CC BY
102
11. García-González M. A., Lanas A., Savelkoul P. H. et al. // Clin. Exp. Immunol. - 2003. - Vol. 134, № 3. - Р.525-531.
12. Israel D. A., Salama N., Krishna U. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - Vol. 98. - P. 14625-14630.
13. Jongeneel C. V., BeutlerB. // J. Inflamm. - 1995. - Vol. 96. - P. 46.
14. Kroeger K. M., Abraham L. J. // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1996. -Vol. 40. - P.43-51.
15. Lanas A., García-González M. A., Santolaria S. et al. // Genes Immun. - 2001. - Vol. 2, № 8. - Р.415-421.
16. Machado J. C., Pharoah P., Sousa S. et al. // Gastroenterology. -2001. - Vol. 121. - P. 823-829.
17. Mansfield J. C., Holden H., Tarlow J. K. et al. // Gastroenterology. -1994. - Vol. 106. - P.637-642.
18. RadR., Prinz C., Neu B. et al. // J. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 188. -P.272-281.
19. Strieter R. M., Kunkel S. L., Bone R. C. // Crit. Care Med. - 1993. -Vol. 21. - P. 447-463.
20. Tarlow J. K., Blakemore A. F., Lennard A. et al. // Hum. Genet. -1993. - Vol. 9. - P.403-404.
21. Wilson A. G., Di Giovine F. S., Blakemore A. I., Duff G. W. // Hum. Mol. Genet. - 1992. Vol. 1, N 5. - P. 353.
22. Wolfe M. M., Nompleggi D. J. // Gastroenterology. - 1992. - Vol. 102. - P. 2177-2178.
23. Yamaoka Y., Kita M., Kodama T. et al. // Gut. - 1997. - Vol. 41. -P. 442-451.
Поступила 04.04.12
POLYMORPHISM OF THE GENES IL-1RA AND TNF-ALPHA IN PATIENTS WITH GASTRITIS AND DUODENAL ULCER ASSOCIATED WITH HELICOBACTER PYLORI
O. O. Yanovich, E. S. Nosova, andL. P. Titov
Republican Scientific-Practical Center of Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus
The goal of this work was to determine the rate of the polymorphism of the genes-antagonists of receptor IL-1(IL-1RA) and TNF-alpha in patients with gastritis and duodenal ulcer associated with Helicobacter pylori. The receptors were tested for the clinical manifestation of the disease. A total of 126 patients with different gastroduodenal pathology and H. pylori in autopsy were tested. The results of this work demonstrated a correlation between the risk of duodenal ulcer and allele A of gene TNF-alpha in position 308 in the patients. The analysis of the gene-IL-lRA polymorphism demonstrated statistically significant difference between the patients in the frequency of the genotype 2/l. The results of this work showed that parallel typing of the genes of H. pylori in virulence was required for characterization of the bacteria-patient association. The correlation between the results of the typing with polymorphism of genes of cytokines in patient autopsy was also required.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 уДК 616.151.5-073.537:577.2.08
М. А. Прасолова1'2, Е. Г. Щепотина2, Г. М. Дымшиц1'3
разработка высокопроизводительного флюоресцентного метода определения полиморфизмов в генах гемостаза и фолатного цикла
для клинического использования
1Институт цитологии и генетики СО РАН; 2ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск; 'Новосибирский государственный университет
Понимание важности генетического вклада в развитие заболеваний приводит к необходимости выявления мутаций, повышающих риск патологий, для корректного назначения терапии. Внедрение в клиническую практику генетического анализа требует разработки быстрого и в то же время простого способа детекции генетических дефектов. Нами была разработана система выявления мутаций генов системы свертывания крови и фолатного цикла G20210A FII, G1691A FV, G10976A FVII, G103T FXIII, C807T ITGA2, T1565C ITGB3, G(-455)A FGB, 5G(-675)4G PAI, С677Т и A1298C MTHFR, A2756G MTR, A66G MTRR. Принцип анализа основан на полимеразной цепной реакции с последующей детекцией температурного плавления комплексов амплико-нов со специфичным зондом. Метод позволяет выявлять по три однонуклеотидных полиморфизма в одной пробирке, что повышает производительность анализа в условиях клинического применения. Разработанная система детекции пригодна для тестирования образцов ДНК, выделенных из буккального эпителия, из слюны, из плазмы и сыворотки крови и из урогенитальных соскобов.
Ключевые слова: однонуклеотидные полиморфизмы, анализ кривых плавления, гемостаз, фолатный цикл
На сегодняшний день в молекулярной биологии существует спектр базирующихся на ПЦР методов, позволяющих определять однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) в геноме человека, - ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов)-анализ, аллельспецифичная ПЦР, технологии Taqman, "молекулярные маячки", HRM и др. [6, 9]. Тем не менее, несмотря на высокую точность и широкую распростра-
ненность этих методов в научных исследованиях, их применение в медицинской практике для массового скрининга пациентов остается ограниченным. Часть методик (ПДРФ-анализ, аллельспецифичная ПЦР) не вполне подходит для рутинного клиническогоприме-нения в силу время- и трудозатратности, повышенной вероятности возникновения ошибок вследствие многостадийности анализа. Для правильной интерпретации "сырых" данных, получаемых методами, включающими стадию электрофореза, от исполнителя требуется высокая квалификация, автоматический учет результатов затруднен, высок риск контаминации. Флюоресцентные методы детекции лишены этих недостатков, но тоже имеют свои ограничения. Применение аллельспецифичных зондов (технологии Taqman, "молекулярные маячки", "скорпионы") позволяет проводить анализ одного локуса в одной пробирке, но при этом задействуется 2 флюоресцентных канала, что ограничивает количество полиморфизмов, выявляемых в одной пробирке, до 1-2. Кроме того, часто не удается добиться полной специфичности: сигнал появляется для зонда как соответствующего, так и не соответствующего аллелю, что усложняет интерпретацию результатов (рис. 1).
Существует ряд методов, описанных в литературе, которые для выявления SNPs предусматривают ана-
Рис. 1. Схема способа детекции SNPs методом ПЦР с дальнейшим плавлением продуктов гибридизации.
Две стадии термоциклирования: 1 — асимметричная ПЦР, 50 циклов, 94—60°С; 2 — регистрация
кривой плавления. А — при низкой температуре зонд связан с матрицами, соответствующими обоим аллельным вариантам; Б — при повышении температуры несовершенные дуплексы матрицы с зондом диссоциируют, совершенные — еще нет; В — при высокой температуре все зонды находятся в свободном состоянии. F — флюорофор, Q — гаситель флюоресценции.
лиз кривых плавления после ПЦР. Одним из наиболее распространенных является метод плавления высокого разрешения - HRM (high resolution melt), основанный на различии температур плавления (Tm) продуктов ПЦР, различающихся одним нуклеотидом [13]. Как правило, это различие небольшое ввиду общей высокой Tm ампликона. При этом праймеры должны быть максимально приближены к полиморфной позиции, а для правильной интерпретации результатов требуется сложный математический обсчет полученных данных. Кроме того, для детекции используется неспецифичный связывающийся с ДНК краситель, что накладывает ограничения на мультиплексирование. Тем не менее использование самого принципа выявления различий в температурах плавления ДНК-дуплексов после ПЦР дает обширную информацию и является перспективным методом анализа ДНК на наличие однонуклеотидных полиморфизмов.
В одной из модификаций метода HRM оценивается плавление не всего ампликона, а комплекса одной из цепей ДНК с коротким зондом, специфичным к одному из аллельных вариантов [20]. Разделение аллелей по Tm при этом более четкое, что облегчает интерпретацию результатов, не требует специального программного обеспечения, повышает устойчивость анализа к индивидуальным различиям в составе клинических проб. Однако, как и в случае HRM, используется неспецифичный краситель, что затрудняет возможность исследования в одной пробирке более одного локуса. Кроме того, на кривую плавления зонда возможно наложение сигнала от плавления "праймер-димеров" и других неспецифических про-
дуктов ПЦР, что может приводить к артефактам обсчета результатов. Эти проблемы решаются при использовании зонда с флюорофо-ром и введении гасителя в одну из цепей целевого ампликона рядом с полиморфной позицией [14, 16]. Предлагаемый нами метод, основанный на ПЦР с последующей детекцией температуры плавления комплексов специфичного флюоресцентного зонда с матрицей, позволит выявлять в одной пробирке до трех SNPs. Это экономит время для скрининга и делает анализ более простым, удобным, производительным и пригодным для клинического применения.
В нашей работе мы продемонстрировали использование метода на примере выявления SNPs генов системы гемостаза и фолатного цикла. Генетические дефекты в системе свертывания крови могут приводить к разнообразным патологическим изменениям - повышению риска развития инфарктов и инсультов, тромбофилии, осложнений при беременности (замедление развития, невынашивание беременности, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, гестозы и др.) [2, 4, 7, 11, 17, 19]. Раннее выявление генетических факторов риска данных патологий современными методами ДНК-диагностики позволяет предпринимать профилактические меры, решать вопросы о возможности приема оральных контрацептивов и заместительной гормональной терапии, назначать или корректировать лечение, чтобы избежать тяжелых осложнений.
Целью данной работы явилось создание пригодного для клинического использования и обладающего высокой производительностью метода дискриминации SNPs в генах системы гемостаза человека на основе метода ПЦР с последующим анализом кривых плавления.
Материалы и методы
Образцы ДНК. В работе были использованы образцы ДНК, выделенные из буккального эпителия, слюны, плазмы крови и цельной крови (с ЭДТА), урогенитальных соскобов. Все образцы (246 проб от 223 лиц) были получены от жителей Новосибирска и Новосибирской области в возрасте от 16 до 45 лет без клинических проявлений тромбофилии. Для анализа брали по 100 мкл клинического материала. Выделение ДНК проводили путем лизирования клеток в гуанидинизотиоцианатном буфере с последующим спиртовым осаждением нуклеиновых кислот, спиртовыми отмывками и элюцией в 600 мкл буфера. Для контроля содержания ДНК в образце и эффективности выделения измеряли концентрацию ДНК человека с помощью коммерческого набора "РеалБест Валидация образца" (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск) в соответствии с рекомендациями производителя.
Проведение анализа. Анализ выполняли в мультиплексном варианте: для детекции результатов для каждого гена использовали свой специфичный зонд, меченный флюорофором. Температуры плавления и красители для зондов приведены в табл. 1.
Таблица 1
характеристика полиморфизмов и температуры плавления продуктов гибридизации при выявлении мутаций исследуемых генов
Ген
Полиморфизм
Канал детекции
Температура плавления, °C
Генотип
№ пробирки
MTR (метионинсинтаза)
MTRR (редуктаза метионинсинтазы)
MTHFR
(редуктаза метилентетра-гидрофолата)
F5
(фактор свертывания V, Лейдена, проакце-лерин)
F2 (фактор свертывания II (протромбин))
FGB (фибриноген бета)
F13 (фактор свертывания XIII)
PAI-1
(ингибитор активатора плазминогена 1)
ITGA2
(интегрин альфа-2)
ITGB3
(субъединица IIIa интегрина тромбоцитов)
F7
(фактор свертывания VII, проконвертин)
2756 A/G
66 A/G
1298A/C
677 C/T
1691 G/A
20210G/A
-455 G/A
103 G/T
-675 5G/4G
10976G/A
807 C/T
1565 T/C
FAM
ROX
HEX
HEX
FAM
ROX
FAM
HEX
ROX
FAM
HEX
ROX
40 40, 49 49 40 40, 53 53
44 44, 58
58 48 48, 60 60
48
48, 58 58
49
49, 60 60 48
48 + 56 56 48 48 + 60 60
45 45 + 56
56
46 46, 53
53 44
44, 54
54 44
44, 57
57
Мутация Гетерозигота Норма Норма Гетерозигота Мутация Норма Гетерозигота Мутация Мутация Гетерозигота Норма Норма Гетерозигота Мутация Норма Гетерозигота Мутация Норма Гетерозигота Мутация Норма Гетерозигота Мутация Мутация Гетерозигота Норма Норма Гетерозигота Мутация Норма Гетерозигота Мутация Норма Гетерозигота Мутация
Изначально для каждого отдельного полиморфизма подбирали праймеры таким образом, чтобы олигонуклеотиды для амплификации разных локусов не образовывали стабильных димеров, способных к элонгации.
Реакционная смесь содержала все необходимые компоненты для проведения ПЦР: 67 мМ Трис-HCl (pH 8,9); 50 мМ KCl; 17 мМ (NH4)2SO4, 0,5% твин-20, 5 мМ MgCl2; по 0,4 мМ каждого из 4 дезоксинуклеозидтрифосфатов; 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина; 1 ед. Taq-полимеразы (ЗАО "Вектор-Бест", Россия) в комплексе с антителами к ее активному центру ("Clontech", США); по 0,5 мкМ праймеров с гасителем флюоресценции; 0,125 мкМ немеченых праймеров; 0,25 мкМ зондов, 0,25 мкМ блокированных олигонуклеотидов, подвергали лиофильно-му высушиванию. Для отдельных маркеров концентрации конкретных праймеров или зонда могли в 1,5-2 раза отличаться от
приведенной выше. Образец анализируемой ДНК добавляли в объеме 50 мкл.
Реакцию амплификации и детекцию проводили на термо-циклере с оптическим модулем CFX-96 ("Bio-Rad", США). Режим термоциклирования: 1 цикл - 1 мин, 94°С; 50 циклов - 10 с, 94°С, 20 с, 60°С; плавление - изменение температуры от 30 до 80°С с шагом 1°С, на каждом шаге инкубация в течение 5 с и регистрация флюоресценции.
Результаты и обсуждение Предложенный нами метод выявления SNPs заключается в следующем. Сначала проводится амплификация фрагмента гена, содержащего полиморфную позицию, с помощью асимметричной ПЦР, в ходе ко-
2
2
2
3
3
3
4
4
4
Рис. 2. Графики плавления (зависимость производной флюоресценции по температуре от температуры) при анализе трех генотипов — СС (точки), ТТ (пунктир) и СТ (сплошные линии) — по полиморфизму С677Т гена МТШ^.
272625-
s
о
о ш
е
&24Н о
232221
1:2
1:4 1:6
Соотношение R:Q
1:8 1:10
го
т
п
-100 I
-90 □ s
ai
-80 □
а>
-70 л h
CD
-60 S 3]
-50 £
о
1-40 ч к
а>
S
Рис. 3. Влияние соотношения прямого (сплошная линия) и обратного (пунктир) праймеров на величину определяемого сигнала для системы определения полиморфизма G20210A в гене протромбина.
торой нарабатывается преимущественно только одна из цепей ампликона. В состав этой цепи вместе с прай-мером включается гаситель флюоресценции. Детекция результатов выполняется после ПЦР в ходе плавления комплексов флюоресцентно-меченного зонда и получившихся цепей ДНК с гасителем. Пока комплекс существует, флюорофор и гаситель сближены, уровень сигнала низкий. При повышении температуры комплекс диссоциирует, флюорофор и гаситель разобщаются, что приводит к росту флюоресценции в пробирке. Совершенный комплекс зонда и матрицы (соответствующей одному из аллельных вариантов) плавится при более высокой температуре, чем в случае, если в комплексе имеется однонуклеотидное несоответствие (соответствует другому аллельному варианту). Таким образом, по температуре плавления можно определить, какой из аллелей (или оба) присутствует в исследуемой ДНК. Были подобраны праймеры для амплификации и зонды для детекции 12 полиморфизмов системы гемостаза: G20210A FII, G1691A FV, G10976A FVII, G103T FXIII, C807T ITGA2, T1565C ITGB3, G(-455)A FGB, 5G(-675)4G PAI, С677Т и A1298C MTHFR, A2756G MTR, A66G MTRR. Предварительно был проведен подбор условий реакции отдельно для каждого локуса. Пример получаемых результатов для одного из исследуемых маркеров (С677Т MTHFR) представлен на рис. 2. Видно, что кривые плавления для разных генотипов четко отличаются друг от друга, однозначно опреде-
Рис. 4. Эффекты изменения формы пиков плавления при анализе гетерозиготного образца при варьировании концентрации зонда в смеси: 0,5 мкМ (черные линии), 0,4 мкМ (черный пунктир), 0,3 мкМ (черные точки), 0,2 мкМ (серый пунктир), 0,1 мкМ (серые линии).
а — полиморфизм Т1565С в гене ITGB3, низкая концентрация зонда лучше, чем более высокая; б — полиморфизм G103T в гене П3, повышенная концентрация зонда лучше, чем низкая.
ляются температуры плавления (по одному значению для гомозиготных вариантов и два значения для гете-розигот).
Особенности дизайна систем выявления отдельных полиморфизмов. Оптимизация условий для данного метода предусматривала те же этапы, что и оптимизация любой другой ПЦР (варьирование солевого состава буфера, концентраций одновалентных катионов и Mg2+, температуры отжига праймеров), но имела и ряд особенностей. Один из важных параметров - это соотношение концентраций праймера с гасителем флюоресценции и направленного ко второй цепи ДНК немеченого праймера (Д). При низкой концентрации R эффективность амплификации ДНК в ходе ПЦР снижается, при высокой концентрации нарушается асимметричность ПЦР, конкуренция между зондом и второй цепью ампликона может значительно ослаблять или искажать регистрируемый сигнал (рис.3). Для детекции каждого полиморфизма подбирали свое оптимальное соотношение концентраций праймеров, для большинства маркеров это отношение составило 4Q:1R.
Другой важный параметр, требующий оптимизации, - концентрация зонда. При ее варьировании могут меняться как сами значения Тт для обоих аллелей, так и дискриминирующая способность. Повышение концентрации приводит к росту фонового сигнала, что увеличивает вклад случайных колебаний фона в искажение графиков. Также при излишней концентрации зонда при анализе гетерозигот пики плавления, соответствующие разным аллелям, начинают сливаться в один пологий пик, для которого либо затруднительно четко определить Тт, либо она становиться близкой к Тт одного из гомозиготных вариантов (рис. 4, а). При низкой концентрации зонда возникает другая проблема - его становится недостаточно для равномерного насыщения цепей ампликонов, соответствующих обоим аллелям, для гетерозиготного образца пики получаются несимметричными, меньший пик на фоне большего
|_1—I—I—I—I—I—I—I—I—I—г -эи-|—|—|—|—|—|—|—|—|—|—г -/и-|-1—|-1-1—|-1-1—|-1-1
30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Рис. 5. Изменение формы пиков плавления при анализе гетерозиготного образца по полиморфизму C677T гена MTHFR при добавлении к смеси разных количеств блокированного олигонуклеотида, соответствующего зонду (Block). а — контроль без добавления Block; б - 0,125 мкМ Block; в - 0,25 мкМ Block.
может не определяться (рис. 4, б), т. е. гетерозигота будет ошибочно определена как гомозигота.
Не во всех случаях удается добиться хорошего разделения пиков плавления, даже после перебора концентрации зонда. В качестве решения проблемы мы предложили введение в реакционную смесь оли-гонуклеотида, идентичного зонду по нуклеотидной последовательности, но не содержащего флюорофо-ра. Как и зонд, этот олигонуклеотид (Block) заблокирован с З'-конца так, что он не может удлиняться ДНК-полимеразой. Показано, что путем добавления разных концентраций Block можно устранить несимметричность двух пиков для гетерозиготных образцов, усилить их разделение, не увеличив при этом фон флюоресценции (рис. 5).
Важным фактором, который следует учитывать при дизайне системы детекции, является расстояние между флюорофором и гасителем - p(F,Q). Ранее было показано, что наилучшее соотношение сигнал/ фон наблюдается при p(F,Q), соответствующем 6 п. н. при расположении флюорофора и гасителя в комплементарных цепях ДНК [1, 3]. Соотношение сигнал/фон также остается приемлемым при p(F,Q) = 3-12 п. н. Соответственно, помимо зонда, привязанного к месту расположения определяемого полиморфизма, ограничения также накладываются на выбор Q-праймера.
Мультиплексный анализ. На основе оптимизированных систем для детекции отдельных SNP были созданы системы для одновременного выявления 3 SNPs в одной пробирке. Результаты анализа для одного из триплексов (G20210A FII, G1691A FV, С677Т MTHFR) представлены на рис. 6. Подбор условий для мультиплексирования для данного метода не составляет особых проблем по сравнению с ПЦР в реальном времени. Ввиду особенностей дизайна олигонуклео-тидов для данного метода создание мультиплексных тестов характеризуется большей простотой: зонды легкоплавки и не участвуют в стадии амплификации. Праймеры R присутствуют в смеси в меньшей концентрации, чем Q, следовательно, вероятность их участия в формировании неспецифических продуктов также низкая.
Клиническая апробация. Для проверки правильности получаемых результатов было проведено тестирование выборки 48 клинических образцов (бук-кальный эпителий) двумя способами: с помощью разработанных мультиплексных систем детекции по-
лиморфизмов и с использованием метода сравнения - аллельспецифичной ПЦР (коммерческие наборы "^Р-экспресс" производства ООО НПФ "Литех"). Дискордантные результаты на данной выборке получены не были. Всего в ходе апробации было исследовано 246 образцов ДНК, частоты аллелей приведены в табл. 2.
Рис. 6. Графики плавления для системы выявления 3 SNPs в одной пробирке: канал FAM — замена G1691A в гене фактора Лейдена, HEX — замена C677T в гене MTHFR, ROX — замена G20210A в гене протромбина.
Рис. 7. Содержание ДНК человека при проведении ПЦР и кривые плавления продуктов
гибридизации при выявлении генотипа в разных типах клинических образцов. Цельная кровь - черные линии, плазма крови - серые линии, слюна - черный пунктир; а — графики роста флюоресценции при реакции с SYBR Green II; б — кривые плавления для системы определения полиморфизма -455 G/A в гене фибриногена.
Таблица 2
Сравнение частот встречаемости аллелей по исследуемым полиморфизмам у европеоидов западной Сибири и других популяций
Частота встречаемости мутантного аллеля Р
SNPs полученные данные литературные данные
общее число % мутаций общее число % мутаций ссылка
MTHFR C677T 166 28,9 504 28,96 [2] 0,99
MTHFR A1298C 206 31,0 1824 31,3 [9] 0,96
MTR A2756G 208 25,0 194 24,75 [5] 0,963
MTRR A66G 206 55,8 424 54,71 [2] 0,887
FII G20210A 166 1,2 504 1,00 [2] 0,817
FV G1691A 166 0,6 504 1,00 [2] 0,646
FVII G10976A 116 8,62 348 14,08 [8] 0,173
FXIII G103T 118 20,3 260 19,7 [15] 0,893
PAI1 --675 4G/5G 108 61,1 160 47,5 [2] 0,228
ITGA2 C807T 44 45,5 994 40,5 [12] 0,678
ITGB3 T1565C 114 16,6 210 10,5 [2] 0,162
FGB -455 G/A 104 28,8 420 21,42 [18] 0,209
В работе были проанализированы разные виды клинических образцов (венозная кровь с ЭДТА, плазма крови, сыворотка, соскоб буккального эпителия, слюна, урогенитальные соскобы), в том числе по несколько проб от одного индивида. Параллельно с генетическим анализом определяли содержание ДНК человека в образце с помощью ПЦР в реальном времени. При тестировании крови для ряда образцов (5 из 12) ввиду низкого качества флюоресцентного сигнала результат анализа оказался сомнительным, проблему
удалось решить при разбавлении пробы в 2-4 раза, что говорит о присутствии в крови большого количества ингибиторов ПЦР и соединений, дающих высокий фон флюоресценции в реакции. Венозную кровь принято использовать в качестве исходного материала для генетического анализа как надежный источник большого количества ДНК, но при этом требуются более тщательные методы очистки. Содержание ДНК человека в пробах слюны и буккального эпителия составляло 103-105 копий/100 мкл пробы, что значительно меньше, чем в цельной крови (2-105-106) и в плазме крови (5-104-2-105) и тем не менее для всех типов проб были выявлены полиморфизмы по всем исследуемым маркерам (рис. 7). Таким образом, в силу высокой чувствительности метода ПЦР реальной необходимости в получении образца с большой концентрацией ДНК нет и возможно использование и других типов проб.
В настоящее время активное развитие молекуляр-но-биологических методов в медицине может дать врачу возможность получать дополнительную персонализированную информацию о наличии тех или иных генетических факторов риска для конкретного пациента и в соответствии с этим более эффективно подбирать меры профилактики или лечения заболеваний. Методы, основанные на анализе кривых плавления после проведения ПЦР, имеют богатый потенциал для применения в клинической практике. Разработанная нами мультиплексная система определения 12 однонуклеотидных полиморфизмов генов, ассоциированных с повышением риска развития тромбозов и нарушениями фолатно-го цикла, обладает высокой производительностью, позволяет анализировать широкий спектр типов клинического материала, дает воспроизводимые, легко интерпретируемые результаты, совпадающие с результатами, полученными другим методом ге-нотипирования.
Работа поддержана грантом Министерства образования и науки РФ, госконтракт № 02.740.11.0705.
Сведения об авторах
Прасолова Мария Анатольевна - мл. науч. сотр. Института цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 10; науч. сотр. ЗАО "Вектор-Бест", 630559, пос. Кольцово, Новосибирский район, Новосибирская обл., АБК; e-mail: m.a.prasolova@ gmail.com.;
Щепотина Елена Георгиевна - мл. науч. сотр. ЗАО "Вектор-Бест", 630559, пос. Кольцово, Новосибирский район, Новосибирская обл., АБК; e-mail: cytoch@yandex.ru.;
Дымшиц Григорий Моисеевич - д-р биол. наук, зав. лаб. структуры генома Института цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 10; проф. каф. молекулярной биологии Новосибирского университета, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2; e-mail: dymshits@yandex.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Иванов М. К., Брагин А. Г., Прасолова М. А. и др. // Молекул. генетика. -2009. - № 3. - C. 8-13.
2. Цветовская Г. А., Чикова Е. Д., Лившиц Г. И. и др. // Фундаментальные исследования. - 2010. - № 10. - С.72-79.
3. AkhmadAshrafI., Khasemi JahanB. // Anal. Bioanal. Chem. - 2007.
- Vol. 387. - P. 2737-2743.
4. Carmel R., Green R., Rosenblatt D. S., Watkins D. // Hematol. Am. Soc. Hematol. Educ. Program. - 2003. - P. 62-81.
5. Christensen B., ArbourL., Tran P. et al. // Am. J. Med. Genet. - 1999.
- Vol. 84, N 2. - P. 151-157.
6. Cooper P. C., Rezende S. M. // Int. J. Lab. Hematol. - 2007. - Vol. 29. - P. 153-162.
7. Cortese C., Motti C. // Publ. Health Nutr. - 2001. - Vol. 4. - P. 493497.
8. Criado-García J., Fuentes F., Cruz-Teno C. et al. // Lipids Health Dis. - 2011. - Vol. 10. - P. 50.
9. Didenko V. V. // Biotechniques. - 2001. - Vol. 31. - P. 1106-1121.
10. GiustiB., Gori A. M, MarcucciR. et al. // PLoS ONE. - 2007. - Vol. 6, N 2. - e495.
11. Kakko S., Elo T., Tapanainen J.M. et al. // Eur. J. Clin. Invest. - 2002.
- Vol. 32. - P. 643-648.
12. Langsenlehner U., Renner W., Yazdani-Biuki B. et al. // Breast Cancer Res. Treat. - 2006. - Vol. 97. - P. 67-72.
13. LiewM., PryorR., PalaisR. et al. // Clin. Chem. - 2004. - Vol. 50. -P. 1156-1164.
14. Neoh S.-H., Brisco M. J., Firgaira F. A. et al. // J. Clin. Pathol. -1999. - Vol. 52. - P. 766-769.
15. Saibeni S., VecchiM., Faioni E. M. et al. // Dig. Liver Dis. - 2003. -Vol. 35. - N 1. - P. 32-36.
16. SchutzE, Ahsen N., OellerichM. // Clin. Chem. - 2000. - Vol. 46. -N 11. - P. 1728-1737.
17. Seligsohn U., LubetskyA. // N. Engl. J. Med. - 2001. - Vol. 344. - P. 1222-1231.
18. van'tHooftF. M., von Bahr S. J. F., SilveiraA. et al. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 1999. - Vol. 19. - P. 3063-3070.
19. van Hylckama Vlieg A., Baglin C. A., Bare L. A. et al. // J. Thromb.
Haemost. - 2008. - Vol. 6. - P. 751-754.
20. Zhou L, Myers A. N, Vandersteen J. G. et al. // Clin. Chem. - 2004.
- Vol. 50. - P. 1328-1335.
Поступила 17.04.12
DEVELOPMENT OF THE HIGH-THROUGHPUT FLUORESCENCE ASSAY DETECTING SNPS IN HEMOSTASIS AND FOLATE METABOLISM GENES FOR CLINICAL USE
M. A. Prasolova12, E. G. Shchepotina2, G. M. Dymshits13
1 Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia; 2 Vector-Best JSC, Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia; 3 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
Genetic predisposition of an individual patient should be taken in account to choose the proper treatment. Implementation to clinical practice requires the development of rapid, high-throughput, and easy assays intended to detect single nucleotide polymorphisms. A detection kit intended to identify the hemostasis and folate cycle gene mutations G20210A FII, G1691A FV, G10976A FVII, G103T FXIII, C807T ITGA2, T1565C ITGB3, 5G(-675)4G PAI, G(-455)A FGB, C677T and A1298C MTHFR, A2756G MTR, A66G MTRR was suggested in this work. The method is based on the polymerase chain reaction and subsequent melt curve analysis of the complexes of amplicons with specific probe. Three single nucleotide polymorphisms can be identified in one tube using our detection kit that increases the productivity of the analysis in the clinical use. Different types of biological samples (buccal epithelium, saliva, plasma, serum, and urogenital swabs) can be used as the initial material for DNA isolation and further analysis by the method developed in this work. Key words: single nucleotide polymorphisms, melt curve analysis, hemostasis, folate cycle
