CC BY
99
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА___________
УДК 616-066.6:577
Т. П. Генинг, Т. В. Абакумова, Д. Р. Арсланова, И. И. Антонеева, Е. Г. Сидоренко, С. О. Генинг
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ НЕОПЛАЗМЫ И АСЦИТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ В ДИНАМИКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА1
Аннотация. В опухолевых клетках и асцитической жидкости крыс на логарифмической и терминальной стадиях экспериментального рака яичников определяли уровень малонового диальдегида, окислительную модификацию белков и активность антиоксидантных ферментов: каталазы, супероксиддис-мутазы, глутатионредуктазы, глутатион^'-трансферазы и уровень GSH. Установлено в опухолевых клетках усиление перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в логарифмическую фазу роста и возрастание активности глутатионового звена антиоксидантной системы в терминальную фазу.
Ключевые слова: рак яичников, опухолевые клетки, асцитическая жидкость, перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, антиоксидантная защита.
Abstract. In tumoral cells and ascitic liquids of rats at a logarithmic and terminal stage of an experimental ovarian cancer the authors have defined a level malondial-dehyde, oxidizing modification of fibers and activity of antioxidant enzymes: cat-alases, superoxide dismutase, glutathione reductase, glutation-S'-transferaza and a level of GSH. It has been established that in tumoral cells one may observe strengthening of lipoperoxidations and oxidizing modification of fibers in a logarithmic growth phase and increase of antioxidant system’s glutation link activity in a terminal phase.
Key words: ovarian cancer, tumoral cells, ascitic liquid, lipoperoxidation, oxidiz-ingmodification of fibers, antioxidant protection.
Опухолевая трансформация сопровождается изменением внутриклеточного метаболизма, в том числе образованием и утилизацией активных форм кислорода (АФК). Существовало мнение, что на стадии развития в неоплазме повышен уровень антиоксидантных ферментов, что, возможно, защищает клетку от гибели [1]. В то время как установившиеся опухоли, по данным ряда авторов, характеризуются низким уровнем антиоксидантных ферментов, что связано с влиянием этих ферментов на процессы пролифера-
1 Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».
ции [2]. В то же время существует мнение, что в результате недостаточности митохондриального дыхания в неопластических клетках повышается содержание АФК и экспрессия супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы [3].
Состояние липидов и белков клеточной мембраны является определяющим для поддержания формы, функциональной активности и контактов с другими клетками. На сегодня в литературе нет единого мнения относительно активности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах опухолевых клеток. По данным одних авторов [2, 4, 5], уровень ПОЛ снижен, анти-окислительная активность и окисляемость липидов невысоки, что может объясняться повышением уровня ненасыщенных жирных кислот. Низкий уровень последних и повышенное содержание холестерина увеличивают ригидность, но не снижают уровень жизнедеятельности опухолевых клеток. В то же время в динамике опухолевой прогрессии могут возникать и отбираться варианты опухолевых клеток с высоким уровнем ПОЛ.
Согласно данным литературы, окислительная модификация белков (ОМБ) на сегодня может рассматриваться как один из ранних индикаторов повреждения ткани при свободно-радикальной патологии [6]. Показано, что при действии АФК нарушается нативная конформация белков и образуются крупные белковые агрегаты (при действии гидроксильных радикалов) либо низкомолекулярные фрагменты (при действии гидроксильных радикалов вкупе с супероксидными анионами). Предлагается два механизма ОМБ: первый механизм предполагает конъюгацию липидных пероксидов с аминокислотными остатками в белках [7]; второй механизм - окисление АФК с образованием карбонильных производных. Последние - это стабильные продукты, которые формируются при металл-катализируемом окислении белков. В поддержании тиосульфидного состояния белков и защите клеток от окислительного стресса существенную роль играет ферментативное звено антиок-сидантной системы (АОС).
Таким образом, на сегодня не существует однозначных представлений о роли механизмов свободно-радикальной патологии в динамике канцерогенеза.
Цель исследования - оценка окислительно-восстановительного потенциала неоплазмы и асцитической жидкости в динамике экспериментального канцерогенеза.
1. Материал и методы исследования
Для моделирования опухоли использовали инбредных крыс в возрасте 4 месяцев массой 120 г (п = 12), которым внутрибрюшинно перевивали штамм ОЯ (асцитная опухоль яичника, банк опухолевых штаммов РОНЦ им. Блохина) в объеме 0,5 мл 9-дневного инокулята (асцитическая жидкость с опухолевыми клетками). Прогрессирование данного типа опухоли проходило в три этапа: логарифмическая (на 4-й день после перевивки), стационарная (на 9-й день) и терминальная (на 14-й день) фазы. Асцит отбирался под эфирным наркозом. При выполнении эксперимента руководствовались правилами проведения работ и использования экспериментальных животных, утвержденными Приказом Министерства здравоохранения СССР № 755 от 12 августа 1977 г., а также положениями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг., а также требованиями этического комитета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета.
Интенсивность ПОЛ оценивали по уровню вторичного продукта -малонового диальдегида (МДА) в тесте с тиобарбитуровой кислотой [8], а ОМБ - по уровню карбонильных производных белков, которые определяли по методу Е. Е. Дубининой [9]. Активность СОД в биологическом материале определяли по методу М. №8ЫЫт1 в модификации Е. Е. Дубининой [10, 11]. Определение активности каталазы основано на определении скорости утилизации Н2О2 в реакционной смеси [12], активности глутатион-редуктазы - на измерении скорости окисления КАБРИ, которая регистрируется по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм в присутствии окисленного глутатиона [12]. Активность глутатион-^-трансферазы определяли по скорости образования глутатион-^-коньюгатов между 08И и 1-хлор-2,4-динитробензолом при длине волны 340 нм [13]. Определение количества восстановленного глутатиона (08И) основано на взаимодействии 08И с 5,5-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации желтого аниона в ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412 нм [14]. Активность антиоксидантных ферментов и уровень МДА пересчитывались на 1 мг белка, который определяли по методу Брэдфорда [15]. При статистической обработке применяли непараметрический критерий Манна-Уитни (81а1а у.6.0).
2. Результаты и их обсуждение
В результате проведенных исследований было установлено возрастание уровня карбонильных групп белков как в опухолевой ткани (ОК), так и в асцитической жидкости (АЖ) животных с экспериментальным раком яичников (РЯ) (рис. 1).
I----ІОК
Рис. 1. Уровень карбонильных производных белков в лизате опухолевых клеток и асците в динамике канцерогенеза экспериментального РЯ
В результате серии исследований, посвященных оценке окислительной модификации белков при различных патологиях, появился термин «карбони-ловый стресс» [16, 17], поскольку определение карбониловых производных белков в плазме, сыворотке, клетках крови [18] и в тканях [19] свидетельствовало о повышении их содержания. Наиболее существенным является инактивация ферментов в результате ОМБ [20]. Кроме этого, модификация белков
делает их более чувствительными к протеолизу [21-23]. Т. Ку81хот было высказано предположение о возможности развития карбонилового стресса и в отсутствие избыточной генерации АФК и снижения АОЗ. Этот путь связан с продукцией абберантных белков, которые образуются, например, при стрессе, и карбонилирование необходимо для их деградации [24].
В результате проведенных исследований было установлено повышение уровня МДА в ОК и АЖ на терминальной стадии по сравнению с логарифмической (табл. 1).
Таблица 1
Уровень МДА в опухолевых клетках и асцитической жидкости асцитной опухоли яичников на различных стадиях канцерогенеза
Стадия/субстрат ОК, мкмоль/мг белка (М ± т) АЖ, мколь/л (Ы ± т)
Логарифмическая 10,25 ± 0,51 4,25 ± 0,31
Терминальная 18,62 ± 1,45* 7,43 ± 0,57*
Примечание. * - данные статистически значимо отличаются от аналогичных на предыдущей стадии экспериментального РЯ.
Основными индукторами окислительной модификации белков являются АФК и продукты ПОЛ при снижении антиоксидантной защиты. АФК нарушают нативную конформацию ряда доменов белков. При этом увеличивается число гидрофобных остатков на поверхности глобул, что приводит к образованию крупных белковых конгломератов. Радикалы липидов также вызывают фрагментацию белковых молекул.
В результате проведенных исследований установлено возрастание активности в опухолевых клетках АОЯ глутатионового звена антиоксидантной защиты в терминальной стадии по сравнению с логарифмической стадией роста опухоли (табл. 2), что может свидетельствовать о нарастающей диспропорции образования 02 и Н2О2, характерной для некоторых опухолей [25].
Таблица 2
Показатели компонентов АОС в ОК и АЖ в динамике экспериментального канцерогенеза (M ± m)
Показа- тели Серия ГР, ммоль/мин/мг белка г мг/на и е £ о м м в8И, моль/мг белка г , м/ а 1-^ ^ Я ^ 5 О ц ю с у г ,а /н 1 1 з а -5 « 2 Л <и 53 ч ю * 1 м
ОК ^-фаза 6,73 ± ± 0,560 137,1 ± ± 17,711 34,0 ± ± 3,932 147,7 ± ± 25,20 0,41 ± ± 0,057
1егт-фаза 7,25 ± ± 0,710 331,2 ± ± 61,765* 54,3 ± ± 7,846* 130,5 ± ± 18,60 0,38 ± ± 0,049
АЖ ^-фаза 3,20 ± ± 0,330 7,28 ± ± 0,473 6,57 ± ± 1,043 - 0,44 ± ± 0,052
1егт-фаза 4,00 ± ± 0,250 7,87 ± ± 1,007 6,87 ± ± 0,398 - 0,92 ± ± 0,070
Примечание. * - данные статистически значимо отличаются от аналогичных на предыдущей стадии.
Таким образом, полученные данные позволяют предполагать возникновение оксидативного и карбонильного стресса в опухолевых клетках в логарифмическую фазу роста асцитной опухоли яичников.
Заключение
1. В опухолевых клетках асцитной опухоли яичников в логарифмическую фазу роста усиливаются перекисное окисление липидов и окислительная модификация белков.
2. В терминальную фазу роста асцитной опухоли яичников в опухоли возрастает активность глутатионового звена антиоксидантной системы.
Список литературы
1. Пескин, А. В. Взаимодействие активного кислорода с ДНК / А. В. Пескин // Биохимия. - 1997. - Т. 62, вып. 12. - С. 1571-1578.
2. Galeotti, T. Oxy-radical sources, scavenger systems and membrane damage in cancer cells / T. Galeotti, S. Borello, L. Masotti // Oxygen Radicals: Systemic Events and Disease Processes. - Basel : Karger, 1990. - P. 129-148.
3. Poratcal, O. Coenzyme Q10 concentrations and antioxidant status in tissues of breast cancer patients / O. Poratcal, O. Ozakaya, M. E. Inal et al. // Clin. Biochem. -2000. - V. 33, № 4. - P. 284-297.
4. Франциянц, Е. М. Перекисное окисление липидов в патогенезе опухолевой болезни : автореф. дис. ... д-ра биол. наук / Франциянц Е. М. - Ростов н/Д, 1997. - 48 с.
5. Дейчман, Г. И. Естественный отбор и ранние изменения фенотипа опухолевых клеток in vivo: приобретение новых механизмов защиты / Г. И. Дейчман // Биохимия. - 2000. - Т. 65, вып. 1. - С. 92-111.
6. Дубинина, Е. Е. Окислительная модификация белков / Е. Е. Дубинина, И. В. Шугалей // Успехи современной биологии. - 1993. - Т. 11, вып. 1. - С. 71-81.
7. Grimsrud, P. A. Oxidative stress and covalent modification of protein with bioaktive aldehydes / P. A. Grimsrud, H. Xie, T. J. Griffin // J. Biol. Chem. - 2008. -V. 283 (32). - P. 21837-21841.
8. Андреева, Л. И. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой / Л. И. Андреева, Л. А. Кожемякин, А. А. Кишкун // Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 41-43.
9. Дубинина, Е. Е. Окислительная модификация белков плазмы крови больных психическими расстройствами (депрессия, деперсонализация) / Е. Е. Дубинина, М. Г. Морозова, Н. В. Леонова и др. // Вопросы медицинской химии. - 2010. -№ 4. - С. 389-409.
10. Дубинина, Е. Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма / Е. Е. Дубинина // Успехи современной биологии. - 1989. - Т. 108, вып. 1 (4). - С. 3-18.
11. Nishikimi, M. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenacine methosulfate and molecular oxygen / M. Nishikimi, N. Appa, K. Yagi // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1972. - V. 46. - P. 849-854.
12. Карпищенко, А. И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика : справочник : в 2 т. / А. И. Карпищенко. - СПб. : Интермедика, 1999. - С. 27-28.
13. Habig, W. H. Glutathione S-transferase A. A novel kinetic mechanism in which the major reaction pathway depends on substrate concentration / W. H. Habig, M. J. Pabst, W. B. Jakoby // J. Biol. Chem. - 1974. - V. 249 (22). - Р. 7140-7147.
14. Beutler, E. Red cell metabolism a manual of biochemical methods / E. Beutler. -Grune & Stration, Orlando, 1990. - P. 131-134.
15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal Biochem. - 1976. - V. 72. - Р. 248-254.
16. Stadtman, E. R. Protein oxidation / E. R. Stadtman, R. L. Levine // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2000. - V. 899. - P. 191-208.
17. Dalle-Donne, I. Protein carbonylation, cellular dysfunction, and disease progression / I. Dalle-Donne, G. Aldini, M. Carini et al. // Cell Mol. Med. - 2006. -V. 10 (2). - P. 389-406.
18. Жаворонок, Т. В. Участие тиосульфидной системы в регуляции окислительной модификации белков в нейтрофилах при окислительном стрессе / Т. В. Жаворонок, Е. А. Степовая, Г. В. Петина // Фундаментальные исследования. - 2007. -№ 12. - С. 383.
19. Gastegna, A. Proteomic identification of oxidatively modified proteins in Alzheimer's disease brain. Part I: creatine kinase BB, glutamine synthase, and ubiquitin car-boxy-terminal hydrolase L-1 / A. Gastegna, M. Aksenov, M. Aksenova, V. Thong-bookerd // Free Radic. Biol. Med. - 2002. - V. 33. - P. 562-571.
20. Walters, D. M. Oxidative stress and antioxidants in the pathogenesis of pulmonary fibrosis: a potential role for Nrf2 / D. M. Walters, H. Y. Cho, S. R. Kleeberger // Antioxidants & redox signaling. - 2008. - V. 10 (2). - P. 321-332.
21. Белоногов, Р. Н. Окислительная модификация белков и липидов крови больных раком легкого / Р. Н. Белоногов, Н. М. Титова, Ю. А. Дыхно // Сибирский онкологический журнал. - 2009. - № 4 (34). - С. 48-53.
22. Shringarpure, R. Ubiquitin conjugation is not required for the degradation of oxidized proteins by proteasome / R. Shringarpure, T. Grune, J. Mehlhase, K. J. Davies // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. - P. 311-318.
23. Shringarpure, R. Protein turnover by the proteasome in aging and disease / R. Shringarpure, K. J. Davies // Free Radic. Biol. Med. - 2002. - V. 32. -P. 1084-1089.
24. Nystrom, T. Role of oxidative carbonylation in protein quality control and senescence / T. Nystrom // The EMBO Journal. - 2005. - V. 24. - P. 1311-1317.
25. Du, J. Proteins are major initial cell targets of hydroxyl free radicals / J. Du, J. M. Gebicki // Intern. J. Biochem. Cell. Biol. - 2004. - V. 36. - P. 2334-2343.
Генинг Татьяна Петровна
доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой физиологии и патофизиологии, начальник лаборатории молекулярной и клеточной биологии, Научно-исследовательский технологический институт, Ульяновский государственный университет
E-mail: Naum-53@yandex.ru
Абакумова Татьяна Владимировна
кандидат биологических наук, старший преподаватель, кафедра физиологии и патофизиологии, старший научный сотрудник, лаборатория молекулярной и клеточной биологии, Научноисследовательский технологический институт, Ульяновский государственный университет
E-mail: taty-abakumova@yandex.ru
Gening Tatyana Petrovna Doctor of biological sciences, professor, head of sub-department of physiology and pathophysiology, head of laboratory of molecular and cellular biology, Research Technological Institute, Ulyanovsk State University
Abakumova Tatyana Vladimirovna Candidate of biological sciences, senior lecturer, sub-department of physiology and pathophysiology, senior staff scientist, laboratory of molecular and cellular biology, Research Technological Institute, Ulyanovsk State University
Арсланова Динара Ришатовна
кандидат биологических наук, старший преподаватель, кафедра физиологии и патофизиологии, старший научный сотрудник, лаборатория молекулярной и клеточной биологии, Научноисследовательский технологический институт, Ульяновский государственный университет
E-mail: monika_rainbow@mail.ru
Антонеева Инна Ивановна
доктор медицинских наук, профессор, кафедра онкологии и лучевой диагностики, ведущий научный сотрудник, лаборатория молекулярной и клеточной биологии, Научно -исследовательский технологический институт, Ульяновский государственный университет
E-mail: aii72@mail.ru
Сидоренко Екатерина Геннадьевна
ассистент, кафедра онкологии и лучевой диагностики, Ульяновский государственный университет
E-mail: nikolaenkova73@mail.ru
Arslanova Dinara Rishatovna Candidate of biological sciences, senior lecturer, sub-department of physiology and pathophysiology, senior staff scientist, laboratory of molecular and cellular biology, Research Technological Institute, Ulyanovsk State University
Antoneeva Inna Ivanovna
Doctor of medical sciences, professor, sub-department of oncology and radiology, research manager, laboratory of molecular and cellular biology, Research Technological Institute, Ulyanovsk State University
Sidorenko Ekaterina Gennadyevna Assistant, sub-department of oncology and radiology, Ulyanovsk State University
Генинг Снежанна Олеговна Gening Snezhanna Olegovna
студентка, Ульяновский Student, Ulyanovsk State University
государственный университет
E-mail: Digitally_bright@bk.ru
УДК 616-066.6:577
Окислительно-восстановительный потенциал неоплазмы и асцитической жидкости в динамике экспериментального канцерогенеза /
Т. П. Генинг, Т. В. Абакумова, Д. Р. Арсланова, И. И. Антонеева, Е. Г. Сидоренко, С. О. Генинг // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2012. - № 3 (23). - С. 3-9.
