CC BY
37
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ
НАУКИ
УДК 615.032-577.29
РЕДОКС-СТАТУС ЭРИТРОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ РАКЕ ЯИЧНИКОВ НА ФОНЕ АУТОГЕМОХИМИОТЕРАПИИ ЦИСПЛАТИНОМ
И ДОКСОРУБИЦИНОМ
Е.Ю. Насырова, Д.Р. Долгова, Т.В. Абакумова, И.И. Антонеева,
С.О. Генинг, Т.П. Генинг
ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск, Россия
e-mail: naum-53@yandex.ru
Цель работы - оценить редокс-статус эритроцитов периферической крови при экспериментальном раке яичников на фоне аутогемохимиотерапии (АГХТ) цисплатином и доксорубицином. Материалы и методы. В эритроцитах 120 белых беспородных крыс с перевиваемой асцитной опухолью яичников (АОЯ) через 3 и 8 дней после внутривенного введения и введения методом АГХТ цисплатина и доксорубицина в дозе соответственно 75 и 40 мг/м2 оценивали интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по уровню диеновых конъюгатов, кетодиенов, шиф-фовых оснований и малонового диальдегида, а также уровни окислительной модификации белков. Оценивали активность антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы, глута-тионтрансферазы.
Результаты. У крыс с АОЯ имеет место повышение уровня продуктов ПОЛ при одновременном снижении активности глутатион-трансферазы и каталазы, что свидетельствует о возникновении оксидативного стресса. Значимое возрастание количества продуктов окислительной модификации белка при этом указывает на развитие карбонильного стресса. Введение цисплатина и доксорубицина с использованием АГХТ значимо снижает уровни всех исследованных продуктов ПОЛ в отличие от показателей при обычном внутривенном введении химиопрепаратов, когда изменение уровней продуктов ПОЛ было разнонаправленным. Активность каталазы и СОД возрастала на фоне использования обоих методов введения, а активность ГТ - только при АГХТ. Полученные данные позволяют предполагать нивелирование явлений оксидативного стресса в эритроцитах крыс с АОЯ на фоне АГХТ цисплатином и доксорубицином. Влияние цисплатина и доксорубицина на редокс-статус эритроцитов крыс при экспериментальном раке яичников зависит от способа введения химиопрепарата. При традиционном внутривенном введении сохраняются явления оксидативного стресса, но нивелируются явления карбонильного стресса. АГХТ, напротив, нивелирует оксидативный, но сохраняет состояние карбонильного стресса.
Ключевые слова: рак яичников, эритроциты, аутогемохимиотерапия, полихимиотерапия, перекисное окисление.
Введение. Окислительный стресс в настоящее время рассматривается как универсальный неспецифический механизм инициации опухолевого роста [1, 2]. При этом сво-боднорадикальные реакции играют ключевую роль не только в процессе первичной малигни-зации, но и в прогрессировании неоплазмы [3].
Установлено, что на ранних этапах развития злокачественная опухоль оказывает существенное влияние на эритрон. В циркулирующих эритроцитах, в частности, снижается концентрация свободных радикалов. Результатом воздействия неоплазмы является изменение морфофункциональных свойств
эритроцитов. Установлено, что средняя продолжительность жизни эритроцитов у пациентов со злокачественными опухолями снижается в 1,5-2 раза. Возникающая при этом анемия является одним из частых осложнений. По данным регистрационных исследований БСЛ8, в странах Евросоюза анемия (содержание гемоглобина менее 120 г/л) имела место у 39 % онкологических больных [4]. И если анемия не констатировалась на момент постановки диагноза, то с вероятностью 62 % она развивалась в процессе лечения. Анемия и возникающая при этом тканевая гипоксия снижают эффективность лечения рака. Изменяется биология опухоли. В частности, через активацию генов семейства ЯШ усиливается продукция УБОБ, отвечающего за ангиогенез в опухоли и способствующего её росту и метастазированию. Анализ данных об оценке влияния анемии на выживаемость показал, что медиана ежегодного риска смерти онкологических больных с анемией на 65 % выше, чем больных без анемии [5].
Ранняя диагностика рака яичников (РЯ) представляет актуальную проблему современной онкогинекологии [6]. Доказано, что активация свободнорадикального окисления, усиливающаяся при нарастании опухолевой массы, лежит в основе патогенеза РЯ [7, 8]. Злокачественные опухоли яичников чувствительны к проведению лекарственной полихимиотерапии (ПХТ). Однако у пациенток с РЯ Ш-ГУ стадий возможности ПХТ, обладающей выраженным токсическим воздействием, ограничены в связи с уже имеющимися нарушениями метаболических функций в результате нарастания опухолевой массы в организме [9]. Использование аутогемохимио-терапии (АГХТ), по мнению авторов метода, значимо снижает токсические эффекты лечения [10]. Однако в доступной литературе отсутствуют данные о влиянии АГХТ на мор-фофункциональное состояние эритроцитов циркулирующей крови, нарушение которого приводит к анемии.
Цель исследования. Оценка редокс-статуса эритроцитов периферической крови при экспериментальном раке яичников на фоне АГХТ цисплатином и доксорубицином.
Материалы и методы. Экспериментальные исследования были проведены на 144 белых беспородных крысах массой 180200 г. Модель рака яичников воспроизводили путем перевивки опухолевого штамма асцит-ной опухоли яичника (АОЯ) (НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва). После предварительного пассажа на 8-й день после внутрибрюшинной перевивки от одной крысы был взят асцит и перевит животным экспериментальной группы в объеме 0,5 мл 9-дневного инокулята (асцитическая жидкость с 7^107 опухолевых клеток) и 0,5 мл питательной среды 199 на 100 г массы животного [11]. Все животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. Были соблюдены правила гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР от 12.08.1977 № 755, положениями Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг., а также требованиями этического комитета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета. Животных умерщвляли путем декапитации под эфирным наркозом. В исследованиях использованы доксорубицин (ДОК) («Эбеве», Австрия) и цисплатин (ЦП) («ЛЭНС-Фарм», Россия), в качестве антикоагулянта - гепарин.
Дозу для введения цитостатиков рассчитывали по номограмме на квадратный метр поверхности тела животного [12]: для доксо-рубицина - 40 мг/м2, для цисплатина -75 мг/м2. АГХТ осуществляли путем реинфу-зии крови (1,0 мл), проинкубированной в термостате в течение 45 мин при 37 °С с ге-моконсервантом и химиопрепаратом, в яремную вену животным. ПХТ проводили путем введения в яремную вену химиопрепаратов, растворенных в физиологическом растворе. Кровь для исследования редокс-статуса периферических эритроцитов забирали через 3 и 8 дней после ПХТ и АГХТ.
Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах оценивали по уровню диеновых конъюгатов (ДК), кетодие-нов (КД), шиффовых оснований (ШО) по интенсивности поглощения при длинах волн соответственно 232, 278 и 400 нм в гептано-вом экстракте по методу И.А. Волчегорского [12]. Уровень малонового диальдегида (МДА) определяли в тесте с тиобарбитуровой кислотой [13]. Содержание продуктов окислительной модификации белков (ОМБ) оценивали при 346, 370, 430, 530 нм по методу R.L. Levin (1990) в модификации Е.Е. Дубининой [14]. Активность антиоксидантных ферментов (АОФ), а именно супероксид-дисмутазы (СОД), оценивали по способности конкурировать с нитросиним тетразолием за супероксид-анион по методу M. Nishikimi; активность каталазы - по скорости утилизации Н2О2; активность глутатион-трансферазы (ГТ) - по скорости ферментативного образования 08-2,4-динитробензола в катализируемой ферментом реакции восстановления глу-татиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом [15].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (Stata 6.0) и стандартных пакетов Microsoft Excel (2007). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение. Полученные результаты представлены в табл. 1.
В результате проведенных исследований установлено значимое повышение на всех изучаемых стадиях уровня продуктов перекисного окисления липидов (ДК, КД, ШО, МДА) в эритроцитах крыс с АОЯ по сравнению с ин-тактными. Одновременное значимое и выраженное снижение активности антиоксидант-ных ферментов (ГТ, каталазы и СОД) может свидетельствовать о возможности возникновения в эритроцитах крыс с АОЯ оксидативного стресса. На развитие в этих эритроцитах карбонильного стресса указывает значимое возрастание альдегидных (,=346 нм) и кетонных (370 нм) групп нейтрального характера и кар-
бонильных производных основного характера (430 и 530 нм).
Введение ДОК и ЦП методом АГХТ од-нонаправленно и значимо снижало уровни всех продуктов ПОЛ. При ПХТ на фоне введения ДОК и ЦП изменение уровней продуктов ПОЛ было разнонаправленным: уровень МДА снижался, уровни ДК и КД (при введении ЦП) возрастали; уровень ШО снижался на фоне введения ДОК и не изменялся на фоне введения ЦП.
В то же время на фоне АГХТ и ПХТ с использованием ДОК и ЦП однонаправленно и значимо возрастала активность антиоксидант-ных ферментов (каталазы и СОД). Активность ГТ возрастала только при использовании АГХТ. Введение ДОК традиционным способом значимо снижало активность ГТ, а на фоне введения ЦП активность ГТ не изменялась.
Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о нивелировании явлений оксидативного стресса на фоне АГХТ с использованием ДОК и ЦП в эритроцитах организма-опухоленосителя. Анализ параметров ОМБ показал снижение уровня продуктов всех четырех групп на фоне ПХТ по сравнению с уровнем до введения химиопре-паратов. На фоне АГХТ произошло снижение альдегидных и кетонных групп нейтрального характера. Уровень альдегидных и кетонных групп основного характера в эритроцитах крыс с АОЯ на фоне АГХТ возрос по сравнению с уровнем до введения.
Сравнительный анализ изученных параметров на фоне ПХТ и АГХТ показал, что все исследуемые показатели значимо различаются для обоих препаратов в зависимости от способа введения. При этом при АГХТ более выражено снижение параметров ПОЛ и повышение ГТ, но одновременно имеет место возрастание уровней некоторых продуктов ОМБ.
Заключение. АГХТ с использованием ЦП и ДОК при экспериментальном РЯ нивелирует явления оксидативного стресса в эритроцитах организма-опухоленосителя.
Таблица 1
Параметры компонентов системы ПОЛ-АО и уровни продуктов ОМБ в эритроцитах крыс с АОЯ
на фоне введения доксорубицина и цисплатина
Группа МДА, мкмоль/НЬ ДК, ед. оп. пл./НЬ кд, ед. оп. пл./НЬ шо, ед. оп. пл./НЬ гт, мкмоль/мпн/л Каталаза, моль/мпн/НЬ СОД, у.е./л ОМБ
346 нм/ мг Б 370 нм/мг Б 430 нм/мг Б 530 нм/мг Б
Контроль (п=24) 180,69±3,59 0,962±0,015 0,140±0,018 0,035±0,009 0,542±0,043 6,123±0,066 4,044±0,361 0,353±0,004 0,502±0,008 0,316±0,002 0,049±0,003
РЯ (п=24) 281,85±49,65 * 1,300±0,226 * 0,211±0,031 * 0,036±0,008 0,141±0,021 * 0,937±0,030 * 0,643±0,097 * 0,651±0,059 * 0,811±0,031 * 0,427±0,099 0,161±0,037 *
ДОК АГХТ (п=24) 91,021±17,552 *#' 1,163±0,031 *#• 0,084±0,012 *#' 0,004±0,001 *• 0,150±0,023 *• 2,986±0,077 *#' 1,343±0,108 *#' 0,525±0,015 *#' 0,551±0,027 0,444±0,090 0,205±0,025 *#'
ПХТ (11=24) 211,271±38,973 *# 2,291±0,163 *# 0,118±0,029 0,009±0,002 *# 0,043±0,003 *# 1,134±0,116 *# 3,079±0,348 *# 0,267±0,029 *# 0,332±0,037 *# 0,214±0,014 *# 0,052±0,005 #
ЦП АГХТ (п=24) 73,525±7,071 *#' 1,152±0,068 *#' 0,090±0,010 *#' 0,005±0,001 *#' 0,182±0,023 *#' 3,575±0,236 *#' 1,670±0,078 *#' 0,471±0,053 *#' 0,468±0,049 *#' 0,405±0,014 0,207±0,067 *#'
ПХТ (11=24) 189,063±21,159 # 1,514±0,184 *# 0,297±0,030 *# 0,033±0,003 0,135±0,017 * 6,824±1,35 # 2,469±0,207 *# 0,155±0,020 *# 0,325±0,014 *# 0,169±0,050 *# 0,056±0,004 #
Примечание. Значимые изменения по сравнению со значениями: * - в контроле (непараметрическая статистика, парный критерий Вилкоксона); # - до введения цитостатиков АГХТ; * - на фоне ПХТ.
Литература
1. Винокурова Е.А., Франк Н.Н., Боярских Н.В. Антиоксидантная активность и перекисное окисление липидов у больных раком эндометрия. Сибирский онкологический журн. 2007; Прил. 1: 125-126.
2. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Ann. Bot. (Lond.). 2003; 91: 179-194.
3. Obeidat B., Mohtaseb A., Matalka I. The diagnosis of endometrial hyperplasia on curettage: how reliable is it? Arch. Gynecol. Obstet. 2009; 279: 489-492.
4. The European Cancer Anaemia Survey (ECAS): a large, multinational, prospective survey defining the prevalence, incidence, and treatment of anaemia in cancer patients. Eur. J. Cancer. 2004; 40 (15): 2293-2306. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15454256 (дата обращения: 18.02.2016).
5. Caro J.J., Salas M., Ward A, Goss G. Anemia as an independent prognostic factor for survival in patients with cancer: a systemic, quantitative review. Cancer. 2001; 91 (12): 2214-2221.
6. Бохман Я.В. Руководство по онкогинекологии. М.: Медицина; 2002. 534.
7. Антонеева И.И., Абакумова Т.В., Арсланова Д.Р., Чеснокова Н.П. О патогенетической взаимосвязи процессов липопероксидации, ферментативного звена антиоксидантной системы неоплазмы и функционального состояния нейтрофилов асцитической жидкости при прогрессировании рака яичников у крыс. Вестник новых медицинских технологий. 2008; 4: 16-17.
8. Mylonas I., Jeschke U., Shabani N. Steroid receptors ERalpha, ERbeta, PR-A and PR-B are differentially expressed in normal and atrophic human endometrium. Histopathol. 2007; 22 (2): 169-176.
9. Adam H., Hug S., Bosshard G. Chemotherapy near the end of life: a retrospective single-centre analysis of patients' charts. BMC Palliat Care. 2014; 13: 26-29.
10. Сидоренко Ю.С. Экстракорпоральное инкубирование цитостатиков в естественных средах организма - новые методы эффективной и щадящей химиотерапии рака. Сибирский онкологический журн. 2004; 3: 35-39.
11. Васильева Г. С. Биология трансплантируемых опухолей Алма-Ата; 1982. 216.
12. Волчегорский В.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропаноловых экстрактах крови. Вопросы медицинской химии. 1989; 1: 127-131.
13. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой. Лабораторное дело. 1988; 11: 41-43.
14. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма. Успехи современной биологии. 1989; 1 (4): 3-18.
15. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика. Справочник: в 2 т. Т. 2. СПб.: Интермедика; 1999. 656.
REDOX STATUS OF PERIPHERAL BLOOD ERYTHROCYTES IN EXPERIMENTAL OVARIAN CANCER ON THE BACKGROUND OF AUTOHEMOCHEMOTHERAPY WITH CISPLATIN
AND DOXORUBICIN
E.Yu. Nasyrova, D.R. Dolgova, T.V. Abakumova, I.I. Antoneeva, S.O. Gening, T.P. Gening
Ulyanovsk State University, Ulyanovsk, Russia
e-mail: Naum-53@yandex.ru
Objective of the study was to evaluate the redox status of peripheral red blood cells in experimental ovarian cancer on the background of autohemochemotherapy (AHCT) with cisplatin and doxorubicin. Material and methods. In erythrocytes of 120 white outbred rats with transplantable ascitic ovarian cancer (AOC) the intensity of lipid peroxidation (LPO) was evaluated by the level of diene conjugates, ketodienes, Schiff bases and malondialdehyde at 3 and 8 days after intravenous infusion and AHCT with cisplatin and doxorubicin in doses 75 and 40 mg/m2, respectively. Results and discussion. Rats with AOC have an increase in the level of lipid peroxidation products while reducing the activity of catalase and glutathione transferase, which indicates the occurrence of oxidative stress. A significant increase in the amount of protein oxidative modification products thus indicates the development of carbonyl stress. The infusion of cisplatin and doxorubicin using AHCT significantly reduces the levels of lipid peroxidation products in the studied parameters in contrast to conventional intravenous infusion of chemodrugs, in which the change in the levels of lipid peroxidation products was multidirectional. The activity of catalase and SOD increased on the background of the use of both methods, and the activity of GT - only when using AHCT. These data suggests the elimination of oxidative stress effects in red blood cells of rats with AOC on the background of AHCT with cisplatin and doxorubicin. Effect of cisplatin and doxorubicin on the redox status of erythrocytes in experimental ovarian cancer in rats depends on the chemotherapy infusion route. In conventional intravenous infusion, the phenomenon of oxidative stress persists, but the carbonyl stress phenomenon is eliminated. The AHCT, in contrast, eliminates oxidative but retains carbonyl stress condition.
Keywords: ovarian cancer, red blood cells, autohemochemotherapy, chemotherapy, peroxidation.
References
1. Vinokurova E.A., Frank N.N., Boyarskikh N.V. Antioksidantnaya aktivnost' i perekisnoe okislenie li-pidov u bol'nykh rakom endometriya [The antioxidant activity and lipid peroxidation in patients with endometrial cancer]. Syberian Journal of Oncology. 2007; Pril. 1: 125-126 (in Russian).
2. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Ann. Bot. (Lond.). 2003; 91: 179-194.
3. Obeidat B., Mohtaseb A., Matalka I. The diagnosis of endometrial hyperplasia on curettage: how reliable is it? Arch. Gynecol. Obstet. 2009; 279: 489-492.
4. The European Cancer Anaemia Survey (ECAS): a large, multinational, prospective survey defining the prevalence, incidence, and treatment of anaemia in cancer patients. Eur. J. Cancer. 2004; 40 (15): 2293-2306. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15454256 (accessed: 18.02.2016).
5. Caro J.J., Salas M., Ward A., Goss G. Anemia as an independent prognostic factor for survival in patients with cancer: a systemic, quantitative review. Cancer. 2001; 91 (12): 2214-2221.
6. Bokhman Ya. V. Rukovodstvo po onkoginekologii [Manual of gynecological Oncology]. M.: Medicine; 2002. 534. (in Russian).
7. Antoneeva I.I., Abakumova T.V., Arslanova D.R., Chesnokova N.P. O patogeneticheskoy vzaimosvya-zi protsessov lipoperoksidatsii, fermentativnogo zvena antioksidantnoy sistemy neoplazmy i funktsion-al'nogo sostoyaniya neytrofilov astsiticheskoy zhidkosti pri progressirovanii raka yaichnikov u krys [About pathogenetic relationship of lipid peroxidation, enzymatic link of the antioxidant system neop-lasia and functional status of neutrophils ascites with the progression of ovarian cancer in rats]. Journal of New Medical Technologies. 2008; 4: 16-17 (in Russian).
8. Mylonas I., Jeschke U., Shabani N. Steroid receptors ERalpha, ERbeta, PR-A and PR-B are differentially expressed in normal and atrophic human endometrium. Histopathol. 2007; 22 (2): 169-176.
9. Adam H., Hug S., Bosshard G. Chemotherapy near the end of life: a retrospective single-centre analysis of patients' charts. BMCPalliat Care. 2014; 13: 26-29.
10. Sidorenko Yu. S. Ekstrakorporal'noe inkubirovanie tsitostatikov v estestvennykh sredakh organizma -novye metody effektivnoy i shchadyashchey khimioterapii raka [In vitro incubation of cytostatics in the natural environment of the body - new methods of effective and gentle cancer chemotherapy]. Syberian Journal of Oncology. 2004; 3: 35-39 (in Russian).
11. Vasil'eva G. S. Biologiya transplantiruemykh opukholey [Biology transplanted tumors]. Alma-Ata; 1982. 216 (in Russian).
12. Volchegorskiy V.A., Nalimov A.G., Yarovinskiy B.G. Sopostavlenie razlichnykh podkhodov k oprede-leniyu produktov perekisnogo okisleniya lipidov v geptan-izopropanolovykh ekstraktakh krovi [Comparison of different approaches to the definition of lipid peroxidation products in the hep-tane-isopropanol extracts of blood]. Voprosy medicinskoj himii. 1989; 1: 127-131 (in Russian).
13. Andreeva L.I., Kozhemyakin L.A., Kishkun A.A. Modifikatsiya metoda opredeleniya perekisey lipidov v teste s tiobarbiturovoy kislotoy [Modification of the method for determining lipid peroxides in the test with thiobarbituric acid]. Laboratornoe delo. 1988; 11: 41-43 (in Russian).
14. Dubinina E.E. Biologicheskaya rol' superoksidnogo anion-radikala i superoksiddismutazy v tkanyakh organizma [The biological role of superoxide anion radical, and superoxide dismutase in the tissues of the organism]. Biology Bulletin Reviews. 1989; 1 (4): 3-18 (in Russian).
15. Karpishchenko A.I. Meditsinskie laboratornye tekhnologii i diagnostika [Medical Laboratory Diagnostics (programs and algorithms)]. St-Peterburg: Intermedica; 1999. 656 (in Russian).
