CC BY
22
УДК 572.224
Редкие мутации в гене IDH1 в астроцитомах спинного мозга
Н. А. Коновалов1, Д. С. Асютин1, Е. Г. Шайхаев2, С. В. Капровой1, С. Ю. Тимонин1* 'Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко Минздрава России, Москва, 125047 Россия
2Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России, Москва, 117485 Россия
*E-mail: md.timonin@gmail.com
Поступила в редакцию 11.02.2020
Принята к печати 26.03.2020
DOI: 10.32607/actanaturae.10915
РЕФЕРАТ Низкая частота встречаемости глиом спинного мозга (4.3% в структуре первичных и глиальных опухолей центральной нервной системы) и связанные с этим сложности формирования статистически значимых когорт больных существенно замедляют разработку эффективных подходов к терапии опухолей спинного мозга по сравнению с опухолями головного мозга. Несмотря на существенный багаж знаний о мутациях гена IDH в интракраниальных опухолях, крайне мало известно о мутациях этого гена в астроцитомах спинного мозга. В настоящем исследовании мы сообщаем о пяти мутациях в гене IDH1, выявленных в клетках астроцитомы спинного мозга, две из которых, впервые описанные в глиомах центральной нервной системы, являются уникальными.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА IDH1, IDH2, астроцитома спинного мозга, NGS.
ВВЕДЕНИЕ
Среди первичных опухолевых заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) наиболее частыми и, следовательно, наиболее изученными являются опухоли головного мозга. По данным CBTRUS 2014 года, в структуре первичных и глиальных опухолей ЦНС первичные опухоли спинного мозга занимают 4.3%, включая эпендимомы (21%), астроцитомы (3.2%), в том числе глиобластомы, а также опухоли различной природы (5.9%) - метастазы, лимфомы, иные нейроэпидермальные образования, и пило-идные астроцитомы (0.8%). Низкая частота встречаемости глиом спинного мозга и связанная с этим сложность формирования статистически значимых выборок больных существенно замедляют изучение механизмов возникновения, прогнозирование развития, а также разработку подходов к эффективной терапии глиом спинного мозга по сравнению с опухолями головного мозга.
К настоящему времени исследование интракрани-альных астроцитом позволило определить ряд генетических маркеров, позволяющих дифференцировать степень злокачественности данных опухолей, прогнозировать течение болезни, а в некоторых случаях и способствовать проведению таргетной терапии.
Одной из важнейших находок в изучении клеток глиом головного мозга (в том числе астроцитом) стало обнаружение соматических миссенс-мутаций в генах
IDH1 и IDH2, кодирующих изоцитратдегидрогеназы 1 и 2. Мутации IDH1/2 чаще всего ассоциированы с астроцитомами II—III степени злокачественности и вторичными глиобластомами (70-80% случаев) и довольно редко (< 5%) обнаруживаются в пилоци-тарных астроцитомах и первичных глиобластомах, что делает их хорошим диагностическим маркером [1]. Кроме того, они служат важным прогностическим признаком: анапластические астроцитомы с IDH дикого типа оказываются более агрессивными и близкими к глиобластомам, чем опухоли с мутациями IDH; наиболее благоприятное течение болезни характерно для комбинации мутации в IDH и коде-леции 1p/19q [2]. Наконец, данный биомаркер может оказаться потенциально полезным и при разработке препаратов для таргетной терапии опухолей. Так, в одном из исследований выявлена частичная эффективность селективных ингибиторов изоцитрат-дегидрогеназ в случае опухолей с мутацией R132H IDH1 как в условиях in vitro, так и на моделях глиом [3]. Перечисленные характеристики мутаций IDH стали причиной их официального включения в список биомаркеров, используемых для классификации опухолей ЦНС по критериям ВОЗ [2].
В гене IDH1 в клетках глиом наиболее часто встречается гетерозиготная однонуклеотидная замена, приводящая к замене остатка аргинина на гистидин в положении 132 (R132H, >90% случаев) в активном центре фермента. Существенно реже встречаются
замены аргинина на цистеин, серин, глицин, лейцин, валин и пролин [4]. Описаны также динуклеотид-ные инсерции/делеции, приводящие к замене арги-нина-132 на цистеин (два случая анапластической астроцитомы и один случай глиобластомы головного мозга) [5] и на валин (один случай) [6], а также два случая гомозиготных мутаций в клетках анапластической астроцитомы - замена аргинина-132 на лейцин [5] и гистидин [7]. Опубликованы сообщения об обнаружении редкой замены аргинина на глута-мин в положении 100 (R100Q) изоцитратдегидроге-назы, также приводящей к потере функции белка; описаны два случая такой замены при анапласти-ческой олигодендроглиоме и один - при диффузной астроцитоме [8]. Один случай замены R100Q выявлен в клетках глиобластомы [5].
Несмотря на существенный багаж знаний о мутациях в гене IDH в интракраниальных опухолях, информации о мутациях в астроцитомах спинного мозга (АСМ) пока крайне мало, что связано с редкостью таких опухолей и, следовательно, с малым размером выборок, не обеспечивающим возможность надежного статистического анализа. К настоящему времени нами найдена информация о двух случаях обнаружения мутации IDH1 в клетках диффузной АСМ и одно описание мутации IDH2 в клетках пилоцитар-ной АСМ [9, 10]. Однако различия в механизмах возникновения и развития опухолей ЦНС различной локализации затрудняют возможность экстраполяции данных, полученных для опухолей головного мозга, на опухоли спинного мозга. Таким образом, накопление и анализ информации о мутациях IDH в клетках АСМ остаются очень актуальной задачей.
В настоящем исследовании мы сообщаем о пяти мутациях в гене IDH1, выявленных в клетках АСМ. Две из этих мутаций можно считать уникальными, так как они впервые описаны в глиомах ЦНС.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В исследование генетических мутаций было включено 50 пациентов с интрамедуллярными глиомами спинного мозга, однако в данной работе мы фокусируемся на 5 пациентах. Клинические проявления были типичными для заболевания и выражались в снижении чувствительности и слабости в конечностях. Пациентам проводили микрохирургическое удаление интрамедуллярной опухоли под контролем нейрофизиологического мониторинга. Исход хирургического лечения во всех случаях был удовлетворительным.
Выделение ДНК
ДНК выделяли из образцов опухолевой ткани, фиксированных в формальдегиде и залитых парафином
(FFPE-образцы, formalin-fixed paraffin-embedded), с использованием коммерческого набора GeneRead DNA FFPE (QIAGEN, США). Была получена пригодная для дальнейшего анализа ДНК, концентрация которой варьировала от 10 до 100 нг/мкл.
Высокопроизводительное секвенирование (NGS)
Анализ опубликованных результатов изучения генетики опухолей ЦНС позволил нам отобрать 15 генов (ATRX, EGFR, FGFR2, H3F3A, IDH1, IDH2, NF1, NF2, NTRK1, PDGFRA, PIK3CA, PIK3R1, PTEN, PTPN13, TP53), мутации в которых могут иметь непосредственное отношение к молекулярному патогенезу астроцитом спинного и головного мозга. На основе технологии AmpliSeq при участии компании Illumina разработана панель праймеров, обеспечивающая возможность селективного анализа этих генов в нашей выборке образцов ДНК на секвенаторе нового поколения MiSeq (Illumina, США).
Анализ результатов NGS
Выравнивание прочитанных последовательностей относительно референсной последовательности генома человека (hg19), а также их фильтрацию по качеству осуществляли в автоматическом режиме с помощью программы MiSeq Reporter (Illumina). Анализ (аннотацию) генетических изменений проводили с помощью программы Variant Studio 3.0 (Illumina). Для визуализации геномных данных, оценки глубины прочтения и выявления возможных ложноположительных результатов использовали программу Integrative Genomics Viewer (IGV) (Broad Institute, США). Популяционные частоты аннотированных генетических вариантов оценивали с использованием данных проекта gnomAD (gnomad.broadinstitute.org/variant/2-209113262-C-T?dataset=gnomad_r2_1). Влияние генетических вариантов генов на структуру и функции кодируемых белков предсказания выявляли с использованием биоинформатических методов Pathoman (pathoman. mskcc.org/PathoMANmethodDescription) и Condel (bbglab.irbbarcelona.org/fannsdb/). Для оценки их клинической значимости использовали базу данных NCBI ClinVar (ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного исследования ни в одном из проанализированных 46 образцов не обнаружили мутации в гене IDH2. В то же время в пяти образцах выявлены мутации в гене IDH1 (таблица).
Поскольку к настоящему моменту мутации в гене IDH1 в клетках астроцитом спинного мозга описаны лишь в двух публикациях [9, 10], причем в одной из них отсутствует детализация мутации, эти ре-
Мутации в гене IDH1, выявленные в исследовании
Мутация* Интрамедуллярная опухоль, локализация Гистологический диагноз Возраст и пол пациента
R132H Два узла опухоли на уровне С3-5, ТЬ2-3 позвонков Пилоидная астроцитома Ж, 32
R132H С2-С3 Анапластическая астроцитома Ж, 28
R132G С5-7 Диффузная астроцитома Ж, 33
R82K С7-ТЫ Пилоидная астроцитома Ж, 21
I76T С1-С6 Пилоидная астроцитома М, 19
*R - аргинин, H - гистидин, G - глицин, K - лизин, I - изолейцин, T - треонин.
Рис. 1. Обнаружение мутации c.245G> A (p.R82K) в гене IDH1 методом NGS. Представлен фрагмент диаграммы многократного прочтения фрагмента хромосомы 2, на которой локализован ген IDH1 (Программа визуализации геномных данных - Integrative Genomics Viewer (IGV)). Красным показана замена С> T в положении 208248538 хромосомы 2, которая соответствует замене c.245G> A в гене IDH1. Общая глубина прочтения данного региона составила 761Х, количество прочтений мутантного нуклеотида T составило 341 (45%)
зультаты имеют высокую степень новизны. В гене IDH1, выделенном из образца диффузной астроци-томы спинного мозга, выявлена мутация, определяющая аминокислотную замену R132S (Arg^Ser) в молекуле фермента [9]. Наши результаты показывают, что в клетках АСМ возможно появление еще двух замен в данной позиции IDH1 - R132H (Arg^His) и R132G (Arg^Gly). Обе эти замены найдены в IDH1 в астроцитомах головного мозга, причем первая из них относится к наиболее распространенному варианту.
AGbAGTGATAGTGGCACA
Рис. 2. Обнаружение мутации c.227T> C (p.Ile76Thr) в гене IDH1 методом NGS. Представлен фрагмент диаграммы многократного прочтения фрагмента хромосомы 2, на которой локализован ген IDH1 (Программа визуализации геномных данных - Integrative Genomics Viewer (IGV)). Оранжевым показана замена A> G в положении 208248556 хромосомы 2, которая соответствует замене c.227T> C в гене IDH1. Общая глубина прочтения данного региона составила 585Х, количество прочтений мутантного нуклеотида G составило 317 (54%)
Особого внимания заслуживают еще две замены, обнаруженные в позициях 82 (А^^уэ, R82K) и 76 (11е^№г, 176Т) ГОН1 (рис. 1, 2). Это наследственные мутации, имеющие очень низкие частоты встречаемости. По данным ресурса gnomAD, популяцион-ная частота варианта R82K составляет 0.002475%, а 176Т - 0.0003977%. Обе эти замены описаны впервые не только в астроцитомах спинного мозга, но и в опухолях ЦНС в целом. Нам удалось найти лишь две публикации, в которых первая мутация ^82К) была описана у пациентов с острым миелоидным лейкозом [11] и первичной меланомой кожи [12]. Данные о второй мутации (176Т) нами не обнаружены. Следует также отметить, что образцы с данными уникальными мутациями не содержали ни одной из других ассоциированных с астроцитомами мутаций, включенных в панель для анализа (АТКХ, EGFR, FGFR2, H3F3A,
NF1, NF2, NTRK1, PDGFRA, PIK3CA, PIK3R1, PTEN, PTPN13, TP53; данные не приведены).
Использованные нами методы предсказания влияния выявленных аминокислотных замен на структуру и функцию белков (Pathoman и Condel) указывают на повреждающее действие замен R82K и I76T. В базе данных NCBI ClinVar эти мутации характеризуются как варианты с неизвестным значением. Для определения их возможного эффекта необходимы более детальные исследования.
Таким образом, в результате проведенного исследования получена новая информация о мутациях в гене IDH1 в клетках АСМ. Обнаружены две уникальные мутации, не описанные ранее в клетках опухолей ЦНС. Дополнительное значение полученных результатов связано с тем, что официальная классификация опухолей по версии ВОЗ предусматривает использование мутаций в гене IDH1 в качестве одного из маркеров, имеющих высокую диагностическую и прогностическую ценность. Поскольку в подавляющем большинстве случаев мутации в данном гене представлены вариантом R132H, то для анализа, как правило, используется иммуногистохимиче-
ское окрашивание соответствующими антителами. Однако выявление других мутантных вариантов в этом случае становится невозможным. В нашем случае из пяти обнаруженных мутаций только две относились к доминирующему варианту, при этом они оказались уникальными. Следовательно, выявление подобного рода мутаций возможно исключительно с применением секвенирования. В связи с этим для выявления редких типов мутаций в генах IDH в образцах АСМ желательно использовать методы NGS-секвенирования.
Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.
От каждого из включенных в исследование участников получено информированное добровольное согласие. •
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (номер проекта 18-29-01042).
CnMCOK BMTEPATYPH
1. Huse J.T., Aldape K.D. // Clin. Cancer Res. 2014. V. 20. № 22. P. 5601-5611.
2. Christians A., Adel-Horowski A., Banan R., Lehmann U., Bartels S., Behling F., Barrantes-Freer A., Stadelmann C., Rohde V., Stockhammer F., et al. // Acta Neuropathol. Commun. 2019. V. 7. Article 156.
3. Rohle D., Popovici-Muller J., Palaskas N., Turcan S., Grom-mes C., Campos C., Tsoi J., Clark O., Oldrini B., Komisopoulou E., et al. // Science. 2013. V. 340. P. 626-630.
4. Yang H., Ye D., Guan K.-L., Xiong Y. // Clin. Cancer Res. 2012. V. 18. P. 5562-5571.
5. Gupta R., Flanagan S., Li C.C.Y., Lee M., Shivalingham B., Maleki S., Wheeler H.R., Buckland M.E. // Modern Pathol. 2013. V. 26. P. 619-625.
6. Balss J., Meyer J., Mueller W., Korshunov A., Hartmann C., von Deimling A. // Acta Neuropathol. 2008. V. 116. P. 597-602.
7. Singh A., Gurav M., Dhanavade S., Shetty O., Epari S. // Neuropathol. 2017. V. 37. P. 582-585.
8. Pusch S., Sahm F., Meyer J., Mittelbronn M., Hartmann C., von Deimling A. // Neuropatholog. Appl. Neurobiol. 2011. V. 37. P. 428-430.
9. Takai K., Tanaka S., Sota T., Mukasa A., Komori T., Taniguchi M. // World Neurosurg. 2017. V. 108. P. 991.e13-991.e16.
10. Biczok A., Dorostkar M., Egensperger R., Tonn J.-C., Zausinger S. // Neuro Oncol. 2018. V. 20 (suppl. 6). P. vi167.
11. Sestakova S., Krejcik Z., Folta A., Cerovska E., Salek
C., Merkerova M.D., Pecherkova P., Racil Z., Mayer J., Cet-kovsky P., Remesova H. // Cancer Biomark. 2019. V. 25. P. 43-51.
12. Ticha I., Hojny J., Michalkova R., Kodet O., Krkavcova E., Hajkova N., Nemejcova K., Bartu M., Jaksa R., Dura M., et al. // Sci. Rep. 2019. V. 9. Article 17050.
