, можно говорить о нарастании активности цистеиновой протеазы катепсина В при развитии НА-1 гепатомы у мышей.
Таким образом, развитие НА-1 гепатомы сопровождалось увеличением активности прокатепсина В на 10-12-ые сут в опухолевой ткани, в асцитической жидкости и сыворотке крови по сравнению с катепсином В в тех же тканях. Накопление прокатепсина В в асцитической жидкости, вероятно, явилось следствием усиления секреции фермента опухолевыми клетками и, возможно, макрофагами в виде неактивного предшественника. Накопление проформ протеаз (латентных предшественников) характерно для опухолевых клеток с повышенной метастатической активностью. Секретируемые предшественники протеаз неактивны и стабильны при
нейтральных значениях pH, но могут активироваться в кислой среде под воздействием катепсина D или тиоло-вых активаторов [20].
В асцитных клетках концентрация цистатина С была в 2 раза ниже по сравнению с печенью мышей с HA-1 ге-патомой (0,04±0,005 и 0,08±0,011 нмоль/г белка) и более чем в 10 раз ниже по сравнению с интактной печенью (0,45±0,120). Развитие HA-1 гепатомы сопровождалось снижением концентрации цистатина С в печени и селезенке, соответственно, в 6 и 2 раза по сравнению с показателями интактных животных (рис. 1). Известно, что цистатины имеют сигнальный пептид, который позволяет им секретироваться и функционировать вне клетки. Поэтому они находятся в относительно высоких концентрациях во многих биологических жидкостях организма [11]. В нашем исследовании значительное снижение (в 3 раза) цистатина С наблюдали в сыворотке крови (25,0±0,02 и 8,8±1,21 нмоль/л соответственно).
Опухолевая ткань аденокарциномы легких LLA, ме-тастазирующая в легкие мышей (CBAxC57Bl)F1, характеризовалась низкой активностью катепсина В и низким содержанием цистатина С. По сравнению с интактными мышами в печени наблюдали повышение активности катепсина В в 1,4 раза (0,96±0,149 в печени мышей с опухолью против 0,67±0,073) и снижение концентрации цистатина С в 2,7 раза в печени и 5,4 раза - в селезенке на 12-ые сут развития LLA (рис. 1). Уровень цистатина С в сыворотке крови мышей на 12-й день после перевивки опухоли LLA был в 3 раза ниже по сравнению с ин-тактными мышами (7,1±1,95 и 23,7±0,92 нмоль/л).
У мышей с лимфосаркомой LS, не образующей метастазы, наблюдалась тенденция к повышению активности катепсина В в печени; в селезенке активность катепсина В повышалась в 1,4 раза (p<0,05) по сравнению с интактными мышами. При этом концентрация цистатина С была снижена в печени в 9 раз и в селезенке - в 5 раз (рис. 1). Сыворотка крови также содержала низкое количество цистатина С по сравнению с интактными животными (10,4±1,20 и 23,5±0,18 нмоль/л).
Самое минимальное количество цистатина С выявлено в опухоли аденокарциномы легких Льюис LLA; оно составило 0,009±0,003 нмоль/г белка. Опухолевая ткань лимфосаркомы LS и асцитные клетки гепатомы содержат в 6 и 10 раз, соответственно, больше цистатина С по сравнению с аденокарциномой легких Льюис (рис. 1). Такое соотношение концентраций ингибиторов в опухолевых тканях, вероятно, обусловливает фенотип данных опухолей, их особенности роста и метастазиро-вания. Агрессивные, метастазирующие опухоли характеризуются более низким содержанием ингибиторов по сравнению с менее злокачественными опухолями [9, 16,
18, 19].
Концентрация внутриклеточного ингибитора стефина А в 2-3 раза выше по сравнению с концентрацией ци-статина С в тех же тканях. Уровень стефина A опухолевых тканей с разными гистологическими типами практически не отличался от значений ингибитора в печени и селезенке. Полагают, что стефин А является наиболее сильным опухолевым супрессором [10, 11]. Опухолено-сительство приводило к снижению концентрации стефина А в печени и селезенке мышей при всех трех видах изучаемых опухолей (рис. 2). В печени с асцитной формой HA-1 гепатомы наблюдали снижение стефина А
в 3,3 раза по сравнению с интактной печенью; в селезенке - в 3 раза. В печени и селезенке мышей с лимфосар-комой LS концентрация ингибитора снижалась в 2 и 4,2 раза (рис. 2). Сходные, хотя гораздо менее выраженные изменения выявлены в тех же органах при LLA: тенденция к снижению уровня стефина А в печени и статистически значимое снижение в селезенке по сравнению с интактными животными (рис. 2).
Таким образом, для всех исследованных опухолей было характерно значительное снижение концентрации эндогенных ингибиторов цистатина С и стефина А как в опухолевой ткани, а также в печени, селезенке и сыворотке крови по сравнению с показателями интактных животных. Опухоленосительство приводило к снижению активности цистеиновой протеазы катепсина В в печени мышей при всех видах опухолей. Эти изменения в органах, не вовлеченных в опухолевый рост, возможно, отражают токсическое действие опухоли. Нами был проведен корреляционный анализ между весом опухоли и содержанием цистатина С в опухолевой ткани и сыворотке крови, который выявил обратную зависимость между весом лимфосаркомы LS и аденокарциномы легких Льюис LLA и снижением цистатина С в опухолевой ткани и сыворотке крови (r=-0,87, r=-0,65 соответственно). Мы предлагаем рассматривать концентрацию цис-татина С в опухолевой ткани, а также в сыворотке крови как один из маркеров опухолевого роста.
Положительная корреляция между уровнем ингибиторов цистеиновых протеаз в сыворотке крови и высоким метастатическим потенциалом опухоли, риском развития рецидивов и уменьшением продолжительности жизни была показана при раке толстой и прямой кишки человека [13].
Выводы. Опухолевая ткань лимфосаркомы LS и аденокарциномы легких Льюис LLA характеризуется низкой активностью катепсина В. Активность катепси-на В в клетках гепатомы сравнима с активностью фермента в интактной печени, однако активность предшественника катепсина В значительно повышена в асцитической жидкости (в 500-600 раз) и асцитных клетках (в 6 раз) по сравнению с активностью зрелого фермента.
Все изученные экспериментальные опухоли характеризовались низким содержанием ингибиторов цисте-иновых протеаз лизосом - цистатина С и стефина А. Снижение ингибиторов наблюдалось также в печени, селезенке и сыворотке крови (в 3-9 раз).
Корреляционный анализ выявил отрицательную взаимосвязь между весом опухоли лимфосаркомы LS и аденокарциномы легких Льюис LLA и содержанием ци-статина С в опухолевой ткани и сыворотке крови (r=-0,87, r=-0,65 соответственно).
Выражаем благодарность ст. н. с. ИЦиГ СО РАН В.И. Каледину за разработку моделей опухолей у мышей и помощь в проведении экспериментов [6].
REGULATION OF CYSTEINE PROTEASES ACTIVITY: ROLE OF CYSTEINE PROENZYMES (PROCAT-HEPSINS) AND INTRACELLULAR INHIBITORS
Таблица
Aктивнocть ^тєїстм В и [[pok-ai'encim;! В у мьішєй A/Sn c HA-1 renaTOMoé (M±m)
Показатели Катепсин В Прокатепсин В
Интактные A/Sn мыши
Печень 0,348± 0,014 -
Сыворотка крови 21,3± 1,90 2,2± 0,44
10-ые сут после перевивки опухоли
A^rnmie клетки 0,414±0,028° 0,458± 0,042
Aсцитичeскaя жидкость 12,8± 0,55 5060±980°
Печень 0,191±0,024** -
Сыворотка крови 13,2± 2,9* 3,2± 0,87°
12-ые сут после перевивки опухоли
A^rnmie клетки 0,487± 0,036 3,14± 0,25°
Aсцитичeскaя жидкость 10,9± 0,67 6400±1120°
Печень 0,342± 0,036 -
Сыворотка крови 17,1± 3,60 3,3± 0,98°
Примечание. Удельные активности катепсина и прока-тепсина B в печени, асцитных клетках мышей A/Sn с HA-1 гепатомой выражена в нмольметилкумариламида/мин на мг белка, в асцитической жидкости и сыворотке - в нмоль-метилкумариламида/мин на л.
* -p<0,05; ** — p<0,01 по сравнению с интактными мышами, o -p<0,001 по сравнению со значениями активности катепсина В тех же мышей. В каждой группе-по 6-10 животных.
Т.А. Korolenko, S.Ya. Zhanaeva, O.N. Poteryaeva, I.G. Svechnikova, O.V. Falameeva, Т.А. Halikova, E.S. Yarygi-na, I.A. Goncharova
Changes in cysteine proteinases activity and level of cysteine proteinase inhibitors cystatin C and stefin A were investigated during the development of experimental mouse tumors (HA-1 hepatoma, Lewis lung adenocarcinoma and lymphosarcoma). Comparative analyses of tumor tissues have revealed low cathepsin B activity in mouse lymphosarcoma and Lewis lung adenocarcinoma. The remarkable increase of procathepsin B activity in HA-1 hepatoma cells (6-times) and extracellular in ascitic fluid (500-600 times) comparatively to the cathepsin B activity in the same samples has been shown. In tumor tissues (HA-1 hepatoma, Lewis lung adenocarcinoma and lymphosarcoma) very low cystatin C concentration was noted. Development of all investigated mouse tumors was followed by decreased cystatin C and stefin A concentration in liver, spleen and serum (3-9 times). Our results revealed a correlation between low level cystatin C in mouse tumor tissue and serum and tumor weight. Obviously that in models of murine tumors cystatine C concentration in tumor tissue and also in serum can be used as a marker of tumor growth.
ЛИТЕРАТУРА
1. Активность и концентрация катепсина В как прогностический фактор при развитии мышиной лимфосаркомы LS и аденокарциномы легких Льюис / Т.А. Короленко, С.Я. Жанаеваи др. // Бюл. экспер. биол. 2002. Т. 133. №4. С. 452-455.
Рис. 1. Концентрация цистатина С в опухолевой ткани, печени и селезенке при НА-1 гепатоме, аденокарциноме легких Льюис ЬЬА и лимфосаркоме ЬБ.
* - р<0,05; ** - р<0,01 по сравнению с интактными мышами
Рис. 2. Концентрация стефина А в опухолевой ткани, печени и селезенке при НА-1 гепатоме, аденокарциноме легких Льюис ЬЬА и лимфосаркоме ЬБ.
* - р<0,01 по сравнению с интактными животными
2. Влияние полисахаридов и липопротеинов плазмы крови на секрецию цистатина с перитонеальными макрофагами мыши в норме и в условиях опухолевого роста / О.Н. Потеряева, Л.М. Поляков, Т.А. Короленко и др. // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 367-371.
3. Роль цистатина С и цистеиновых протеиназ в развитии мышиной лимфосаркомы LS / О.Н. Потеряева, О.В. Фа-ламеева, С.Я. Жанаева и др. // Бюл. экспер. биол. 2001. № 7. С. 77-79.
4. Увеличение эффективности химиотерапии карциномы легких Льюис стимулятором макрофагов карбоксиме-тилированным (1—>3)-ß-D-глюканом / О.В. Фаламеева, О.Н. Потеряева, С.Я. Жанаева и др. // Бюл. экспер. биол.
2001. №8. С. 205-228.
5. Чувствительный и резистентный к терапии циклофос-фаном варианты перевиваемой лимфосаркомы мышей: активность катепсинов В, L и D при различных схемах лечения циклофосфаном и SE-гликаном / Т.А. Усова,
С.Я. Жанаева, Г. Коган и др. // Бюл. экспер. биол. 2003. Т. 136. №11. С. 509-512.
6. An overview of proteinase inhibitors / K. Hibbetts. Cyclophosphamide-induced apoptosis in the experimental model of murine lymphosarcoma / O. Falameyeva, S. Djanayeva, V.I. Kaledin et al. // Cell. Proliferation. 2001. Vol. 34. P. 172.
7. Barrett A. Cathepsin B, cathepsin H and cathepsin L / A.J. Barrett, H. Kirschke // Methods Enzymol. 1981. Vol. 80. P. 535-561.
8. Cathepsin B immunohistochemical staining in tumor and endothelial cell is a new prognostic factor for survival in patients with brain tumor / T. Strojnik, J. Kos, B. Zidanik et al. //Clin. Cancer Res. 1999. Vol. 5. № 3. P. 559-567.
9. Cystatin C in LS lymphosarcoma and HA-1 hepatoma treated by Ukrain and cyclophosphamide and involvement of apoptosis /Т.А. Korolenko, О.Ы. Poteryeva, S.J. Djanayeva et al. // Drugs Clin. Exp. Res. 2000. Vol. 5/6. P. 285-290.
10. Cysteine proteinase inhibitors stefin A, stefin B, and cysta-tin C in sera from patients with colorectal cancer: relation to prognosis / J. Kos, M. Krasovec, N. Cimerman et al. // Clin. Cancer Res. 2000. Vol. 6. № 2. P. 505-511.
11. Сysteine proteinases and their inhibitors in extracellular fluids: markers for diagnosis and prognosis in cancer / J. Kos,
B. Werle, T. Lah, N. Brunner // Int. J. Biol. Markers. 2000. Vol. 15. № 1. P. 84-89.
12. Cysteine proteinases and inhibitors in murine tumors during effective treatment by cyclophosphane and macrophage stimulators / T. Korolenko, O. Falameyeva, O. Poteryaeva et al. // Anticancer Research. 2002. Vol. 22. P. 4301-4303.
13. Expression of cathepsin B and cystatin C in human colorectal cancer / K. Hirai, M. Yokoyama, G. Asano, S. Tanaka // Hum. Pathol. 1999. Vol. 30. № 6. P. 680-686.
14. Grubb A.O. Cystatin C - properties and use as diagnostic marker / A.O. Grubb // Advances in Clinical Chemistry. 2000. Vol. 35. P. 63-99.
15. Increased efficiency of Lewis lung carcinoma chemotherapy with a macrophage stimulator - yeast carboxymethyl glucan / G. Kogan, J. Sandula, T.A. Korolenko et al. // International Immunopharmacology. 2002. Vol. 2. P. 775-781.
16. Kos J. Cysteine proteinases and their endogenous inhibitors: target proteins for prognosis, diagnosis and therapy in cancer (review) / J. Kos, T.T. Lah// Oncol. Rep. 1998. Vol. 5-6. P. 1349-1361.
17. Prognostic significance of DNA ploidy, S-phase fraction, and tissue levels of aspartic, cysteine, and serine proteases inoperable gastric carcinoma/ A. Russo, V. Bazan, M. Mig-liavacca et al. // Clin. Cancer Res. 2000. Vol. 6. № 1. P. 178-184.
18. Structure-based design of specific cathepsin inhibitors and their application to protection of bone metastases of cancer cells / N. Katunuma, H. Tsuge, M. Nikatsuka et al. // Arch. Biochem. Biophys. 2002. Vol. 397. P. 305-311.
19. The role of cystatin C and stefin A as marker of tumor growth and efficacy of antitumor therapy / T.A. Korolenko,
S. Djanayeva, O.N. Poteryaeva et al. // Cell. Prolif. 2001. Vol. 34. P. 179.
20. Turk B. Lysosomal cysteine proteases: more than scavengers / B. Turk, D. Turk, V. Turk // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1477. P. 98-107.
21. Turk B. Regulating cysteine protease activity: essential role of protease inhibitors as guardians and regulators / B. Turk,
D. Turk, G. S. Salvesen // Current Pharmaceutical Design.
2002. Vol. 8. P. 1623-1637.
22. Vray B. Immunomodulatory properties of cystatins / B. Vray, S. Hartmann, J. Hoebeke // Cell. Mol. Life Sci. 2002. Vol. 59. P. 1-10.
