CC BY
27
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ1
© Бабич О.О.*
Кемеровский технологический институт пищевой промышленности,
г. Кемерово
Оптимизированы параметры очистки рекомбинантной L-фенилала-нин-аммоний-лиазы из клеток E. coli. Схема очистки включает в себя дробное осаждение суньфатом аммония и две хроматографические стадии: металлохелатную и гидрофобную. При этом образуется SO % фермента с удельной активностью 3,3 Е/мг и около 20 % фермента с удельной активностью 2,2 Е/мг. Выход фермента в резуїьтате очистки составляет приблизительно 60 %. Определены основные биохимические свойства рекомбинантной L-фенилаланин-аммоний-лиазы. Установлено, что фермент наиболее активен при pH 8,5. При этом он стабилен в широком диапазоне значений pH от 7,0 до 11,0. Температурный оптимум активности PAL составляет 50 °С. При 30 °С фермент сохраняет более 90 % активности после трех суток инкубации. Время полуинактивации фермента при 50 и 60 °С составляет 4,5 часа и 15 мин., соответственно. Рассчитаны кинетические константы для фермента: Vmax = 3,97 мкмоль мин4 мг4 и Km = 0,49 мМ.
L-фенилаланин-аммоний-лиаза (PAL, КФ 4.3.1.5) катализирует реакцию обратимого дезаминирования аминокислоты L-фенилаланина до транскоричной кислоты и аммиака [1]. L-фенилаланин-аммоний-лиаза с помощью генно-инженерных манипуляций была экспрессирована в клетки Escherichia coli.
Фермент представляет интерес в качестве терапевтического средства для лечения фенилкетонурии, может быть использован как для прямой терапии фенилкетонурии, так и для производства полноценных продуктов питания, не содержащих фенилаланин [2]. Кроме медицинского применения фермент может быть использован в биотехнологии для производства L-фенилаланина из транс-коричной кислоты [3].
Целью работы являлось получение высокоочищенного препарата L-фени-лаланин-аммоний-лиазы и изучение его основных биохимических свойств.
Конструкция используемого в работе экспрессионного вектора pET-28a содержит непосредственно за кодирующей последовательностью участок,
1 Работа выполнена в рамках Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 гг.) по проекту № 2.1.2/3566.
* Руководитель научно-образовательного центра, доцент кафедры «Бионанотехнология», кандидат технических наук.
кодирующий гексагистидиновую последовательность. Таким образом, в результате индуцируемой экспрессии клонированного в нем гена pal синтезировалась L-фенилаланин-аммоний-лиаза, содержащая дополнительную гексагистидиновую последовательность в С-концевой области поли-пептидной цепи, позволяющую осуществлять аффинную чистку белка на Ni-NTA носителе.
Ранее Calabrese с соавторами [4] разработали способ получения очищенного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы. Однако предложенная авторами схема очистки имеет ряд существенных недостатков. Так, использование таких компонентов, как NaCl и дитиотрейтол (ДТТ), нежелательно, поскольку они подавляют активность PAL, что мешает контролировать ход очистки. Кроме того, получаемый препарат имеет более низкую удельную активность вследствие влияния ДТТ. В связи с этим в настоящей работе подобраны оптимальные условия для очистки рекомбинантной L-фенилаланин-аммоний-лиазы из клеток E. coli.
Разработанная схема очистки включает дробное осаждение сульфатом аммония и две хроматографические стадии: металлохелатную и гидрофобную. Результаты очистки представлены в табл. 1 и на рис. 1.
Таблица 1
Результаты очистки рекомбинантной PAL по оптимизированной схеме
Стадия очистки Экстракт Осаждение сульфатом аммония (25-50 %) Ni-NTA- сефароза Гидрофобная хроматография Гидрофобная хроматография, «хвост»
Удельная активность, Е/мг 0,27б 0,822 2,217 3,31б 2,228
Активность, Е/мл 2,57 16,60 11,б4 12,80 4,10
Белок, мг/мл 9,30 20,20 5,25 3,90 1,80
Объем, мл 110,0 16,5 20,0 13,7 10,5
Суммарная активность, Е 282,7 273,9 232,8 175,4 43,1
Суммарный белок, мг 1023,0 333,0 105,0 52,9 19,3
Выход, % 100 97 S5 58 14
Данные, представленные в табл. 1 и на рис. 1, свидетельствуют о том, что при гидрофобной хроматографии фермент элюируется двумя пиками. При этом 80 % фермента элюируется в первой фракции с удельной активностью 3,3 Е/мг, а около 20 % фермента с удельной активностью 2,2 Е/мг элюируется во второй фракции. Выход фермента в результате очистки составляет около 60 %.
Следующий этап исследования посвящен изучению активности очищенного фермента. Определение зависимости активности PAL от pH проводили в инкубационной смеси, содержащей 2 мМ L-фенилаланина в 0,1 М буферных растворах. В качестве буферных растворов использовали цитрат-HCl, зцегат-NaOH, KH2P04-Na0H, Трис-HCl, Na2B4Ov-NaOH с pH от 2 до 12.
Условные обозначения: 4, б -
1 - препарат перед нанесением на металлохелат
после дробного высаливания (N^^04 (25 % и 50 % насыщения), нанесено 9,5 мкг белка;
2 - проскок после металлохелата;
3, 8 - препарат после металлохелата (2,85 и 11,4 мкг белка, соответственно);
5, 7
объединенные фракции первого пика после фенил-сефарозы (3 и 9 мкг белка, соответственно);
- объединенные фракции второго пика после фенил-сефарозы (1,3 и 4 мкг белка, соответственно).
Рис. 1. Электрофоретический анализ очистки PAL (очистка № 3)
Примечание: слева указаны маркеры молекулярных весов в кДа.
Определили, что зависимость активности PAL от pH имеет четкий максимум при pH 8,5. Изменение pH уже на 0,5 единицы от максимума в любую сторону приводит к заметному снижению активности (от 10 до 20 %), а при pH 7,0 в К, Na-фосфатном буфере она составляет 47 % от максимальной. Активность PAL при pH 8,0 в Трис-HCl буфере выпадает из кривой, что предположительно может объясняться ингибирующим действием на фермент хлорид-иона. Из этих данных также можно заключить, что фосфатный буфер благоприятен для активности PAL, несмотря на более высокую величину ионной силы.
Для определения стабильности очищенного препарата PAL его разбавляли в 50 раз в таких же буферах с pH от 3 до 12 и концентрацией 0,1 М. Концентрация белка в пробах составляла 0.2 мг/мл. Образцы инкубировали при + 30 °Св течение 10 мин. Затем отбирали аликвоты и вносили их в инкубационную смесь для определения активности в стандартных оптимальных условиях при pH 8,5.
Выяснили, что PAL наиболее стабильна при pH 7,0 и более щелочных значениях вплоть до pH 11,0. При pH 11,0 даже происходит некоторое увеличение активности. По-видимому, это объясняется тем, что ингибирование PAL ДТТ является обратимым и происходит быстрее при pH 11,0. Кроме того, в кислой среде (pH ниже 7,0) белок быстро и необратимо инактивируется. Например, при pH 5 сохраняется 83 % активности, а при pH 4 PAL уже полностью инактивируется после 10-минутной инкубации при + 30 °С.
Зависимость активности PAL от температуры определяли в стандартной реакционной смеси, которую предварительно выдерживали 10 мин. при температуре реакции. Измерения проводили на спектрофотометре с термостатом, поддерживающим нужную температуру с точностью ± 0,1 °С. Реакцию инициировали ферментом (10,1 мг/мл), предварительно разбавленным в 50 раз 0,1 М Трис-HCl буфером с pH 8,5.
Как следует из проведенных исследований, температурный оптимум реакции наблюдается при температуре + 50 °С. Активность PAL уменьшается более чем в два раза при + 60 °С, причем такое снижение активности не может быть вызвано необратимой денатурацией фермента. Так, было показано, что при данной температуре фермент теряет 50 % активности за 15 мин., тогда как время реакции в данной серии экспериментов составляет 4 мин. Данный факт также подтверждается тем, что во время реакции не наблюдается значительных отклонений от линейности, как, очевидно, должно быть при денатурации белка в кювете.
Для исследования термостабильности фермент (10,1 мг/мл) разбавляли в 50 раз 0,1 М Трис-HCl буфером с pH 8,5. Раствор фермента (0,2 мг/мл) помещали в эппендорфы и инкубировали в термостатах «Термит» (ДНК-технологии, Россия) при указанных ниже температурах ± 0,1 °С. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты, в которых немедленно определяли активности PAL в стандартной инкубационной смеси при 30 °С.
Стабильность PAL исследовали при температурах 30, 50 и 60 °С. Как оказалось, фермент обладает высокой устойчивостью вплоть до температуры + 50 °С. Данные, полученные в ходе эксперимента, показали, что при + 30 °С после трех суток инкубации в препарате сохраняется не менее 91 % от исходной активности, при + 50 °С время полуинактивации составляет 4,5 часа, при + 60 °С фермент быстро теряет активность. Время полуинактивации составляет 15 мин. Ренатурация выражена слабее, чем при 50 °С.
Кинетические параметры фермента, очищенного по разработанной схеме, рассчитанные на основании метода начальных скоростей. Концентрация белка в реакционной смеси составляла 1,33 мкг/мл. Кинетические параметры имеют следующие значения:
Vmax (мкмоль мин'1 мг1) = 3,9740 ± 0,056; Km (мЫ) = 0,4847 ± 0,021;
kcat (с'1) = 5,193; kcat/Km (М'1 с'1) = 10713.
Таким образом, в настоящей работе подобраны оптимальные условия очитки препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы. Схема очистки включает дробное осаждение сульфатом аммония и две хроматографические ста -дии: металлохелатную и гидрофобную. Выход фермента в результате очистки по разработанной схеме составляет около 60 %. Исследованы биохимические свойства рекомбинантной L-фенилаланин-аммоний-лиазы. Фермент наиболее активен при pH 8,5. При этом он стабилен в широком диапазоне значений pH от 7,0 до 11,0. Температурный оптимум активности PAL составляет 50 °С. При 30 °С фермент сохраняет более 90 % активности после трех суток инкубации. Время полуинактивации фермента при 50 и 60 °С составляет 4,5 часа и 15 мин., соответственно. Определены кинетические константы для фермента: Vmax = 3,97 мкмоль мин-1 мг-1 и Km = 0.49 мМ.
Список литературы:
1. Cochrane F.C. The Arabidopsis phenylalanine ammonia lyase gene family: kinetic characterization of the four PAL isoforms / F.C. Cochrane, L.B. Davin, N.G. Lewis // Phytochemistry. - 2004. - P. 1557-1564.
2. A different approach to treatment of phenylketonuria: Phenylalanine degradation with recombinant phenylalanine ammonia lyase / C.N. Sarkissian, Z. Shao, F. Blain, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. - USA 96. - 1999. - P. 2339-2344.
3. Hanley W.B. Hypotyrosinemia in phenylketonuria / W.B. Hanley, A.W. Lee, A.J. Hanley // Molec. Genet. Metab. - 2000. - P. 286-294.
4. Crystal structure of phenylalanine ammonia lyase: multiple helix dipoles implicated in catalysis / J.C. Calabrese, D.B. Jordan, A. Boodhoo, et al. // Biochemistry. - 2004. - 43. - P. 11403-11416.
ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ЦВЕТА ЭКСТРАКТОВ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ © Икрами М.Б., Мирзорахимов К.К.*, Шарипова М.Б., Гулбекова Н.Б.
Технологический университет Таджикистана,
Республика Таджикистан, г. Душанбе
Нами выделены фенольные соединения, обладающие красящими свойствами, из цветов, семян, листьев и стеблей зверобоя, древесины молодых
* Доцент кафедры Химии, кандидат химических наук.
