Мониторинг показателей структурно-функционального повреждения сосудов при экспериментальном атеросклерозе Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.13-004.6-092

МОНИТОРИНГ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ СОСУДОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ

АТЕРОСКЛЕРОЗЕ

Е.П. ТУРМОВА*, А.А. ГРИГОРЮК*, Е.В. МАРКЕЛОВА*,

Е.А. КОЦЮРБИЙ*, О.Б. ЩЕДРИНА**, И.Г. АГАФОНОВА***,

В.Е. КРАСНИКОВ*, Н.К. ПАШКО****

Проведен мониторинг состояния морфологической структуры сосудов и содержание НАДФН-диафоразы в эндотелии сосудов у 30 крыс линии Вистар, в условиях гиперлипидемии и артериальной гипертензии на протяжении 6 месяцев. Животные были разделены на 2 группы. I группа - 15 крыс, находились на диете с повышенным содержанием холестерина, им была произведена операция - моделирование симптоматической (реноваскулярной) артериальной гипертензии. Контролем служили 15 здоровых крыс, питающихся обычным рационом - (II группа). Выявлено стойкое уменьшение НАДФН-диафоразы в эндотелии, деформация эластических волокон артериальной стенки, увеличение ее толщины и интимы, клеточная инфильтрация, сужение просвета, отложение жировых включений, уменьшение количества микрососудов передней, брюшной стенки, преимущественно к 6 месяцу эксперимента.

Ключевые слова: атеросклероз, сосуды, крысы.

Проблема атеросклероза признана одной из самых актуальных в настоящее время. Атеросклероз и его осложнения продолжают лидировать в структуре заболеваемости и смертности западных стран и России. Летальность при сердечно-сосудистых патологиях в мире вдвое больше, чем от онкологических заболеваний, и в 10 раз выше, чем от несчастных случаев [1,6].

Огромное значение в процессе атерогенеза придают роли факторов риска сердечнососудистых заболеваний (ССЗ). В многочисленных исследованиях установлена взаимосвязь практически всех известных факторов риска атеросклероза с дисфункцией эндотелия. Одним из основных факторов риска развития атеросклероза является нарушение липидного обмена в организме. Многочисленные исследования: 4S (Scandinavian Simvastatin Survival Study), CARE (Cholesterol And Recurrent Events), Framingham (Фрамингеймское исследование) MRFIT (Multiple Risk Factor Intervention Trial), PROCAM (Prospective Cardiovascular Miinster Study) - убедительно доказали, что смертность от ССЗ напрямую зависит от гиперхолестеринемии. Дислипидемия заключающаяся в снижении альфа-липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), при повышении бета-липопротеинов, или липо-протеинов низкой плотности (ЛПНП) и пре-бета липопротеи-нов, или липропротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП), способствует развитию атеросклероза. Причем атерогенными свойствами обладают модифицированные, подвергнутые, чаще всего, перекисному окислению (ПО), окисленные (окси-ЛПН) [5]. Они способствуют повышению синтеза кавеолина-1, что приводит к снижению образования оксида азота (NO) эндотелием [2,5]. Окисленные липопротеиды являются активными раздражителями для моноцитов, которые проникают в субэндотелиальное пространство, превращаясь в макрофаги, и затем, по мере накопления в них модифицированных ЛПНП, в пенистые клетки [5,10].

Активированные макрофаги и пенистые клетки высвобождают биологически активные вещества - факторы роста, провос-палительные цитокины, молекулы клеточной адгезии, которые способствуют агрегации тромбоцитов, вазоконстрикции и адгезии лейкоцитов, а, следовательно, развитию воспалительного процесса в артериальной стенке и прогрессированию атеросклероза. Также окси-ЛПНП индуцируют пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов [1,5]. ЛПВП, напротив, осуществляют обратный транспорт холестерина из сосудистой стенки и макрофагов в печень.

Артериальная гипертония (АГ) - второй важный фактор риска атеросклероза. Было показано, что лекарственный контроль давления у гипертоников снижает риск инсультов на 40 %, инфаркта миокарда на 8%, а общую летальность от сердечных заболеваний - на 10% [1,2,10]. Доказано, что при изолированной АГ у мужчин в возрасте 47,5±8,4 лет показатели липидного спектра сдвигаются в сторону повышения ОХС, ТГ, ЛПНП, снижения

* ГБОУ ВПО «Владивостокский Государственный Медицинский Универ-

ситет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации», 690950, проспект Острякова 2.

Медицинского центра «Санас», Владивосток, ул. Стрелочная, 2а Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022, пр. 100-летия Владивостока, 159

КГБУЗ, поликлиника № 3, 690005, г. Владивосток, ул. Луговая, 55

ЛПВП, повышения коэффициента атерогенности [2]. Гипертония способствует увеличению проницаемости эндотелия и накоплению липопротеинов в интиме [5]. Доказано, что причина активации перекисного окисления белков и липидов у крыс со спонтанной АГ состоит в усилении продукции кислородных радикалов и неэффективности эндогенных систем их инактивации. Известно также, что развитие спонтанной АГ у крыс сопровождает синдром системного воспалительного ответа: его начальной стадией являются активация (прайминг) полиморфно-ядерных лейкоцитов, усилении продукции и секреции ими активных форм кислорода (О2 и H2O2), и интенсификации ПО белков и жирных кислот. Реакция О2 ' с NO с образует пероксинитрит (ONOO-) и лишает NO его биологического действия, как фактора релаксации. Снижение NO проводит к усилению артериального давления по типу развития порочного круга [2].

С современных позиций ключевым звеном в патогенезе атеросклероза считается эндотелиальная дисфункция (ЭД), которая является дисбалансом между основными функциями эндотелия: вазодилатацией и вазоконстрикцией, ингибированием и содействием пролиферации, антитромботической и протромбо-тической, антиокислительной и проокислительной [1,6]. NO является важным регулятором в сердечно-сосудистой системе, месенджером, осуществляющим ауто- и паракринное действие [2,7]. В организме реакция синтеза NO катализируется семейством NO-синтаз. NO-синтазы используют L-аргинин в качестве субстрата и НАДФН-диафоразу в качестве кофактора. НАДФН-диафораза участвует в транспортировке электронов к простети-ческой группе энзима. Определение НАДФН-диафоразы основано на образовании диформазана в присутствии эндогенного р-НАДФН и солей тетразолия [7].

Данными клинических и эпидемиологических исследований доказано патогенетическое влияние гипертонической болезни и гиперлипидемии (ГЛ) на сосудистую стенку, однако четко не установлен период формирования ЭД при совместном действии этих факторов в условиях эксперимента [3,8,9,10].

Учитывая особенности обменных процессов крыс, способствующих формированию их резистентности к жировой нагрузке, нами применено сочетание экзо- и эндогенной ГЛ с АГ.

Цель исследования — оценить влияние гиперлипидемии и артериальной гипертензии на морфологическую структуру и функциональные параметры сосудов крыс.

Материалы и методы исследования. эксперимент проводился на крысах самцах линии Вистар 30 голов, массой 200-250 г. Животные были распределены на 2 группы:

1 группа - 15 крыс находились на холестериновой диете в течение 6 месяцев (180 суток), которая заключалась в добавлении с добавлением в корм животным порошка холестерина, мерказо-лила и витамина Д - в течение 6 месяцев [3]. За 15 дней перед началом кормления атерогенным рационом была произведена операция - наложение лигатуры на почечную ножку левой почки нерассасывающимся шовным материалом и прошивание верхнего полюса правой почки, оставляя 2/3 органа [4]. Контролем в ходе эксперимента служили 15 здоровых крыс, питающихся обычным рационом (II группа). Эксперимент проводился со строгим соблюдением требований Европейской конвенции по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента и последующей утилизации. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Исследование одобрено междисциплинарным этическим комитетом (протокол №4, дело № 21 от 24.01.2011). Через 6 месяцев исследования животных каждой группы выводили из эксперимента под эфирным наркозом путем декапитации. Проводили забор фрагментов аорты, бедренных артерий и микрососудов передней брюшной стенки (ПБС).

Определение содержание общего холестерина (ОХ); триглицеридов (ТГ); ЛПНП, ЛПВП проводили с помощью стандартного колориметрического метода с использованием реагентов «Ольвекс диагностикум» (Россия). Коэффициент атерогенности (КА) вычисляли по формуле: общий холестерин - ЛПВП /ЛПВП.

Артериальное давление измеряли в хвостовой артерии с помощью анализатора MLU/ 4C 501 (MedLab КНР).

Метод магниторезонансной томографии заключался в следующем: животных перед сканированием усыпляли

растворами рометара (Xylazinum, SPORA, PRAHA) в концентрации 1 мг/мл и реланиума в концентрации 2 мг/мл,

внутрибрюшинно. МРТ диагностика выполнена на томографе для экспериментальных исследований «PharmaScan US 70/16» (Bruker, Германия) с напряженностью магнитного поля 7,0 Тесла, частотой 300 MHz и катушкой типа BGA 09P. Для ангиографии использовали протокол Head_Angio со следующими параметрами: TR/TE=50.0/5.6; угол наклона 25,0; поле

изображения 3,0/3,0/3,0; эффективная толщина среза 30 мм; перекрытие 30,0 мм; матрица 256/256/64 элементов; одно усреднение сигнала, время сканирования 14 мин.

Гистологические препараты фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и суданом-4 (Метод Окамото). Описание микропрепаратов проводилось на микроскопе Olympus BX 41. Снимки производились электронной камерой Olympus ДР 12, при постоянном увеличении на 100 и на 400. Морфометрия проводилась с использованием окуляр-микрометра МОВ - 1-16 x.

В работе использован гистохимический метод на НАДФН-диафоразу. Измерение активности фермента производили в эндотелии и гладких миоцитах аорты, бедренных артерий и ПБС. Активность фермента определяли при помощи программы “ImageJ1.37 v” и выражали в единицах оптической плотности.

Для математической обработки полученных данных использовали программу SPSS v. 16. Сравнение средних значений в выборках осуществляли с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона - Манна - Уитни

Результаты и их обсуждение. Мониторинг артериального давления показал, что в опытной группе крыс артериальное давление было выше, чем в группе здоровых крыс на протяжении всего эксперимента (2,4,6 месяцев), что подтверждает формирование реноваскулярного и ренопривного механизмов АГ (табл.1).

Таблица І

Показатели артериального давления крыс при экспериментальном атеросклерозе

Группы крыс Эксперимент 2 месяца Эксперимент 4 месяца Эксперимент 6 месяцев

СистоличАД (мм.рт.ст.) Диастолич. АД (мм.рт.ст.) Систолич. АД (мм.рт.ст.) Диастолич. АД (мм.рт.ст.) Систолич. АД (мм.рт.ст.) Диастолич. АД (мм.рт.ст.)

I группа (опытные крысы) 131,3±1,5* 83,4±3,2* 140,12±3,25* 90,24±4,44* 161,70±1,66* 99,33±3,41*

II группа (контроль ные крысы) 115,1±0,7 73,4±0,53 116,25±0,84 70,20±2,18 116,01±3,05 71,44±1,70

Прмечание: • - достоверность опытной группой и контрольной группой

^u<0,05)

Таблица 2

Состояние липидного спектра сыворотки крови крыс при экспериментальном атеросклерозе

Группы крыс I группа (опытные крысы) II группа (контрольные крысы)

2 месяца 4 месяца 6 месяцев 2 месяца 4 месяца 6 месяцев

Холестерин ммоль/л 2,94 (2.693.02) # 2,51 (2,462,64) # 3,67 (3,52-3,78) # ;* 1,34 (1,29- 1,43) 1,44 (1,411,49) 1,69 (1,641,73) о

Триглицериды ммоль/л 0,22 (0,180,34) 0,48 (0,410,53) # 0,97 (0,90-1,07) #;* 0,15 (0,11 -0,20) 0,27 (0,190,30) 0,45 (0,230,47) о

ЛПВП ммоль/л 1,19 (1,081,26) # 0,98 (0,941,03) 0,80 (0,78-0,96) #;о 0,96 (0,94- 0,98) 0,95 (0,890,99) 0,97 (0,92- 0,99)

ЛПНП ммоль/л 1,46 (1,321,50) # 0,94 (0,880,97) x;# 0,82 (0,78-0,85) # ; о 0,93 (0,91- 0,94) 0,74 (0,710,79) 0,63 (0,600,66) о

КА 1,47 (1,361,54) # 1,56 (1,391,62) #;* 3,56 (3,18-3,63) о;# 0,43 (0,38- 0,47) 0,52 (0,470,56) x 0,74 (0,710,78) *;о

Примечание: данные представленные в виде Медианы (НК-ВК).

# - достоверность различий между опытной и контрольной группами; х - достоверность различий показателей между 2 и 4 месяцами эксперимента (рц<0,05); * - достоверность различий показателей между 4 и 6 месяцами эксперимента (ри<0,05); ° - достоверность различий показателей между 2 и 6 месяцами эксперимента (ри<0,05).

При исследовании липидного спектра у опытных крыс через 2 месяца эксперимента установлено увеличение уровня ОХ, ЛПНП, ЛПВП и КА, по сравнению с показателями контрольной группы (рц<0,05) (табл.2) На 4 месяце эксперимента в I группе установленные изменения сохранялись, отмечалось увеличение уровня ТГ, содержание ЛПНП снизилось, однако осталось выше показателей контрольных крыс. К 6 месяцу эксперимента у

опытных крыс нарастал уровень ОХ и ТГ, показатели ЛПНП и ЛПВП снизились и стали ниже их значений, установленных на 2 месяце эксперимента. При этом уровень ЛПВП у крыс данной группы стал ниже, чем у здоровых крыс (рц<0,05), произошло увеличение КА в 4,8 раза по сравнению с контрольной группой крыс (табл. 2). Выявленные изменения подтверждают выраженные нарушения липидного спектра у крыс с атерогенной диетой и гипертензией. Снижение сывороточного содержания ЛПНП и ЛПВП у этих крыс, вероятно, указывает на усиление их рецепции эндотелием сосудов.

При оценке НАДФН-диафоразы сосудов установлено, что в бедренных артериях контрольной группы животных содержание НАДФН-диафоразы было ниже, чем в аорте, что можно объяснить анатомическими особенностями строения стенок данных сосудов (в бедренных артериях более выражен мышечный компонент) (ри<0,05). В бедренных артериях опытной группы крыс значения НАДФН-диафоразы были также несколько ниже, чем в аорте, однако показатели не имели достоверной разницы, что может свидетельствовать о более выраженном нарушении синтеза этого кофермента в аорте под влиянием гипертензии в сочетании с атерогенной диетой. Зарегистрировано снижение уровня НАДФН-диафоразы во фрагментах аорты и бедренных артерий (ри<0,05) на 2 месяце эксперимента, с сохранением ее стабильно низкого уровня до 6 месяца наблюдения (табл.3).

Таблица 3

Показатели содержания НАДФН-диафоразы в сосудах крыс

Динамика эксперимента I групп (опытные к] а эысы) II группа (контрольные крысы)

аорта бедренная артерия Микрососуды ПБС аорта бедренная артерии Микро сосуды ПБС

2 мес. 12 (914) # 8 (6-10) # 32 (29-37) # 68 (6271) # 32 (27-36)* 79 (7697)

4 мес. 7 (5-9) # 6 (4-8) # 40 (35-48) # 61 (5864) # 24 (20-29)* 81 (7389)

6 мес. 7 (510) # 5 (3-7) # 42 (32-47)# 60 (5861) # 29 (25-32)* 80 (6791)

Примечание: данные представленные в виде Медианы (НК-ВК).

# - достоверность между опытной группой и контрольной группой (ри<0,05); * - достоверность различий между показателями в биоптатах аорты и бедренных артерий (ри<0,05)

У крыс опытной группы уровень НАДФН-диафоразы в сосудах микроциркуляторного русла также был достоверно ниже контрольных значений на протяжении всего эксперимента (табл.3).

При оценке состояния сосудов с помощью метода магниторезонансной томографии установлено, что на 2 месяце исследования у опытных крыс ширина общей сонной артерии, плечеголовного ствола, грудной части аорты, увеличивалась. Данная сосудистая реакция, вероятно, обусловлена включением защитноприспособительных механизмов для поддержания центральной гемодинамики. Однако к 6 месяцу эксперимента отмечалось сужение просвета перечисленных сосудов, регистрировалось уменьшение ширины просвета подвздошных и бедренных артерий, что свидетельствует о мультифокальности поражения артериального русла при комплексном действии ГЛ и АГ (табл. 4).

Таблица 4

Диаметр просвета сосудов крыс (мм), установленный методом МРТ

Сосуды I группа (опытные крысы) II группа (контрольные крысы)

2 мес 6 мес 2 мес 6 мес

Общая сонная 1,34; (1,26-1,47) 1,14; (1,10 -1,19) 1,27 (1,19-1,32) 1,23 (1,20-1,31)

Внутренняя сонная 0,78 (0,76-0,84) 0,44 (0,42-0,50) # 0,8 (0,78-0,89) 0,77 (0,750,91)

Плечеголовной ствол 1,47 (1,60-1,65) # 1,23 (1,21-1,25) 1,31 (1,28-1,33) 1,30 (1,27-1,32)

Мозговые артерии 0,49 (0,45-0,52) 0,44 (0,42- 0,50) 0,40 (0,37-0,47) 0,41 (0,39-0,44)

Грудная часть аорты 2,32 (2,26-2,33) # 1,51 (1,47-1,53) #; 1,95 (1,831,97) 1,86 (1,801,93)

Брюшная часть аорты 1,66 (1,60-1,68) 1,53 (1,43-1,56) 1,64 (1,601,66) 1,62 (1,541,63)

Общие подвздошные артерии 0,94 (0,92-0,96) 0,74 (0,71-0,75) #; x 0,98 (0,96-1,2) 0,93 (0,90-0,99)

Примечание: данные представленные в виде Медианы (НК-ВК).

# - достоверность между экспериментальными группами и контрольной группой (ри<0,05).; х - достоверность различий между показателями на 2 и 6 месяцах эксперимента

При этом у опытных крыс определялось неравномерное контрастирование артерий, что предполагает локальные атеро-генные изменения стенки артерий (рис. 1).

Рис. 1. МРТ сосудов крыс. (1а) - контрольные крысы; (1 б) -(опытные крысы)

I группа

Оценка гистологической структуры артериальной стенки показала, что морфологические изменения сосудов регистрировались на 2 месяце и усиливались к 6 месяцу эксперимента. В аорте и бедренных артериях опытных крыс при окраске гематоксилином и эозином на 6 месяце эксперимента наблюдались изменения архитектоники эластических волокон, визуализировались перинуклеар-ные оптически пустые образования, наблюдалось смещение ядер миоцитов на периферию, их уплотнение, клеточная инфильтрация стенки, утолщение эндотелия, по сравнению с интактными крысами. При окраске артерий суданом 4 по методу Окамото у опытных крыс выявлена инфильтрация сосуда жировыми включениями. При этом отложение жира заполняли пустоты, выявленные при окраске гематоксилином и эозином (рис.2, рис. 3).

У крыс с гиперлипидемией и гипертензией к 6 месяцу эксперимента регистрировалось достоверное увеличение толщины диаметра стенки и интимы аорты и бедренных артерий по сравнению с контрольными животными (р<0,05) (рис.4).

Наблюдалось уменьшение числа микрососудов ПБС у крыс опытной группы - (3-4 микрососуда в поле зрения, тогда как у контрольных крыс - 8-10 микрососудов). У крыс I группы сосуды микроциркуляторного русла были в виде штрихов с пролиферацией эндотелиоцитов, тогда как у крыс контрольной группы они были овальной или округлой формы. Увеличивалась толщина микрососудов ПБС в опытной группе крыс (М= 4,62 (4,36-4,72) мкм, против М=1,54 (1,50-1,62) в контрольной группе животных.

Рис. 3. Бедренная артерия опытной крысы Окраска сосудов опытных крыс по методу Окамото (по Уэда), Увеличение х100.

XL

в

& | &

I группа (диета+операция)

в | В

II гру п па (здоровые)

Рис. 2. Аорта опытной крысы

Рис. 4. Толщина стенки и интимы сосудов крыс в моделе экспериментального атеросклероза у крыс

Таким образом: Сочетание атерогенной диеты с АГ способствовало выраженному изменению липидного спектра сыворотки крови крыс и прогрессирующему морфологическому повреждению аорты, бедренных артерий и сосудов микроциркуляторного русла ПБС, преимущественно, к 6 месяцу эксперимента. Признаками сосудистого повреждения являлись: стойкое уменьшение НАДФН-диафоразы в эндотелии, деформация эластических волокон артериальной стенки, увеличение ее толщины и интимы, клеточная инфильтрация, сужение просвета, отложение жировых включений, уменьшение количества микрососудов передней брюшной стенки.

Литература

1. Роль дисфункции эндотелия в патогенезе атеросклероза / Е.Н. Воробьева [и др.]// Кардиоваскулярная терапия и профилактика.- 2006.- № 5(6).- С. 129-136.

2. Зотова, И.В. Синтез оксида азота и развитие атеросклероза / И.В. Зотова, Д.А. Затейщиков, Б.А. Сидоренко // Кардиология.- 2002.- № 4.- С. 57-67.

3. Кропотов, А.В. Влияние цимифуги даурской и калужницы лесной на некоторые показатели обмена липидов и половую систему (экспериментальное исследование). Автореф. дис. на соискание учен степени кандидата мед. наук / А.В. Кропотов .Владивосток.- 1975.- 19 с.

4. Пальцева, ЕМ. Экспериментальное моделирование хронических заболеваний почек / Е.М. Пальцева // Клиническая нефрология.- 2009.- № 2.- С. 37-42.

5. Титов, В.Н. Общность атеросклероза и воспаления: специфичность атеросклероза как воспалительного процесса (гипотеза) / В.Н. Титов // Клиническая лабораторная диагностика.-2006.- № 4.- С. 310-315.

6. Чичерина, Е.Н. Системное воспаление и атеросклероз общих сонных аретарий у больных хронической обструктивной болезнью легких / Е.Н. Чичерина, О.В. Милютина// Клиническая медицина.- 2009.- № 2.- С. 18-21.

7. Нитроксидергические механизмы в патогенезе персисти-рующих диарей у детей первого года жизни / Т. А.Шуматова [и др.] // Тихоокеанский медицинский журнал.- 2010.- № 3.- С. 59-61.

8. Development of hyperfibrinogenemia in spontaneously hypertensive and hyperlipidemic rats: a potentially useful animal model as a complication of hypertension and hyperlipidemia /Gomibuchi H [et al] // Exp Anim.- 2007.- N. 56(1).- Р. 1-10.

9. Animal models for the atherosclerosis research: a review

75

бо

45

30

о

/Xiangdong L, [et al]// Protein Cell.- 2011.- N.- 2(3).- P. 189-201.

10. Rapeseed oil fortified with micronutrients reduces atherosclerosis risk factors in rats fed a high-fat diet /Xu J [et al]// Lipids Health Dis.- 2011.- N. 13.- P. 10-96.

MONITORING OF STRUCTURAL AND FUNCTIONAL DAMAGE OF VESSELS AT THE EXPERIMENTAL ATHEROSCLEROSIS

E.P.TURMOVA, A.A.GRIGORJUK, E.V.MARKELOVA, E.A.KOTSJURBIJ, N.K.PASHKO, O.B.SCHEDRINA, I.G.AGAFONOVA, V.E.KRASNIKOV

Vladivostok State Medical University Pacific Institute of Bioorganic Chemistry. Far Eastern District of the Russian Academy of Science Polyclinic № 3, Vladivostok Medical Center «Sanas», Vladivostok

Monitoring of vessels morphological structure and endothelial NADPH-diaphorase was made at 30 rats «Vistar» during 6 month. Animals were divided into 2 groups. I group - 15 rats, were on a diet with the high maintenance of cholesterol. The operation on modeling of renal symptomatic arterial hypertensia was made each of its. The control was 15 healthy rats, eating usual food (II group). The proof reduction of NADPH-diaphorasein endothelium, the deformation of elastic fibres of arterial wall, increase in its thickness and intima, infiltration by cells, narrowing of passage, lipopexia, reduction of quantity of belly wall microvessels were revealed by 6 month of experiment. Key words: atherosclerosis, vessels, rats.

УДК 616-001.4-002.3-018+616.833.2.001.6

СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ В НЕЙРОНАХ СПИННОМОЗГОВЫХ УЗЛОВ КРЫСЫ В ДИНАМИКЕ ЗАЖИВЛЕНИЯ ГЛУБОКИХ РАН КОЖИ ОСЛОЖНЕННЫХ ГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

С.О. ФЕТИСОВ, С.Н. СЕМЕНОВ, Н.Т. АЛЕКСЕЕВА*

В эксперименте на белых беспородных крысах изучали структурнофункциональные изменения нейронов спинномозговых узлов возникающие при моделировании гнойных ран кожи и их лечении гид-ропрессивной санацией и введением тромбоцитарного концентрата. Изучали морфометрические и тинкториальные особенности нейронов различных размерных групп. Установлена связь между выраженностью проявлений морфологических изменений нейронов и скоростью заживления кожных ран. Применение комплексной терапии приводит к снижению количества измененных нейронов в поздние сроки эксперимента и доминированию регенераторных изменений над деструктивными.

Ключевые слова: спинномозговые узлы, A- и В-типы нейронов, гнойные раны, тромбоцитарный концентрат, гидроимпульсная санация.

Изучение роли афферентного звена нервной системы в ре-паративной регенерации может способствовать лучшему пониманию механизмов нейрогенной регуляции этого процесса с целью разработки способов управления им, в частности, способов стимуляции регенерации [8]. При хирургической патологии для выяснения патогенеза заболеваний перспективным является изучение расстройств регуляторных механизмов так как сенсорные нейроны являются одной из важнейших составных частей механизмов саморегуляции [8,12]. Известно, что афферентный нейрон имеет ведущее этиологическое значение в поддержании структурной целостности и адекватной дифференцированности иннервируемых структур [2]. Отдельный интерес представляет исследование нейронов спинномозговых узлов (СМУ) при использовании инновационных методов ускорения заживления кожных ран, вследствие прямой связи между их морфофункциональным состоянием и скоростью реиннервации поврежденного участка [5,6,7].

Целью настоящего исследования являлось изучение морфофункционального состояния нейронов СМУ крысы при моделировании гнойных ран кожи и их лечении комплексным применением тромбоцитарного концентрата (ТК) и гидроимпульсной санации (ГИС) [1].

Работа выполнена на 108 самцах взрослых белых беспородных крыс, массой 150-220 г. Для моделирования гнойного раневого процесса крысе наносили линейный разрез на передней поверхности бедра размерами 1x0,5 см. Стенки и дно раны раздавливали зажимом Кохера. В образовавшийся раневой дефект вносили марлевый тампон с взвесью суточной культуры Staphillo-coccus aureus с концентрацией 1010 микробных тел в 1 мл 0,9%

* ГБОУ ВПО Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Воронеж, ул. Студенческая, д.10

раствора КаС1, на рану накладывали адаптационные швы. На вторые сутки от начала эксперимента в ранах появлялись признаки воспаления: гиперемия и отечность кожи, просачивание по линии швов гнойного экссудата. На 3-и сутки развивалась модель острого гнойного воспаления с обильным гнойным отделяемым. Части животных с использованием модифицированного аппарата «УГОР-1М» однократно производили обработку раны высоконапорным мелкодисперсным потоком изотонического раствора КаС1. После санации в раневой карман вносился сгусток тромбо-цитарного концентрата с концентрацией тромбоцитов не менее 1 млн/мкл, для внесения ТК применяли устройство для нанесения гелеобразных лекарственных средств «УНГЛС - 01».

Были сформированы 3 группы животных: группа виварного контроля (ВК), группа с моделью естественного течения гнойной раны (ГнР), группа с введением тромбоцитарного концентрата после применения гидроимпульсной санации (ТК+ГИС). Животные выводились из эксперимента на 1, 3, 5, 7, 14, 28 сутки равными группами, включая группу виварного контроля. Все хирургические манипуляции по моделированию раневого процесса выполнялись на животных под ингаляционным эфирным рауш-наркозом; эвтаназия животных осуществлялась декапитацией после предварительной наркотизации нембуталом и транскардиальной перфузии 5% раствором формалина на фосфатном буфере (pH 7,4). Производили иссечение поясничных ганглиев Ьш-Ьу как соответствующих нервам, иннервирующим область нанесенной раны. Взятый биологический материал фиксировали в смеси Карнуа и заливали по стандартной методике в смесь парафин-гистомикс, затем на микротоме получали срезы толщиной 6 мкм. Полученные срезы окрашивали крезиловым фиолетовым по методике Ниссля.

На светооптическом уровне изучали следующие характеристики нервных клеток: площадь профильного поля нейрона, площадь ядра, производили вычисление ядерно-

цитоплазматического индекса (ЯЦИ). Для определения площади ядер и профильного поля нейронов производили цифровую микрофотосъемку, полученные изображения обрабатывали с использованием графического планшета и программы 1ша§е1 уег. 1.68. Полученные значения площади в пикселях переводили в мкм2 при помощи встроенного в программу и предварительно откалиброванного конвертера. При исследовании нейронов спинномозговых узлов выделяли клетки с морфологическими признаками различных функциональных состояний: нейроны, не имеющие на светооптическом уровне выраженных изменений, нейроны с реактивными или обратимыми изменениями, нейроны с деструктивными изменениями. Производили подсчет и сравнение относительного количества клеток описанных групп в 6-ти полях зрения для каждого СМУ. Признаками реактивных изменений нейронов считали наличие перинуклеарного хроматолиза, общей гипер- или гипохромности цитоплазмы, явлений сморщивания клетки, перицеллюлярного отека . К деструктивно измененным нейронам относили клетки с выраженным пикнозом тела, сморщиванием ядра, с возможным выходом из него ядрышка, вакуолизацией, крайней гипо- или гиперхромностью с отсутствием возможности идентификации основных клеточных компонентов [4,6,10].Этот метод использован для качественного и количественного анализа нейронов СМУ во всех группах животных, что позволило проследить динамику посттравматических изменений (элиминацию и регенерацию) в разные сроки эксперимента. Опираясь на литературные данные [3,11] и анализ результатов морфометрических исследований, показавший бимодальный характер распределения морфометрических показателей нейронов СМУ, мы выделяли 2 основные группы нейронов: А-клетки со средним поперечником более 30 мкм, светлым перикарионом и глыбчатым распределением субстанции Ниссля; В-клетки со средним поперечником меньше или равным 30 мкм, округлые клетки с тёмным перикарионом и диффузным распределением вещества Ниссля. Эти типы нейронов СМУ традиционно связывают с проводниками различных типов чувствительности: малые В-клетки относят к протопатической чувствительности, крупные А-клетки -к эпикритической. Полученные данные выражали в виде Р±р;(°%), где Р(%) - доля клеток с исследуемой характеристикой в общем числе клеток в данноё группе, р1 - доверительный интервал доли выборки. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета 81а11з11еа 6.0. Статистический анализ выборок абсолютных значений исследованных признаков показал их отклонения от закона нормального распределения.