CC BY
48
УДК 577.344.3
СИСТЕМА «ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ - АНТИОКСИДАНТЫ» У МЫШЕЙ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ РАКОМ ШЕЙКИ МАТКИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВКР-ЛАЗЕРА*
О.С. Воронова, Д.Р. Долгова, Т.В. Абакумова, И.О. Золотовский, И.И. Антонеева
ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»
Исследовалось влияние излучения ВКР-лазера с длиной волны 1265 нм на редокс-зависимые процессы в эритроцитах и плазме крови мышей с раком шейки матки. В плазме крови и эритроцитах здоровых мышей и мышей с экспериментальным раком шейки матки оценивали перекисное окисление липидов по уровню малонового диальдегида и ферментативное звено антиоксидантной системы по активности каталазы, супероксид-дисмутазы, глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы после воздействия ВКР-лазера в дозах 0,2 и 1 кДж/см2. Установлено, что излучение ВКР-лазера в дозе 1 кДж/см2 инициирует развитие выраженного оксидативного стресса в организме-опухоленосителе, не вызывая нарушения функционирования системы «перекисное окисление липидов - ан-тиоксиданты» в организме здоровых животных.
Ключевые слова: ВКР-лазер, оксидативный стресс, редокс-зависимые процессы, рак шейки матки.
Введение. Высокоинтенсивное лазерное излучение (ЛИ) используется в хирургии для нанесения поверхностных и глубинных разрезов, испарения поверхностных дефектов кожи, коагуляции и карбонизации тканей, их стерилизации. В ряде работ показана перспективность использования высокоинтенсивного лазерного излучения вынужденного комбинационного рассеивания (ВКР) для лечения онкологических заболеваний [1, 8]. В течение нескольких лет активно рассматривается идея, согласно которой инфракрасный свет инициирует фотохимические реакции, напрямую возбуждая молекулы кислорода в биологических системах [9, 10, 12, 13]. При этом происходит фотогенерация синг-летного кислорода, который может участвовать в цепных свободнорадикальных реакциях, вызывать окисление белковых молекул, инициировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ). Результатом такого воздействия может стать гибель клеток путем некроза или апоптоза.
* Работа поддержана гос. заданием Минобрнауки России.
Мощным источником излучения, способным эффективно работать в этой области, может служить ВКР-лазер с накачкой от ит-тербиевого волоконного лазера [11]. Показано, что максимальная генерация синглетного кислорода достигается при облучении на длине волны 1264-1270 нм [8]. При этом ширина спектра действия по полувысоте составляет 15-20 нм. Показана исключительная перспективность использования таких излучателей для лечения онкологических заболеваний [6].
Данные о влиянии ЛИ на целостный организм представляются значимыми при разработке схем его использования в терапии опухолей. В наших исследованиях показано, что непрерывное облучение ВКР-лазером в дозе 1 кДж/см2 мышей с экспериментальным раком шейки матки (РШМ) стимулирует возникновение оксидативного стресса в неоплазме [2]. Однако мы не оценивали влияние используемых доз облучения на целостный организм.
Цель исследования. Оценка влияния непрерывного высокоинтенсивного лазерного излучения с рабочей длиной волны 1265 нм на редокс-зависимые процессы в организме-опухоленосителе.
Материалы и методы. Работа выполнена на белых беспородных мышах (п=96) с экспериментальным раком шейки матки (РШМ-5, опухолевый штамм из НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН). Облучение начинали на 18-20-е сут в стадии интенсивного роста опухоли (средний объем опухоли составлял 0,55 см3).
Источником ЛИ явился непрерывный волоконный лазер, генерация в котором осуществляется в процессе вынужденного ком-
бинационного рассеяния, с длиной волны 1265 мкм, являющийся совместной разработкой Института общей физики РАН и Центра нанотехнологий Ульяновского государственного университета. В качестве среды преобразователя использовалось стандартное телекоммуникационное волокно. Максимальная непрерывная выходная мощность используемого излучения составила около 4 Вт на длине волны 1265+3 нм. Соответствующий спектр излучения представлен на рис. 1.
и" 0,6 ч
г?
1264 1266
Длина волны,нм
Рис. 1. Спектр излучения ВКР-лазера
Для облучения мышей фиксировали на расстоянии 30 см от объекта излучения. Зону облучения выстригали. Средняя интенсивность излучения составляла 0,177 Вт/см2, что значительно ниже границ перехода нетеплового действия к термическому (0,5-1 Вт/см2). Последнее исключает тепловые эффекты лазерного воздействия в указанном диапазоне.
Плотность энергии ЛИ, поглощаемого биотканью (Э, Дж/см2), с учетом большей (по сравнению с глубиной проникновения ЛИ, составляющей на длине 1265 нм менее 1,5 мм) толщины облучаемой биоткани рассчитывалась из соотношения
Э=Р^,
где Р - средняя мощность излучения, Вт; t -время облучения, с; S - площадь лазерного пятна на биоткани, см2.
При облучении в течение 10 мин доза высокоинтенсивного излучения составляла 0,1 кДж/см2, а при 2-минутном облучении -0,02 кДж/см2. Таким образом, суммарная до-
за 10 сеансов в первом случае составила 1 кДж/см2, а во втором - 0,2 кДж/см2.
Через сутки после последнего облучения животные выводились из эксперимента под эфирным наркозом. Эксперимент проводился в соответствии с положениями Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.
Уровень перекисного окисления липидов в эритроцитах и плазме оценивался по содержанию малонового диальдегида (МДА). Для оценки антиоксидантной системы (АОС) биохимически оценивали активность супер-оксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатион-редуктазы (ГР) и глутатион^-трансферазы (ГТ).
Статистическая значимость полученных результатов оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.
= 0,4
0,0
Результаты и обсуждение. Одним из условий развития и роста злокачественной опухоли является перестройка свободноради-кальных процессов в организме [2, 7]. Нами установлено, что при экспериментальном раке шейки матки в эритроцитах и плазме крови (табл. 1, 2) повышен уровень МДА. При этом в эритроцитах увеличивается активность ГТ, ГР и каталазы, в плазме увеличивается активность каталазы и ГТ (табл. 1, 2), что свидетельствует о переходе системы ПОЛ-АОС на более высокий уровень функционирования [5] и не позволяет предполагать развитие оксидативного стресса.
В результате проведенных исследований также было установлено, что непрерывное лазерное облучение на длине волны 1265+3 нм в дозах 0,2 и 1 кДж/см2 контрольных мышей приводит к достоверному дозозависимому увеличению уровня МДА в эритроцитах при
одновременном повышении активности ферментов АОС (табл. 1).
У мышей с РШМ облучение лазером ВКР в дозе 0,2 кДж/см2 в эритроцитах статистически значимо снижает уровень МДА, активность ГТ и каталазы. При этом уровень СОД и ГР колеблется в пределах коридора нормы. Снижение активности ферментов АОС коррелирует с падением уровня МДА (г=0,0257, р<0,5). Можно предположить, что в условиях усиленной пероксидации мембран эритроцитов снижение содержания МДА могло быть вызвано усилением его связывания с мембраной, активацией альдегиддегид-рогеназы, участвующей в метаболизме МДА в эритроцитах [4]. При облучении в дозе 1 кДж/см2 уровень МДА и активность ферментов АОС в эритроцитах мышей достоверно не изменяются (табл. 1).
Таблица 1
Показатели системы ПОЛ-АОС в эритроцитах здоровых мышей и мышей с РШМ-5 после облучения ВКР-лазером
Экспериментальная группа МДА, мкмоль/л СОД, у-е- Каталаза, моль/с/л ГР, ммоль/мин/л ГТ, ммоль/мин/л
Контрольные мыши, п=48 без облучения 219,65±7,57 1,46±0,10 17,13±0,64 0,43±0,03 0,14±0,02
0,2 кДж/см2 279,66±13,32* 2,04±0,12* 55,51±4,62* 0,53±0,04* 0,26±0,01*
1 кДж/см2 376,07±16,78* 1,64±0,18 74,32±18,56* 0,52±0,04* 0,24±0,03*
Мыши с РШМ-5, п=48 без облучения 325,94±14,36 1,46±0,14 60,09±3,02 0,61±0,06 0,56±0,06
0,2 Дж/см2 260,86+18,22* 1,22±0,23 49,41±1,77* 0,72±0,09 0,18+0,01*
1 кДж/см2 318,50±27,91 1,25±0,12 65,93±6,04 0,78±0,09 0,70±0,08
Примечание. * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных до облучения.
У контрольных мышей при облучении в дозе 0,2 кДж/см2 в плазме крови наблюдается значительное повышение уровня МДА при одновременном повышении ГТ и неизменной активности остальных ферментов АОС. Доза в 1 кДж/см2 вызывает значимое увеличение уровня МДА и снижение активности АОС в плазме крови контрольных мышей (табл. 2), что позволяет предполагать развитие выраженного оксидативного стресса.
Заключение. Таким образом, степень выраженности воздействия ВКР-лазерного излучения на длине волны 1265 нм на редокс-зависимые процессы в организме с РШМ напрямую зависит от дозы облучения. Излучение ВКР-лазера в дозе 1 кДж/см2 инициирует развитие оксидативного стресса у мышей с РШМ, не вызывая нарушения функционирования системы ПОЛ-АОС в организме здоровых животных.
Таблица 2
Показатели системы ПОЛ-АОС в плазме крови здоровых мышей и мышей с РШМ-5 после облучения лазером ВКР-лазером
Экспериментальная группа МДА, мкмоль/л Каталаза, моль/с/л ГР, ммоль/мин/л ГТ, ммоль/мин/л
Контрольные мыши, n=48 без облучения 2,95±0,24 0,100±0,019 0,014±0,004 0,016±0,003
0,2 кДж/см2 3,82±0,20* 0,104±0,037 0,016±0,008 0,033±0,005*
1 кДж/см2 1,03±0,00* 0,040±0,007* 0,019±0,003 0,006±0,002*
Мыши с РШМ-5, n=48 без облучения 6,23±0,31 0,172±0,061 0,005±0,001 0,038±0,003
0,2 Дж/см2 1,82±0,46* 0,070±0,040* 0,022±0,004* 0,036±0,004
1 кДж/см2 10,70±1,26* 0,099±0,060 0,005±0,001 0,035±0,002
Примечание. * - данные, статистически значимо отличающиеся от данных до облучения.
1. Анализ эффективности использования непрерывного лазерного излучения с длиной волны 1265 нм для инициирования оксидативного стресса в ткани солидной злокачественной опухоли / Т. П. Генинг [и др.] // Квант. электроника. -2012. - Т. 42, № 9. - С. 805-807.
2. Антонеева И. И. Оксидативный стресс на разных стадиях развития рака шейки матки / И. И. Антонеева, Е. Г. Сидоренко, Т. П. Генинг // Успехи современного естествознания. - 2010. -№ 10. - С. 33-36.
3. Горожанская Е. В. Свободнорадикальное окисление и механизмы антиоксидантной защиты в нормальной клетке и при опухолевых заболеваниях / Е. В. Горожанская // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 6. - С. 28-44.
4. Липопероксидация эритроцитарных мембран у женщин с доброкачественными и злокачественными новообразованиями эндометрия / Н. В. Солопова [и др.] // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149, № 4. -С. 421-423.
5. Лю Б. Н. Роль митохондрий в развитии и регуляции уровня окислительного стресса в норме, при клеточных патологиях и реверсии опухолевых клеток / Б. Н. Лю, М. Б. Лю, Б. И. Исмаилов // Успехи современной биологии. - 2006. - Т. 126, № 4. - С. 388-398.
6. Юсупов А. С. Лазероиндуцированный све-
токислородный эффект в онкологической практике / А. С. Юсупов, С. Д. Захаров // Креативная хирургия и онкология. - 2011. - № 2. - Р. 24-32.
7. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е. Б. Меньщикова [и др.]. - М. : Слово, 2006. - 556 с.
8. Cancerous cell death from sensitizer free photoactivation of singlet oxygen / F. Anquez [et al.] // Photochem. Photobiol. - 2012. - Vol. 167. -P. 201-288.
9. Infrared laser pulse triggers increased singlet oxygen production in tumour cells / S. G. Sokolovski // Scientific Reports. - 2013. - № 3. - Р. 3484.
10. Raman fiber laser for the drug-free photodynamic therapy / A. S. Yusupov [et al.] // Laser Physics. - 2010. - Vol. 20. - P. 357.
11. Ramanlaser based on a fiber with variable mode structure / A. E. Bednyakova [et al.] // Laser Phys. - 2011. - Vol. 21. - P. 290.
12. Schweitzer C. Physical mechanisms of generation and deactivation of singlet oxygen / C. Schweitzer, R. Schmidt // Chem. Rev. - 2003. -Vol. 103. - P. 1685.
13. Solvent dependence of the steady-state / A. A. Krasnovsky [et al.] // Chem. Phys. Lett. -2006. - Vol. 430. - P. 260.
14. Zakharov S. D. Light-oxygen effect as a physical mechanism for activation of biosystems by quasi-monochromatic light / S. D. Zakharov, A. V. Iva-nov // Biophysics. - 2005. - Т. 50, № l. - С. 64.
SYSTEM «LIPID PEROXIDATION - ANTIOXIDANT» MICE WITH EXPERIMENTAL CERVICAL CANCER ON EXPOSURE RAMAN LASER
O.S. Voronova, D.R. Dolgova, T.V. Abakumova, I.O. Zolotovsky, I.I. Antoneeva
Ulyanovsk State University
We investigate the effect of radiation Raman laser with a wavelength of 1265 nm on redox-dependent processes in erythrocytes and plasma of mice with cervical cancer. In plasma and erythrocytes of healthy mice and mice with experimental cervical cancer was evaluated by lipid peroxidation the malondialdehyde level and enzymatic link of the antioxidant system activity of catalase, superoxide dismutase, glutathione reductase, and glutathione transferase after exposure to the Raman laser with A=1265 nm at doses of 0,2 and 1 kJ/cm2. Found that radiation Raman laser at a dose of 1 kJ/cm2 initiates the development of a pronounced oxidative stress in the body-the tumor without causing disturbances in the system of lipid peroxidation-antioxidants in the body healthy animals.
Keywords: Raman laser, oxidative stress, redox-dependent processes, cervical cancer.
