CC BY
4татов в разработанном варианте ИФА, совпадающее с количеством отрицательных проб в «С1УТЕ8Т АРР»;
D - количество отрицательных проб в «С1УТЕ8Т АРР».
Чувствительность разработанного метода относительно коммерческой тест-системы составила 94%, специфичность - 97%.
Таким образом, сравнительный анализ данных, полученных при тестировании сы-
вороток крови свиней в двух реакциях, показал высокую специфичность и чувствительность разработанного метода при анализе полевых сывороток.
Выводы
На основе липополисахаридных антигенов разработан непрямой вариант ИФА для определения антител к бактериям А. рЬеиторпеишотае серотип 1, се-ротип 2, серотип 5 в сыворотках крови свиней.
РЕЗЮМЕ
Разработана тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием липополисахаридных антигенов A. pleuropneumoniae серотипов 1, 2 и 5 для выявления антител в сыворо тках крови свиней. SUMMARY
A test-system on the basis of indirect ELISA using lipopolysaccharide antigens of A. pleuropneumoniae serotypes 1, 2 and 5 for detection of antibodies in porcine sera was developed.
Литература
1. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бак- rological profiles / K. Chiers, E. Donne, I. Overbeke
териальные инфекции: Справочник / Б.И. Анто- [et al.] // Vet. Microbil. 2002. V85, №4. Р. 343-352. нов, В.В. Борисова, П.М. Волкова [и др.] М.: Аг- 6. Serodiagnosis of Swine Pleuropneumonia due to
ропромиздат, 1986. С. 240-243.
2. Сидоров, М.А. Гемофилезы животных / М.А. Сидоров, Д.И.Скородумов. М.: Агропромиздат, 1986. С. 50-51.
3. Шадрова, Н.Б. Получение специфических компонентов Actinobacillus pleuropneumoniae для иммуноферментного анализа / Н.Б. Шадрова, О.В. Прунтова, О.И. Ручнова // Ветеринарная патология. (В печати)
4. Detection of antibodies to Actinobacillus pleuro-pneumoniae serotype 12 in pig serum using a blocking enzyme-linked immunosorbent assay / L.O. Andresen, J. Klausen, K. Barfod, V Sorensen // Vet. Microbiol. 2002. V89. P. 61-67.
5. Chiers, K. Actinobacillus pleuropneumoniae infections in closed swine herds: infection patterns and se-
Actinobacillus pleuropneumoniae Serotype 7 and 4 Using Long-Chain Lipipolysaccharides / M. Gott-schaik, E. Altman, N. Charland [et al.] // Can. J. Vet. Res. 1997. V61. P. 62-65.
7. Evaluation of saline boiled extract, capsular polysaccharides and long-chain lipopolysaccharides of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 as antigens for serodiagnosis of swine pleuropneumonia / M. Gottschaik, E. Altman, N. Charland [et al.] // Vet. Microbiol. 1994. V42. P. 91-104.
8. Rapid serological profiling by enzyme - linked immun-jsorbent assay. 2.Comparison of computation methods for measuring antibody titers in a single serum dilution / D.B. Snyder, WW Marquardt, E.T. Malison, E. Russec // Avian Dis. 1982. Vol.27. P. 474-484.
УДК 619:616.98:579.843.94:615.371
Ф.А. Ширяев, А.В. Потехин, В.С. Русалеев
РАЗРАБОТКА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕМОФИЛЕЗНОГО ПОЛИСЕРОЗИТА СВИНЕЙ
Введение
В настоящее время респираторная патология свиней остается одной из наиболее актуальных и экономически значимых проблем ветеринарии. В этой категории ведущее место занимают болезни бактериальной этиологии, в частности гемофилез-ный полисерозит свиней (болезнь Глессе-ра). Заболевание широко распространено на территории Российской Федерации [3, 5] и характеризуется серозно-фибринозным воспалением перикарда, плевры, брюшины, а также артритом и негнойным менин-гоэнцефалитом [7, 9].
Основополагающим в комплексе ме-
роприятий по борьбе с гемофилезным полисерозитом является профилактическая иммунизация животных [7, 8]. В качестве средств иммунопрофилактики за рубежом предложен ряд сорбированных и эмульсионных инактивированных вакцин. Однако имеющиеся биопрепараты из-за высокой стоимости не нашли широкого применения в нашей стране, что вызывает необходимость изыскания новых средств специфической профилактики данного заболевания.
В технологии изготовления противо-бактериальных вакцин главное место отводится этапу получения микробной мас-
сы с заданными биологическими свойствами [1, 2, 4, 6]. В отечественной и зарубежной литературе довольно подробно рассматриваются общие вопросы оптимизации процессов культивирования и инактивации микроорганизмов, принципы изготовления противобактериальных вакцин, методы оценки качества биопрепаратов. Однако данные относительно оптимальной питательной среды для возбудителя гемофилезного полисерозита, условий выращивания и режимов инактивации бактерий этого вида, для производства вакцин, крайне скудны.
Поэтому целью данной работы было отработать технологию изготовления вакцины против гемофилезного полисерозита свиней и изучить ее антигенные и иммуногенные свойства в лабораторных условиях.
Материалы и методы
В работе использовали бактерии Haemophilus parasuis штамм «Ил-1», депонированный во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов.
Для культивирования бактерий H. parasuis использовали: соево-казеиновый бульон (СКБ) и бульон на основе трипти-ческого гидролизата казеина (ТГК) фирмы «Himedia»; триптозо-соевый бульон (ТСБ) и бульон на основе триптического гидро-лизата по Хоттингеру (ТГХ), приготовленные отделом химико-терапевтических препаратов ФГУ «ВНИИЗЖ». В качестве V-фактора роста использовали дрожжевой экстракт, приготовленный лабораторией микробиологии ФГУ «ВНИИЗЖ».
При оптимизации процесса культивирования бактерии выращивали глубинным методом на УВМТ-12-250 и в аппаратах АК-210. Основные параметры роста микроорганизмов определяли по формуле р = 2,3 (lgX/lgXo)/t, где ц - удельная скорость роста микроорганизмов (ч-1);
Х0 и X - начальная и конечная концентрация микробных клеток (КОЕ/см3);
t - время культивирования микроорганизмов (ч)
Инактивацию бактерий H. parasuis проводили с использованием формалина производства «Метафракс» с содержанием формальдегида 36%. Процесс инактивации осуществляли при 60 об/мин и 37° С. Расчет параметров инактивации производили по формуле
e-kt= X/Х), где k - константа скорости инактивации (ч-1);
10
I —-
S
J q .
I 9
О L) & а _______ ......СКВ
I о -ТГХ
о & ---ТСБ
a w 8
и а Sfir*
з- jjr
с /
X
0 2 4 в е 10 12
Время (t>. час
Рис. 1. Динамика роста бактерии H. parasuis на различных питательных средах
X - время инактивации (ч);
Х0 - исходная концентрация микробных клеток (^КОЕ/см3);
XI - остаточное количество микробных клеток (^КОЕ/см3)
Очищали и концентрировали антиген на проточной центрифуге. Эмульсионную форму вакцины готовили, используя масляный адъювант МопХашёе КА-70, который смешивали с полученным антигеном в соотношении 70:30. Процесс эмульгирования осуществляли в коллоидной мельнице.
Для изучения иммунобиологических свойств экспериментальной вакцины в работе использовали 20 поросят 35-дневного возраста. Животных иммунизировали двукратно с интервалом 21 день, в дозе 1 см3 на поросенка. Антигенные свойства бактерий Н. parasuis оценивали путем определения титра поствакцинальных антител в крови поросят в реакции агглютинации (РА) традиционным методом. Титр специфических антител выражали в логарифмах (1о^2). Иммуногенную активность вакцины против гемофилезного полисерозита свиней определяли методом контрольного заражения поросят.
Результаты и обсуждение
Основной критерий при подборе оптимальных условий культивирования возбудителя гемофилезного полисерозита - получение максимального количества биомассы.
Выбор питательной среды основывался на изучении динамики роста бактерий Н. parasuis в различных средах отечественного и импортного производства. Результаты этих исследований представлены на рис. 1.
Таким образом, было установлено, что оптимальной средой для культивирования Н. parasuis является среда на основе трип-тического гидролизата по Хоттингеру. При выращивании бактерий в данной питательной среде отмечали высокий показатель
Рис. 2. Накопление бактерии Н. рагатЫ в зависимости от интенсивности перемешивания питательной среды
удельной скорости роста и наибольшее накопление возбудителя - |=0,540±0,035 ч-1 и Х=9,73±0,04 ^КОЕ/см3.
При подборе режимов культивирования основное внимание уделяли интенсивности перемешивания питательной среды. Глубинное культивирование в аппаратах АК-210 проводили в режимах с различной скоростью вращения мешалки - 150, 350, 700 и 1200 об/мин, в течение 12 часов.
Как показано на рис. 2, выращивание возбудителя в режиме 150 об/мин обеспечивало наименьшее накопление бактерий Н. parasuis Х=9,34±0,04 ^КОЕ/см3. Увеличение скорости вращения мешалки до 700 об/мин позволяло получать бульонную суспензию с концентрацией живых микробных клеток штамма «Ил-1» Х=10,07±0,03 ^КОЕ/см3.
Дальнейшее увеличение скорости вращения мешалки до 1200 об/мин позволило
лишь незначительно увеличить накопление Н. parasuis - Х=10,15±0,04 ^КОЕ/см3. В то же время увеличение оборотов при перемешивании питательной среды до 1200 об/мин резко влияло на интенсивность пе-нообразования. В этом случае использование механического пеногасителя было неэффективным, а использование только химического пеногасителя приводило к появлению его в питательной среде в больших количествах (>1%), что вызывало определенные трудности в дальнейшем при очистке и концентрировании антигена.
Следующий этап - отработка режима инактивации возбудителя гемофилезного полисерозита свиней. На рис. 3 отображены кривые выживания Н. parasuis при воздействии формалина, а также кривая гибели бактерий в фазе отмирания (ф.о.).
Данные по изучению кинетики инактивации показали, что гибель бактерий Н. parasuis при воздействии формалина и в ф.о. идет с постоянной скоростью, то есть процессы гибели микроорганизмов подчиняются экспоненциальной зависимости.
Показатель константы скорости инактивации при двукратном снижении концентрации формалина также снижался вдвое и составлял для 0,2% формалина 23,44±2,11 ч-1, для 0,1% - 11,72±1,88 ч-1, для 0,05% -5,86±0,72 ч-1, для 0,025% - 2,94±0,37 ч-1, при гибели бактерий в ф.о. - 1,66±0,22 ч-1.
Таким образом, руководствуясь принципом щадящей инактивации и учитывая тот факт, что при использовании предельно низких концентраций формалина (0,025%) процесс инактивации бактерий может быть обратим, мы определили 0,05% формалина как оптимальную кон-
Рис. 3. Инактивация бактерий Н. parasuis формалином
Таблица
Иммуногенная активность Н. parasuis в составе вакцины
Группа животных Клинические признаки Патологоанатомические признаки Выделение культуры Н. 1);!™*!!!*
Вакцинированные 0/10* 0/10 0/10
Невакцинированные 10/10 7/10 8/10
* количество положительных животных / общее количество животных
Рис. 4. Антигенная активность Н. parasuis в составе вакцины
центрацию для инактивации бактерий данного вида.
Завершающим этапом в работе было изучение иммунобиологических свойств полученного антигена в составе экспериментальной вакцины против гемофилез-ного полисерозита свиней инактивирован-ной эмульсионной.
На рис. 4 отображены данные по изучению антигенных свойств экспериментальной вакцины, которые показывают динамику образования антител в крови иммунизированных животных. Из представленных данных видно, что уже через три недели после первой вакцинации происходит значительная выработка специфических антител к Н. parasuis. Повторное введение биопрепарата усиливало антигенный ответ.
При изучении иммуногенных свойств экспериментальной вакцины поросят через 14 дней после второй иммунизации подвергали контрольному заражению предварительно оттитрованной минимальной инфицирующей дозой Н. parasuis «Ил-1» - 2 млрд микробных клеток. За животными вели наблюдение в течение 10 суток. Результаты контрольного заражения представлены в таблице.
Через 24 часа после заражения у всех поросят контрольной группы отмечали появление клинических признаков заболевания: повышение температуры тела до
40,8-41,5° С, угнетение, отказ от корма, у некоторых животных кашель, цианоз слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, болезненность брюшной стенки. При патологоанатомическом исследовании отмечали изменения в легких в виде катаральной бронхопневмонии, у некоторых животных - очаговые кровоизлияния. Признаки полисерозита в виде се-розно-фибринозного воспаления плевры, брюшины и перикарда обнаружили у семи из десяти контрольных (невакциниро-ванных) поросят. По результатам бактериологического исследования заболевание поросят контрольной группы гемофи-лезным полисерозитом было подтверждено в восьми случаях.
У вакцинированных поросят опытной группы клинические признаки заболевания и патологоанатомические изменения отсутствовали, результаты бактериологического исследования были отрицательными.
Выводы
В ходе проведенных исследований были подобраны условия культивирования и отработан режим инактивации бактерий Н. рагаБШБ. Полученный антиген был использован при изготовлении вакцины против гемофилезного полисерозита свиней инактивированной эмульсионной, антигенная и иммуногенная активность которой доказана экспериментально.
РЕЗЮМЕ
Подобрана оптимальная питательная среда для выращивания возбудителя гемофилезного полисерозита свиней глубинным методом. Отработаны режимы культивирования и инактивации бактерии Haemophilus parasuis с целью получения антигена для инактивированных вакцин. Изготовлена ина-ктивированная эмульсионная вакцина против гемофилезного полисерозита свиней, основные иммунобиологические свойства которой изучены на поросятах в лабораторных условиях. SUMMARY
The optimal nutrient medium for cultivation of porcine Haemophillus polyserositis agent using an in-depth method was selected. Regimes for H. parasuis bacteria cultivation and inactivation aimed at antigen production for inactivated vaccines were evaluated. The inactivated emulsion vaccine against porcine Haemophillus polyserositis was produced and its main immunobiologic properties were studied in piglets under laboratory conditions.
Литература
1. Баснакьян, И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М.: Медицина, 1992. 192 с.
2. Беккер, М.Е. Биотехнология / М.Е. Беккер, Г.К. Лиепиньш, Е.П. Райпулис. М.: Агропромиздат, 1990. С. 7-149.
3. Биохимические и антигенные свойства изолятов рода Haemophilus / О.В. Прунтова, В.С. Русалеев, В.М. Гневашев, О.И. Ручнова // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: матер. Междунар. науч. конф. молодых ученых. Владимир, 2004. С. 45-47.
4. Перт, С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978. 333 с.
5. Приходько, С.М. Гемофилезный полисерозит свиней (диагностика, профилактика): автореф. дис.... канд. биол. наук. / Приходько С.М. Щелково, 2003. 23 с.
6. Самуйленко, А.Я. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов: в 2-х т. / А.Я. Самуйленко, Е.А. Рубан. М., 2000. Т.1. 375 с.
7. Сидоров, М.А. Гемофилезы животных / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов. М.: Агропромиздат, 1986. 176 с.
8. Kielstein, P. Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts / P. Kielstein, V.J. Rapp-Gabrielson //J. Clin. Microbiol. 1992. Vol. 30, №4. P
862-865.
9. Phenotypic and genetic characterization of NAD-dependent Pasteurellaceae from the respiratory tract of pigs and their possible pathogenetic importance / P. Kielstein, H. Wuthe, O. Angen [et al.] // Vet. Microbiol. 2001. Vol. 81, №3. P 243-255.
УДК 619:616.98:579.842.14:573.6.086.83:57.083.3 Ю.В. Капускина, О.В. Прунтова
ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ENTERICA SUBSPECIES ENTERICA И ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК К НИМ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
Введение
Сальмонеллез - один из наиболее широко распространенных зооантропоно-зов во многих странах мира, в том числе и в России [3]. Патогенные сероварианты сальмонелл вызывают у людей и животных заболевания, характеризующиеся различными клиническими проявлениями. У людей они вызывают пищевые токсикоин-фекции при употреблении инфицированных продуктов животного происхождения. У птиц весьма распространены латентные инфекции - сальмонеллоносительство [4].
Бактерии Salmonella typhimurium (S. typhimurium) и Salmonella enteritidis (S. enteritidis) являются возбудителями саль-монеллеза птиц, относящимися к роду Salmonella семейства Enterobacteriaceae. Идентифицировано более 2300 серотипов
сальмонеллы, из которых только 10% было выделено у домашней птицы. Известно, что серотипами, наиболее часто выделяемыми от цыплят, а также людей являются 5. enteritidis и 5. 1урЫтипит [3, 4].
В настоящее время в большинстве развитых стран разрабатываются программы мероприятий, направленные на улучшение ситуации по заболеваниям, вызываемым сальмонеллами, включающие своевременную и качественную диагностику. В связи с предстоящим вступлением России в ВТО особое внимание должно быть уделено мониторингу сальмонеллеза птиц.
Эта задача осложняется трудностями в идентификации штаммов и серотипов ввиду широкой вариабельности вирулентных и антигенных свойств возбудителя.
Поэтому для постановки окончатель-
