CC BY
41
УДК 616.153.915:611.018.74:616.13-004.6
развитие эндотелиальной дисфункции при экспериментальной гиперлипидемии
Е.П. Турмова1, П.А. Лукьянов2, А.А. Григорюк1, Е.А. Бычков1, А.В. Цыбульский3
1 Владивостокский государственный медицинский университет (690950 г. Владивосток, пр-т Острякова, 2),
2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159),
3 Дальневосточный федеральный университет (690091 г. Владивосток, ул. Суханова, 8)
Ключевые слова: гиперлипидемия, цитокины, эндотелиальная дисфункция, эксперимент.
Оценивались содержание некоторых цитокинов, НАДФ-диа-форазы и показатели общей оксидантной и антиоксидантной активности в стенках аорты и бедренных артерий у крыс линии Вистар при экспериментальной гиперлипидемии. Зарегистрированы снижение уровня НАДФ-диафоразы в эндотелии. И в эксперименте, и в интактном контроле уровень интерлейкина-4 в аорте оказался значительно ниже, чем в бедренной артерии. При гиперлипидемии в бедренных артериях отмечалось снижение содержания интерлейкина-4, а в стенке аорты - увеличение уровней интерлейкина-4 и у-интерферона и уменьшение окси-дантной и антиоксидантной активности с низким оксидантным индексом. Установлено стимулирующее влияние интерлейки-на-4 и ингибирующее действие у-интерферона на общую окси-дантную и антиоксидантную активность в стенке аорты.
С современных позиций ключевым звеном в патогенезе атеросклероза считается эндотелиальная дисфункция с дисбалансом между основными функциями эндотелия: вазодилатацией и вазоконстрикцией, ингибированием и содействием пролиферации, антитромботической и протромботической, антиокислительной и проокис-лительной активностью [1, 4, 5, 11, 14]. Показано, что при атеросклерозе наблюдается интенсификация процессов перекисного окисления липидов и снижение уровня антиоксидантной защиты [2, 4, 7].
Повреждение эндотелия сопровождается активацией (праймингом) полиморфно-ядерных лейкоцитов (нейтрофилов), усилением секреции ими активных форм кислорода (синглентного кислорода и перекиси водорода) и интенсификацией перекисного окисления белков и жирных кислот [7]. Оксид азота - сигнальная молекула, которая осуществляет межклеточные взаимодействия и регулирует перекисное окисление липидов. В физиологических условиях оксид азота выступает в роли антиоксиданта, тормозит радикальные окислительные реакции, связываясь со свободными ионами двухвалентного железа, входящими в состав гема. При гиперпродукции активных форм кислорода происходит окисление липопротеидов, что способствует повышению синтеза кавеолина-1 и приводит к снижению образования оксида азота эндотелием [4, 7]. При активации свободнорадикальной активности происходит реакция супероксид-аниона с оксидом азота и образуется пероксинитрит, который служит пусковым фактором в развитии воспаления и повреждения тканей, по токсичности значительно превосходит оксид азота и лишает его биологического действия как фактора релаксации [4]. Пероксинитрит стимулирует
Турмова Екатерина Павловна - канд. мед. наук, доцент кафедры патологической физиологии ВГМУ; e-mail: [email protected]
апоптоз и некроз клеток эндотелия и повышает их чувствительность к другим повреждающим факторам. Свое действие пероксинитрит реализует за счет инициации перекисного окисления липидов в мембранах и липопротеинах [2, 4]. Синтез оксида азота в организме катализируется семейством нитроксид-синтаз. Последние используют Ь-аргинин в качестве субстрата и никотинамидадениндинуклеотидфосфат-диафоразу (НАДФ-диафоразу) в качестве кофактора. НАДФ-диафораза участвует в транспортировке электронов к простетической группе энзима [9].
Выработка цитокинов эндотелиальными клетками, лимфоцитами и клетками моноцитарно-макро-фагального звена, участвующими в воспалительном процессе в артериальной стенке при ее повреждении, является ведущим патофизиологическим механизмом эндотелиальной дисфункции [6, 8, 11, 12]. При этом значительная роль в патогенезе атеросклероза отводится "у-интерферону (ИФН-7). Этот цитокин служит локальным кофактором в направлении дифференци-ровки «наивных» Т-хелперов в Т-хелперы 1-го типа [6, 8], является сильным активатором макрофагов, их деструктивных функций в отношении артериальной стенки (выделение кислородных радикалов, оксида азота, гидролитических ферментов) по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа с формированием гранулематозного воспалительного очага [6]. Кроме этого ИФН-у активирует натуральные киллеры, индуцирует экспрессию на макрофагах и гладкомышечных клетках белков главного комплекса гистосовместимости I и II классов и липопротеино-вых рецепторов на гладкомышечных клетках, а также способствует снижению экспрессии липопротеиновых рецепторов на макрофагах [6, 8]. Показано, что ИФН-у индуцирует образование УСЛМ-1 эндотелием артериальной стенки. Известно, что при добавлении к нагруженным холестерином макрофагам ИФН-7 способен существенно влиять на соотношение холестерина и его эфиров в сторону накопления последних, тормозить захват и удаление холестерина из клеток с помощью липопротеинов высокой плотности, что приводит к трансформации макрофагов в пенистые клетки [6, 8].
Противоречивая роль отводится и интерлейкину-(ИЛ)-4, который обладает как антиатерогенными, так и проатерогенными свойствами. Известно, что ИЛ-4 способствует Т-хелперному ответу 2-го типа (частично за счет аутокринной активации), приводит в действие иммуносупрессивные системы, направленные
на макрофаги, включая подавление продукции про-воспалительных цитокинов и стимулируя выработку рецепторного антагониста ИЛ-1. ИЛ-4 способствует переключению иммунной системы с клеточного на гуморальный ответ [3, 6, 8, 13]. ИЛ-4 подавляет пролиферацию гладкомышечных клеток и адгезивность макрофагов, влияет на индуцированную модифицированными липопротеинами низкой плотности аккумуляцию холестерина в макрофагах. При этом показано, что у мышей с дефицитом ИЛ-4 отмечается низкая чувствительность к атерогенной диете, у них обнаружена относительная устойчивость к прогрессированию жировой полоски под влиянием белка теплового шока микобактерий туберкулеза [6]. К проатерогенным эффектам ИЛ-4 относятся индукция им экспрессии P-селектина и 15-липооксигеназы эндотелиальными клетками, экспрессии VCAM-1 и металлопротеина-зы 1-го типа гладкомышечными клетками, а также усиление экспрессии рецепторов мембранных белков и этерификации холестерина в макрофагах [6, 8, 10]. Этот цитокин обнаруживается в атеросклеротически поврежденных артериях человека и мышей, нокаутированных по апопротеину Е [3, 6].
Однако взаимосвязь цитокинов с нарушениями оксидантного статуса артериальной стенки остается до конца не выясненной и требует дальнейшего изучения.
Цель исследования: оценить оксидантный статус, содержание НАДФ-диафоразы артерий и уровень цитокинов (ИЛ-4 и ифн-y) при длительной экспериментальной гиперлипидемии у крыс.
Материал и методы. Для индукции гиперлипидемии у 15 крыс линии Вистар, массой 200-250 г (1-я группа), использовали метод К.А. Мещерской и Н.П. Королевой в модификации с добавлением в корм холестерина, мерказолила и витамина D в течение 6 месяцев (180 суток) [5]. Эксперимент проводился со строгим соблюдением требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента и последующей утилизации. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Исследование одобрено междисциплинарным этическим комитетом (протокол № 4, дело № 21 от 24.01.2011 г.). Контролем в ходе эксперимента служили 15 здоровых крыс, находившихся на обычном рационе (2-я группа). Через 6 месяцев животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом путем декапитации. Проводили забор фрагментов аорты и бедренных артерий.
Определение общей оксидантной и антиоксидан-тной активности проводили спектрофотометричес-ким методом, разработанным в лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН с использованием индикатора - пигмента морского ежа Scaphechinus mirabilis - гистохрома [4]. Оксидан-тную и антиоксидантную активность оценивали по
показателю коэффициента оптической плотности, вычисляемого по формулам:
ООА=(Е1-Е2):К, где ООА - общая оксидантная активность, Е1 и Е2 -экстинкции проб при первом и втором измерениях, К=0,27 (при этом поглощение контрольной пробы при первом измерении - 0,427);
АОА=(Е -Е . ):(Е -Е . ),
v о mm' v max mm''
где АОА - антиоксидантная активность, Етах, Ет1п, Ео (Е2-Е1) - экстинкции соответственно контрольной и опытной проб.
Для суждения о дисбалансе антиоксидантной и оксидантной систем определялся оксидантный индекс по формуле: ООА/АОА.
Определение концентрации цитокинов в надосадке биоптатов артерий проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов Rat ELISA Set BD OptEIATM (BD Biosciences, США).
Метод определения НАДФ-диафоразы основан на образовании диформазана в присутствии эндогенного в-НАДФ и солей тетразолия. НАДФ-диафораза осуществляет перенос протонов от НАДФ к нитросинему тетразолию. Восстановленный нитросиний тетразолий превращается в нерастворимый продукт - диформазан, его расположение указывает на локализацию активности нитроксидсинтазы.
Фрагменты сосудов фиксировали в холодном 4 % растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 4 часов. Затем промывали 0,1М фосфатным буфером (pH 7,2) в течение 6 часов и помещали в раствор 20 % сахарозы на ночь. Серийные срезы толщиной 50 мкм (для гистохимической реакции на НАДФ-диафоразу) изготавливали во фронтальной плоскости на замораживающем микротоме. Срезы в планшетах помещали в инкубационную среду и термостатировали 1 час при 37 °С. Состав инкубационной среды был следующим: 50 мМ Трис-буфер, 0,2 % Тритон X-100, 0,8 мг/ мл НАДФ, 0,4 мг/ мл НСТ; рН 8,0. После инкубации срезы троекратно промывали в дистиллированной воде, помещали на предметные стекла, обезвоживали в спиртах и заключали в бальзам. Интенсивность окрашивания эндотелия соответствовала активности энзима и позволяла выделить три группы НАДФ-диа-форазопозитивных клеток с высокой, умеренной и низкой активностью фермента. Активность фермента определяли при помощи программы ImageJ 1.37 и выражали в единицах оптической плотности.
Для математической обработки полученных данных использовали программу SPSS 16. Сравнение средних значений в выборках осуществляли с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции по Спирмену.
Результаты исследования. В аорте 1-й группы крыс показатели общей оксидантной и антиоксидантной активности были ниже, чем у контрольных животных.
Таблица 1
Показатели общей оксидантной и антиоксидантной активности артерий крыс
Общая оксидантная активность Антиоксидантная активность Оксидатный индекс
Группа аорта бедренная артерия аорта бедренная артерия аорта бедренная артерия
Ме1 0,25-0,752 Ме1 0,25-0,752 Ме1 0,25-0,752 Ме1 0,25-0,752 Ме1 0,25-0,752 Ме1 0,25-0,752
1-я 0,283 4 0,21-0,32 0,53 0,48-0,55 0,333 4 0,31-0,35 0,47 0,42-0,53 0,843> 4 0,82-0,87 1,13 1,10-1,18
2-я 0,69 0,62-0,73 0,61 0,58-0,64 0,51 0,46-0,54 0,46 0,44-0,55 1,35 1,31-1,40 1,32 1,18-1,41
1 Здесь и в табл. 2: медиана.
2 Здесь и в табл. 2: интерквартильный размах.
3 Разница со 2-й группой статистически значима.
4 Разница с бедренной артерией статистически значима.
Таблица 3
Корреляционные связи (г) между содержанием цитокинов и показателями оксидативной активности в аорте крыс
Таблица 2
Уровень цитокинов в артериях крыс при экспериментальной гиперлипидемии
ИЛ-4, пг/мл ИФН-у, пг/мл
а п п аорта бедренная артерия аорта бедренная артерия
у Ме 0,25-0,75 Ме 0,25-0,75 Ме 0,25-0,75 Ме 0,25-0,75
1-я 17,4'-2 16,4-21,9 44,5! 30,1-44,5 3,9! 3,6-4,7 3,6 3,1-4,2
2-я 10,22 7,9-11,1 63,9 59,4-64,1 3,0 2,2-3,3 3,4 2,8-4,0
1 Разница со 2-й группой статистически значима.
2 Разница с бедренной артерией статистически значима.
Группа ИЛ-4 ООА1 ИЛ-4 ОИ2 ИЛ-4 АОА3 ИФН-у ООА1 ИФН-у ОИ2 ИФН-у АОА3
1-я 0,62 0,64 0,57 -0,46 -0,48 -0,38
2-я -0,56 -0,56 -0,54 0,32 0,36 0,72
1 Общая оксидантная активность.
2 Оксидантный индекс.
3 Антиоксидантная активность.
Во фрагментах бедренных артерий эти показатели не имели достоверных различий с контролем. В сосудах животных опытной группы оксидантный индекс был ниже, чем в контроле, при этом в аорте крыс с гипер-липидемией он был ниже, чем в бедренных артериях (табл. 1).
Анализ цитокинов в сосудах крыс показал достоверные различия в содержании ИЛ-4 в зависимости от их морфологии (аорта - сосуд эластического типа, бедренная артерия - сосуд мышечного типа): уровень этого цитокина в аорте крыс обеих групп был значительно ниже, чем в бедренных артериях. В аорте животных с моделью гиперлипидемии значения ИЛ-4 были выше, чем в аорте контрольных животных (табл.2), что отражало активацию гуморальных механизмов локального иммунного реагирования и соответствовало данными литературы. Известно, что на ранних стадиях атеросклероза у апоЕ-нокаутированных мышей в результате активации Т-хелперного ответа 1-го типа образуются иммуноглобулин-О-антитела к окисленным липо-протеидам низкой плотности, тогда как на поздних стадиях атеросклероза происходит экспрессия иммуноглобулинов класса О, характерных для Т-хелперного ответа 2-го типа с участием ИЛ-4 [3].
Во фрагментах бедренных артерий опытных крыс, напротив, регистрировалось снижение уровня ИЛ-4. Противоположная картина наблюдалась в отношении ИФН-у: отмечалось увеличение его уровня в аорте крыс 1-й группы, тогда как в бедренных артериях контрольных животных содержание цитокина не изменилось, что, вероятно, характеризовало преимущественное повреждение аорты в модели гиперлипидемии на протяжении 6 месяцев исследования (табл. 2). Однако при
этом было отмечено значительное увеличение медианы индекса ИЛ-4/ИФН-у в аорте 1-й группы крыс по сравнению с контрольной группой: 4,46 (4,39-4,65) против 3,5 (3,5-3,36) соответственно - и снижение этого индекса в бедренных артериях: 10,0 (9,70-10,5) против 18,7 (16,0-21,2) соответственно. Это характеризовало повреждение бедренных артерий как опосредованное активацией клеточных иммунных механизмов.
Обсуждение полученных данных. Патогенетическая роль ИФН-у в атерогенезе подтверждается данными литературы. У ароЕ-нокаутированных мышей с перекрестным нокаутом рецептора ИФН-у наблюдается снижение размера повреждения артерий, липидных включений и клеточной активности. После того как ароЕ-нокаутиро-ванным мышам вводили рекомбинантный ген ИФН-у на протяжении 30 дней, у них увеличивался размер атеросклеротического повреждения восходящей аорты [6]. Известно, что добавление к макрофагам рекомби-нантного ИФН-у существенно ингибирует деградацию ацетилированных липопротеинов низкой плотности, уменьшает количество связывающих сайтов на клеточной мембране, снижает скорость интернализации и транспортировки липопротеинов в лизосомы без изменения их деградации в самих лизосомах [6].
Нами выявлены прямые корреляционные связи между ИЛ-4 и показателями оксидации в аорте опытных крыс, тогда как в группе здоровых животных корреляционные связи между данными показателями были обратные. В отношении ИФН-у определены противоположные результаты (табл. 3).
Зарегистрировано снижение содержания НАДФ-диа-форазы в аорте и бедренных артериях у крыс с гиперли-пидемией: медиана уровня этого фермента в аорте - 27
(24-31) против 60 (58-61) в контроле, в бедренных артериях - 11 (11-13) против 29 (25-32) в контроле. При этом в бедренных артериях содержание НАДФ-диафоразы было достоверно ниже, чем в аорте, как в 1-й так и во 2-й группах животных, что, вероятно, можно объяснить анатомическими особенностями данных сосудов.
В 1-й группе установлена прямая корреляционная связь (r=0,74) между антиоксидантной активностью и уровнем НАДФ-диафоразы в аорте. Выявлена обратная корреляционная связь (r=-0,64) между уровнями ИФН-Y и НАДФ-диафоразы в бедренных артериях крыс с гиперлипидемией.
Таким образом, при длительной экспериментальной гиперлипидемии у крыс наблюдается низкий уровень оксидантной и антиоксидантной активности в аорте. Наличие прямой корреляционной связи между показателями антиоксидантной активности и уровнем НАДФ-диафоразы в аорте подтверждает, что длительная гиперлипидемия вызывает угнетение функции эндотелия и, возможно, способствует апоптотической гибели эндотелиоцитов, приводя к снижению активности их антиоксидантных ферментов и ферментов семейства нитроксидсинтаз.
Установлены изменения локальной продукции ци-токинов в зависимости от структурных особенностей артерий, что отражает функциональную специфику реагирования эндотелия определенных сосудов на патогенные влияния. В бедренных артериях к 6-му месяцу эксперимента определено снижение концентрации ИЛ-4, при неизменном уровне ИФН-у, тогда как только в аорте крыс зарегистрировано увеличение концентрации и ИЛ-4, и ИФН-у, что, вероятно, свидетельствует о преимущественном цитокинопосредованном повреждении именно данного сосуда в результате длительной гиперхолестери-немии. Увеличение соотношения ИЛ-4/ИФН-у в аорте крыс 1-й группы свидетельствует о локальной активации гуморальных механизмов иммунного реагирования и их угнетающем влиянии на клеточный иммунный ответ, опосредованный ИФН-у, или о повышении рецепторного связывания ИФН-у и/или его инактивации.
В условиях длительной гиперлипидемии наблюдается противоположное влияние цитокинов на показатели оксидации в аорте крыс - стимулирующее влияние ИЛ-4 как на про-, так и на антиоксидантную активность, и отрицательное влияние ИФН-7 на данные показатели. Отмечено ингибирующее влияние ИФН-у на активность НАДФ-диафоразы в эндотелии бедренных артерий опытной группы крыс. Выявленная специфика требует дальнейшего изучения содержания цитокинов и системы оксидантной и антиоксидантной активности сосудов с учетом морфологических и функциональных параметров артериальной стенки. References
1. Vorobeva E.N., Shumaher G.I., Osipova I.V. et.al. The role of endothelial dysfunction in the pathogenesis of atherosclerosis, Kar-diovaskuljarnaja terapija iprofilaktika. 2006, No. 5 (6). P. 129-136.
2. Zotova I.V., Zatejwikov D.A., Sidorenko B.A. Synthesis of nitric oxide and the development of atherosclerosis, Kardiologija. 2002,
No. 4. P. 57-67.
3. Kozlov VA., Dushkin M.I., Verewagin E.I. Vaccine against atherosclerosis: Facts and Perspectives, Citokiny i vospalenie. 2008. No. 1. P. 8-13.
4. Lupach N.M., Hludeeva E.A., Lukjanov P.A. et.al. Matrix metal-loproteinases, oxidative status and endothelial dysfunction with hiperholestrinemy in patients with various forms of ischemic heart disease, Rossijskij medicinskij zhurnal. 2010, No. 4. P. 71-74.
5. Mewerskaja K.A., Borodina G.P., Koroleva N.P. About the method of agents selection, affecting on the cholesterol metabolism, Jeleu-terokokk i drugie adaptogeny iz dalnevostochnyh rastenij / ed. K.A. Mewerskoj. Vladivostok, 1966. P. 289-294.
6. Cytokine system: theoretical and clinical aspects / ed. V.A. Ko-zlova, S.V. Sennikova. Novosibirsk: Nauka, 2004. 324 p.
7. Titov V.N. The generality of atherosclerosis and inflammation: the specificity of atherosclerosis as an inflammatory process (hypothesis), Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. 2006. No. 4. P. 310.
8. Haitov R.M. Immunology. Normal and pathological conditions: a textbook. M.: Medicina, 2010. 752 p.
9. Shumatova T.A., Prihodchenko N.G., Grigorjan L.A. et.al. Ni-troxidergic mechanisms in the pathogenesis of persistent diarrhea in infants in the first year, Pacific Medical Journal. 2010. No. 3. P. 59-61.
10. Shljahto E.V., Gavrisheva N.A., Ovchinnikova O.A. et.al. The effect of inflammation induction on the metabolism of collagen in atherosclerotic plaques in mouse, Medicinskaja immunologija. 2008. No. 6. P. 507-512.
11. Allison B.R., Amy D.G. Atherosclerosis: immune and inflammatory aspects, Journal of investigative medicine. 2006. Vol. 54, No. 3. P.123-131.
12. Huber S.A., Sakkinen P., David C. T-helper-cell phenotype regulates atherosclerosis in mice under conditions of mild hypercholesterolemia, Circulation. 2001. No. 103. P. 2610-2616.
13. Georg J., Shoenfeld Y. Requisite role for interleukin-4 in the acceleration of fatty streaks induced by heat shock protein 65 of Mycobacterium tuberculosis, Circ. Res. J. 2000. No. 86. P. 1203-1210.
14. Park I.K., Son H., Kim S.W, Paick J.-S. Initial validation of a novel rat model of vasculogenic erectile dysfunction with generalized atherosclerosis International, Journal of Impotence Research. 2005. Vol.17. P. 424-430.
Поступила в редакцию 15.04.2011.
progression of endothelial dysfunction during experimental hyperlipidemia
E.P. Turmova1, P.A. Lukyanov2, A.A. Grigoryuk1, E.A. Byihkov1, A.V. Tsyiulskiy3
1 Vladivostok State Medical University (2 Ostryakova Av. Vladivostok 690950 Russian Federation), 2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences (159 100 Year Anni-versary of Vladivostok Av. Vladivostok 690022 Russian Federation), 3 Far Eastern Federal University (8 Suhanova St. Vladivostok 690091 Russian Federation) Summary - The authors evaluated the content of some cytokines, NADPH-diaphorase and the indices of oxidative and anti-oxidative activity in walls of aorta and femoral arteries of wistar rats during ex-perimental hyperlipidemia. The levels of NADPH-diaphorase in endothelium decreased. Both during the experiment and intact control, the level of interleukin-4 in aorta was significantly lower than that in femoral artery. With the hyperlipidemia in femoral arteries, the authors have registered a decrease of interleukin-4, but an increase of interleukin-4 and y-interferon and decrease of oxidative and anti-oxidative activity with low oxidative index in the aorta wall. The authors prove a stimulating effect of interleukin-4 and inhibitory action of y-interferon upon general oxidative and anti-oxidative activity in the wall of aorta.
Key words: hyperlipidemia, cytokines, endothelial dysfunction, experiment.
Pacific Medical Journal, 2011, No. 1, p. 97-100.
