CC BY
38
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ БИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА
УДК 591.111:618.146-006.6
РЕДОКС-ЗАВИСИМЫЕ ПРОЦЕССЫ В ЭРИТРОЦИТАХ В ДИНАМИКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РАКА ШЕЙКИ МАТКИ*
Д.Р. Долгова, Т.В. Абакумова, А.Ю. Федотова
ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»
Исследования проведены на 80 белых нелинейных мышах, которые были разделены на контрольную и опытные группы (с экспериментальным раком шейки матки на 20-е, 30-е, 40-е сут после трансплантации опухоли). В эритроцитах в динамике экспериментального канцерогенеза оценили показатели системы липопероксидации, карбонильные производные белков и активность эндогенной антиоксидантной системы. Установлено, что в логарифмическую фазу роста опухоли система ПОЛ-АО переходит на более высокий уровень функционирования с сохранением продуктов окислительной модификации белков на уровне контроля. Таким образом, полученные результаты не подтверждают ок-сидативный и карбонильный стресс в эритроцитах экспериментальных животных.
Ключевые слова: рак шейки матки, эритроциты, перекисное окисление липидов, анти-оксидантная система.
Введение. Возникновение и развитие неоплазмы сопровождается нарушениями в эритроне различной степени выраженности. Следствием напряжения эритроидного ростка кроветворения является декомпенсация эри-тропоэза, изменение функционального состояния мембран эритроцитов, нарушение реологических свойств крови. В результате нарастают явления тканевой гипоксии, что утяжеляет течение основного заболевания. Постулируется существование типовых нарушений мембраны эритроцитов при различной патологии [5]. Неспецифические изменения мембраны эритроцитов, сопровождающие развитие неоплазмы, были обнаружены в клинике рака легкого, головы, шеи, желудка и кишечника [6, 10]. При этом выявлялись нарушения липидного спектра мембраны эритроцитов, увеличение вязкости ее липид-ного бислоя, нарушение белок-липидных и
* Работа выполнена в рамках гос. задания Ми-нобрнауки России.
липид-липидных взаимодействий. Снижалось содержание высокомолекулярных полипептидов при одновременном увеличении доли низкомолекулярных белков, нарушалось функционирование катион-транспортных мембранных систем и отмечалась дезорганизация поверхностной архитектоники эритроцитов [8].
Типичные деструктивные изменения мембраны эритроцитов возникают при действии различных повреждающих факторов, к числу которых относят интенсификацию процессов свободнорадикального окисления [9].
Усиление в мембране эритроцитов пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) приводит к уплотнению и деструкции липидного бис-лоя. Нарушается функциональная активность белков и функционирование мембран-рецеп-торного комплекса. При этом свободноради-кальное окисление повышает доступность компонентов мембраны эритроцитов для протеиназ и фосфолипаз, усугубляет уже имеющийся дефицит энергии [3].
В течение жизни эритроцита происходит необратимое уменьшение его поверхности в результате микровезикуляции. При этом удаляются поврежденные участки цитоплазма-тической мембраны. Активация ПОЛ усиливает процесс микровезикуляции. На поверхность клеточной мембраны выходят фосфо-липиды с тромбопластиновой активностью. Гемолизированные формы и фрагменты эритроцитарных мембран в кровотоке усиливают внутрисосудистое свертывание крови.
Повышение уровня ПОЛ - не единственный индикатор активации процессов генерации активных форм кислорода (АФК). Показано, что наиболее ранним и надежным индикатором поражения тканей при свободнорадикальной патологии является окислительная модификация белков. Установлено, что именно белки, а не липиды и нуклеиновые кислоты являются эффективными ловушками АФК [11].
Уровень АФК контролируется многокомпонентной антиоксидантной системой (АОС). По механизму действия различают неспецифическую и специфическую АОС. Последняя снижает уровень оксидантов путем прямого разрушения и связывания АФК и образующихся радикалов. К ферментативным элементам этой АОС относят суперок-сиддисмутазу (СОД), каталазу, глутатионре-дуктазу (ГР), глутатион^-трансферазу (ГТ). К низкомолекулярным соединениям с анти-оксидантным действием относится восстановленная форма глутатиона (GSH).
Цель исследования. Изучение редокс-зависимых процессов в эритроцитах в динамике экспериментального рака шейки матки (РШМ).
Материалы и методы. Объектом исследования послужили белые нелинейные половозрелые мыши, которые были разделены на контрольную и опытные группы (мыши с РШМ-5 на 20-е, 30-е, 40-е сут после трансплантации опухоли). Модель РШМ была воспроизведена на мышах весом не менее 20 г путем перевивки опухолевой массы в подмышечную область. Опухолевый штамм получен в РОНЦ им. Н.Н. Блохина (Москва). Рост данной солидной опухоли включает логарифмическую фазу (14-27 дней) и стационарную фазу (28-38 дней). Прививаемость
опухоли в эксперименте составила 90 %. Продолжительность жизни мышей с экспериментальным РШМ составила в среднем 22,5 мес. Спонтанного рассасывания опухоли в течение эксперимента не наблюдалось. Отмечался единичный падеж мышей с РШМ-5. Количество павших животных увеличивалось в динамике прогрессирования опухоли начиная с 40-х сут после трансплантации.
Все животные находились в стандартных условиях вивария, доступ к пище и чистой воде был свободным. Животные были выведены из эксперимента под эфирным наркозом. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, регламентируемыми Правилами ухода и использования экспериментальных животных, утвержденными приказом Министерства здравоохранения СССР № 755 от 12 августа 1977 г., а также положениями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964).
Кровь, стабилизированная гепарином, подвергалась центрифугированию при 3000 об. в течение 10 мин, далее эритроциты отмывались 3 раза холодным физиологическим раствором. Для биохимического исследования использовался гемолизат эритроцитов в соотношении 1:10.
Определение окислительной модификации белков (ОМБ). Уровень спонтанного ОМБ определяли спектрофотометрически по количеству образовавшихся 2,4-динитрофенилгид-разонов основного и нейтрального характера при длинах волн 346, 370, 430, 530 нм. Полученные результаты оптической плотности раствора пересчитывали на количество белка, определенного по методу Брэдфорда (1974). Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК), в результате которой образуется окрашенный комплекс с максимумом поглощения при длине волны 535 нм [9].
Активность СОД в гемолизате эритроцитов определяли методом Nishikimi (1974) с использованием системы восстановления нитросинего тетразолия при 540 нм [10].
Активность каталазы в гемолизате эритроцитов рассчитывали по убыли перекиси водорода в инкубационной смеси [3].
Определение глутатион^-трансферазы. Активность фермента оценивали по скорости связывания восстановленного глутатиона с субстратом 1-хлор-2,4-динитробензола при 340 нм на спектрофотометре GENESYS 10UV (Thermo Scientific, США). Расчет проводили с применением коэффициента молярной экстинкции образующегося продукта (9,6103 см-1), времени инкубации и степени разведения [9].
Определение активности глутатионре-дуктазы основано на переводе окисленной формы глутатиона в восстановленную с участием НАДФ*Н. По степени увеличения количества восстановленного глутатиона в среде инкубации рассчитывается активность фермента при 340 нм [3].
Содержание глутатиона восстановленного определяли с использованием реагента Элл-мана - 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кисло-
ты. При рН 7,8-8,0 в реакциях с SH-группами реагент Эллмана образует окрашенный анион нитротиофенолята и смешанный дисульфид, которые определяются при 412 нм [11].
Статистическая значимость полученных результатов оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни ^аШ 6.0). Различия между группами считали достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение. МДА является вторичным продуктом ПОЛ, увеличение которого провоцирует синдром интоксикации. МДА сшивает молекулы липидов и понижает текучесть мембраны. В результате проведенных исследований нами установлено значимое увеличение уровня МДА в эритроцитах мышей с экспериментальным РШМ в логарифмическую и стационарную фазы роста опухоли (табл. 1).
Таблица 1
Уровень МДА и активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах мышей
в динамике РШМ-5
Показатель Контроль (n=30) Логарифмическая фаза РШМ-5 (n=40) Стационарная фаза РШМ-5 (n=40)
МДА, мкмоль/л 219,65±7,57 295,05±4,49* 325,94±14,36*
СОД, у.е. 1,46±0,10 1,84±0,24* 1,46±0,12
Каталаза, ммоль/с/л 17,13±1,29 26,79±0,96* 60,09±1,42*
ГТ, ммоль/мин/л 0,147±0,022 0,395±0,064* 0,560±0,067*
ГР, ммоль/мин/л 0,431±0,056 0,635±0,073* 0,617±0,024
Глутатион, ммоль/л 205,20±34,32 96,51±16,74* 81,21±20,03*
Примечание. * - данные, статистически значимо отличающиеся от контроля (р<0,05).
Сегодня считается установленным повышение уровня МДА в эритроцитах при прогрессировании злокачественных опухолей различной локализации [24]. Хотя в 1967 г. были опубликованы результаты исследования, в котором методом магнитной радиоспектроскопии электронного парамагнитного резонанса в эритроцитах больных раком желудка на 1 и 2 клинических стадиях было зарегистрировано существенное снижение содержания свободных радикалов [7]. Усиление
ПОЛ особое значение имеет в образовании эндогенных альдегидов, которые, в отличие от свободнорадикальных интермедиатов, являются стабильными метаболитами [27, 28]. Это обеспечивает их дистантное действие на молекулы-мишени [27]. Альдегиды вступают во взаимодействие со свободными аминогруппами, с сульфгидрильными группами аминокислотных радикалов, выступая при этом в качестве «вторичных цитотоксических мессенджеров» [27].
До 60 % всех образующихся альдегидов катаболизируются путем конъюгации с глу-татионом. Нами установлено прогрессирующее снижение уровня восстановленного глу-татиона в эритроцитах в динамике экспериментального РШМ (табл. 1).
Процесс конъюгации альдегидов с глута-тионом может происходить и нефермента-тивно, однако в эритроцитах до 70 % их утилизируется с участием глутатион^-транс-феразы [23]. Этот фермент представляется центральным звеном детоксикации альдегидов. Показано, что от его активности зависит устойчивость клеток к токсическому действию альдегида, с чем, видимо, связана его защитная роль при оксидативном стрессе [12]. Также показано, что оксидативный стресс сопровождается усилением экспрессии гена, кодирующего ГТ [16].
В результате проведенных исследований нами установлено возрастание активности ГТ в эритроцитах в динамике экспериментального РШМ (табл. 1).
Дезорганизация молекулярной структуры мембраны эритроцитов в результате воздействия свободных радикалов и продуктов ПОЛ как универсальный ответ возникает, по мнению авторов [5], при одновременном снижении активности антиоксидантной системы. В результате изучения ферментов АОС мы установили значимое возрастание катала-зы и ГР в логарифмическую и стационарную фазы РШМ-5 (табл. 1).
Согласно теории Б.Н. Лю, существует последовательность «специализированных» диапазонов дисбалансов А (ПО-АО) между прооксидантными (ПО) и антиоксидантными (АО) составляющими [4]. С каждым из них связана возможность реализации определенного комплекса биохимических процессов. В различных пределах этих дисбалансов осуществляются пролиферация, канцерогенез, цитолиз и апоптоз. Одновременное повышение уровня ПОЛ и антиоксидантной защиты (АОЗ) может свидетельствовать о переходе системы ПОЛ-АО на более высокий уровень функционирования, но не позволяет предполагать возникновение оксидативного стресса.
Сегодня считается общепризнанным, что ОМБ является одним из ранних и надежных
маркеров поражения ткани при свободно-радикальной патологии, в частности при злокачественных опухолевых заболеваниях [1, 17]. При этом регистрируется повышение либо отсутствие изменений спонтанной ОМБ [2, 13, 26].
В результате проведенных исследований установлено значимое увеличение спонтанной ОМБ при 370 нм в стационарную фазу РШМ-5 - 2,270±0,174 ед. опт. пл./мг белка против 1,710±0,126 ед. опт. пл./мг белка в контроле. Показатели ОМБ при 346, 430 и 530 нм колебались в пределах коридора нормы.
В качестве основных индукторов ОМБ рассматривают АФК и продукты ПОЛ при снижении активности АОС. Удаление модифицированных белков идет по двум механизмам: с помощью протеасом и протеаз [25, 29]. Наблюдаемое отсутствие карбонило-вого стресса при прогрессировании РШМ-5 может быть следствием возрастания протеаз-ной активности либо активности АОЗ. Последнее может быть результатом действия альдегидов.
Nrf-2CNF-E2-relatedfactor - основной транскрипционный фактор, вовлеченный в регуляцию генов, содержащих антиоксидант-респонсивные элементы, активируется в ответ на окислительный стресс. Возможный механизм: Nrf-2 находится в комплексе с Keap 1 (Kelch-like ECH-assotiated protein), под действием альдегидов происходит диссоциация этого комплекса, Nrf-2 транслоцируется в ядро и активирует экспрессию генов, содержащих антиоксидант-респонсивные элементы, что в результате повышает АОЗ [30].
Заключение. Таким образом, результаты проведенных исследований редокс-зависи-мых процессов в эритроцитах позволяют предполагать в динамике РШМ-5 переход системы ПОЛ-АО на более высокий уровень функционирования уже в логарифмическую фазу роста опухоли. Одновременно имеет место истощение пула глутатиона. Сохранение количества продуктов ОМБ на уровне контроля свидетельствует в пользу гипотезы об отсутствии оксидативного и карбонильного стресса в эритроцитах экспериментальных животных.
1. Белоногов Р. Н. Редокс-зависимая модификация белков у больных раком легкого : авто-реф. дис. ... канд. биол. наук / Р. Н. Белоногов. -Томск, 2010.
2. Горошинская И. А. Интенсивность хеми-люминисценции, состояние антиоксидантной системы и окислительная модификация белков плазмы крови при развитии рецидива рака яичников / И. А. Горошинская, Г. А. Неродо, Б. И. Сурикова // Сибирский онкологический журн. - 2013. -№ 4 (58). - С. 45-49.
3. Крыжановский Г. Н. Дизрегуляционная патология / Г. Н. Крыжановский. - М. : Медицина, 2002. - 632 с.
4. Лю Б. Н. Роль митохондрий в развитии и регуляции уровня окислительного стресса в норме, при клеточных патологиях и реверсии опухолевых клеток / Б. Н. Лю, Б. М. Лю, Б. И. Исмаи-лов // Успехи современной биологии. - 2006. -№ 126 (4). - С. 388-398.
5. Новицкий В. В. Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при патологии разного ге-неза являются типовой реакцией организма: контуры проблемы / В. В. Новицкий, Н. В. Рязанцева, Е. А. Степовая // Бюл. сибирской медицины. -2006. - № 2. - С. 62-69.
6. Новицкий В. В. Эритроциты и злокачественные образований / В. В. Новицкий, Е. А. Сте-повая, В. Е. Гольдберг. - Томск : STT, 2000. -288 с.
7. Петяев М. М. Проблема комплексной диагностики злокачественных новообразований с помощью методов спектроскопии и кибернетики / М. М. Петяев // Вопросы гигиены, профпатоло-гии и онкологии в Сибири. - Ангарск, 1967. - Т. 1, вып. 3. - С. 108-114.
8. Степовая Е. А. Роль нарушений структуры мембраны и метаболизма эритроцитов в развитии анемии у больных со злокачественными новообразованиями / Е. А. Степовая, В. В. Новицкий, Н. В. Рязанцева // Гематология и трансфу-зиология. - 2003. - Т. 48, № 5. - С. 11-17.
9. Структурно-функциональная характеристика мембраны эритроцита и ее изменения при патологиях разного генеза / М. К. Боровская [и др.] // Бюл. Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2010. - № 3 (73). - С. 334-354.
10. Bruce L. J. A band 3-based macrocomplex of integral and peripheral proteins in the RBC membrane / L. J. Bruce, R. Beckmann, M. L. Ribeiro // Blood. - 2003. - Vol. 101 (10). - P. 4180-4188.
11. Caraceni P. Proteins but not nucleic acids are molecular targets for the free radical attack during reoxygenation of rat hepatocytes / P. Caraceni, De N. Maria, H. S. Ryu // Free Radic. Biol. Med. -1997. - Vol. 23 (2). - Р. 339-344.
12. Catalytic function of Drosophila melanogas-ter glutathione S-transferase Dm GSTS1-1 (GST-2) in conjugation of lipid peroxidation end products
/ S. P. Singh [et al.] // Eur. J. Biochem. - 2001. -Vol. 268 (10). - P. 2912-2923.
13. Chih-Ching Y. Protein carbonyl levels, glutathione-S-transferase polymorphisms and risk of colorectal cancer / Y. Chih-Ching, L. Ching-Yu, H. Ling-Ling // Carcinogenesis. - 2010. - Vol. 31 (2). -P. 228-233.
14. Dubinina E. E. The role of reactive oxygen species as signal molecules in tissue metabolism in oxidative stress / E. E. Dubinina // Vopr. Med. Khim. -2001. - Vol. 47 (6). - P. 561-581.
15. Ellman G. L. Tissue sulfhydryl groups / G. L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. - 1959. -Vol. 82 (1). - P. 70-77.
16. Expression of glutathione-S-transferase isozyme in the SY5Y neuroblastoma cell line increases resistance to oxidative stress / C. Xie [et al.] // Free Radic. Biol. Med. - 2001. - Vol. 31 (1). - P. 73-81.
17. Griffiths H. R. Antioxidants and protein oxidation / H. R. Griffiths // Free Radic. Res. - 2000. - Vol. 33 (suppl.). - P. S47-58.
18. Gutteridge J. M. The characterisation of thiobarbituric acid reactivity in human plasma and urine / J. M. Gutteridge, T. R. Tickner // Anal. Biochem. - 1978. - Vol. 91 (1). - P. 250-257.
19. Habig W. H. Glutathione-S-transferase in rat and human / W. H. Habig, W. B. Jakoby // Methods in Enzymology. - 1981. - Vol. 77. - P. 398-405.
20. Ilouno L. E. An improved technique for the assay of red blood cell superoxide dismutase (SOD) activity / L. E. Ilouno, E. N. Shu, G. E. Igbokwe // Clin. Chim. Acta. - 1996. - Vol. 247 (1-2). - P. 1-6.
21. Karpishchenko A. I. Medical laboratory technology and diagnostics: Manual : in 2 Vs (in Russian) / A. I. Karpishchenko. - St.-Petersburg : Intermedika, 1999.
22. Manso C. Glutathione reductase and lactic dehydrogenase activities of tissues of rodents with transplanted tumors / C. Manso, K. Sugiura, F. Wrob-leski // Cancer Res. - 1958. - Vol. 18 (6). - P. 682-686.
23. Metabolism of lipid peroxidation product, 4-hydroxynonenal (HNE) in rat erythrocytes: role of aldose reductase / S. Srivastava [et al.] // Free Radic. Biol. Med. - 2000. - Vol. 29 (7). - P. 642-651.
24. Overexpression of HER-2/neu protein attenuates the oxidative systemic profile in women diagnosed with breast cancer / V. J. Victorino [et al.] // Tumour Biol. - 2014. - Vol. 35 (4). - P. 3025-3034.
25. Protein degradation by the proteasome and its implications in aging / B. Friguet [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2000. - Vol. 908. - P. 143-154.
26. Reactive oxygen species damaged human serum albumin in patients with hepatocellular carcinoma / Z. Rasheed [et al.] // J. Exp. Clin. Cancer Res. - 2007. - Vol. 26 (3). - P. 395-404.
27. Redox regulation of glutathione S-transferase induction by benzyl isothiocyanate: correlation of enzyme induction with the formation of reactive oxygen intermediates / Y. Nakamura [et al.] // Cancer Res. - 2000. - Vol. 60 (2). - 219-225.
28. Spiteller G. Lipid peroxidation in aging and age-dependent diseases / G. Spiteller // Exp. Gerontol. - 2001. - Vol. 36 (9). - P. 1425-1457.
29. Ubiquitin conjugation is not required for the degradation of oxidized proteins by proteasome / R. Shringarpure [et al.] // J. Biol. Chem. - 2003. -Vol. 278 (1). - P. 311-318.
30. Walters D. MOxidative stress and antioxidants in the pathogenesis of pulmonary fibrosis: a potential role for Nrf2 / D. M. Walters, H. Y. Cho,
S. R. Kleeberger // Antioxid. Redox Signal. - 2008. -Vol. 10 (2). - P. 321-332.
REDOX-DEPENDENT PROCESSES IN ERYTHROCYTES IN DYNAMICS OF EXPERIMENTAL CERVICAL CANCER
D.R. Dolgova, T.V. Abakumova, A.Yu. Fedotova
Ulyanovsk State University
Research conducted on 80 white nonlinear mice were divided into control and experimental groups (with experimental cervical cancer on 20th, 30th, 40th day after the tumor transplantation). The red blood cells in the dynamics of experimental carcinogenesis evaluated indicators of lipid peroxidation, protein carbonyl derivatives and activity of endogenous antioxidant system. It was found that in the logarithmic growth phase tumor POL-AO system moves to a higher level of performance with the preservation of products at OMB control. Thus, these results do not support and carbonyl oxidative stress in red blood cells in experimental animals.
Keywords: cervical cancer, red blood cells, lipid peroxidation, antioxidant system.
