CC BY
32
УДК 615.32: 547.9
РАЗРАБОТКА СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАЗЫ ЦВЕТЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА ГРЕЧИШНЫЕ
Воронин А.В., Редкокашин Д.Е., Шаталаев И. Ф.
ФГБОУ ВО СамГМУМинздрава России, г. Самара, Российская Федерация
Аннотация. В статье обсуждается способ определения фазы цветения лекарственных растений горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного методом электрофореза в полиакриамидном геле по набору молекулярных форм малатдегидрогеназы.
Ключевые слова: фаза цветения, электрофорез, горец птичий, горец перечный, горец почечуйный, малатдегид-рогеназа.
Введение. Лекарственные препараты на основе сырья горца птичьего (Polygonum aviculare L., сем. Гречишных - Polygonaceae), горца перечного (Polygonum hydropiper L., сем. Гречишных - Polygonaceae) и горца почечуйного (Polygonum persicaria L., сем. Гречишных - Polygonaceae) обладают диуретическим, кровоостанавливающим, противовоспалительным, бактерицидным и обезболивающим эффектами [4]. Широкий спектр фармакологической активности данных растений обусловлен целым рядом веществ, в том числе флавоноидами [3].
Сроки, способы заготовки и сушки лекарственного растительного сырья определяют количественное содержание биологически активных веществ и качество, получаемых на его основе лекарственных препаратов [10].
Оптимальной фазой для заготовки сырья растений семейства гречишные является фаза цветения [8], так как в этот период трава горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного содержат максимальное количество действующих биологически активных соединений - флавонои-дов [2].
Если лекарственное растительное сырье будет собрано на более ранней фазе вегетации (бутонизация) или более поздней (плодоношение), то сырье не будет содержать необходимого количества биологически активных соединений,
определяющих фармакологическую активность самого сырья и препаратов на его основе [3].
Однако способы определения фазы цветения для травы горцев нормативно-технической документацией не предусмотрены. Раздел «Внешние признаки» в фармакопейных статьях на горцы регламентирует определение самого вида растения, но не фазы вегетации [5]. В условиях промышленного культивирования фаза цветения у горцев определяется по совокупности анатомо-морфологических признаков растений, а именно, наличие цветков на цветоносах. Следует отметить, что данный способ определения фазы не может быть достоверным, так как цветы и цветоносы у горцев присутствуют вплоть до отмирания растений поздней осенью, но в редуцированном состоянии [4].
Цель исследования. Цель настоящего исследования является разработка объективного способа определения фазы цветения горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного. Разработанный способ позволит контролировать заготовку лекарственного растительного сырья вышеуказанных растений и обеспечит качество препаратов на его основе.
Материалы и методы. В качестве маркера для определения фазы вегетации использована малатдегидрогеназа (МДГ) [6]. Малатдегидроге-наза ^-малат: NAD-оксидоредуктаза, 1.1.1.37,
—--—
МДГ) - ключевой фермент цикла трикарбоновых кислот, катализирующий обратимую реакцию окисления малата (яблочной кислоты) в оксало-ацетат (щавелево-уксусную кислоту) [1]. МДГ представляет собой мультифункциональный фермент [7].
Известно, что малат играет существенную роль в поддержании внутренних физиологических условий растительных клеток [6]. Двойной путь утилизации малата с помощью МДГ и малик-энзимов позволяет организму уменьшить зависимость от гликолиза при синтезе энергии и углеродных скелетов [9]. Растительная МДГ представляет собой динамическое равновесие белков, способное четко реагировать на физиологическое состояние и потребности растительного организма, а также на изменение окружающей среды [6]. Малатдегидрогеназный комплекс представлен четырьмя дегидрогеназами, две из которых обладают оксидоредуктазной активностью, а две другие - декарбоксилирующие МДГ. Благодаря работе данной ферментной системы, осуществляется стыковка и сопряжение отдельных метаболических процессов в клетках [11]. Наиболее изученным ферментом МДГ комплекса является НАД+-зависимая оксидоредук-тазная МДГ (К.Ф. 1.1.1.37), катализирующая превращение малата в оксалоацетат в цикле Кребса. Кроме того, данная МДГ отвечает за синтез малата и оксалоацетата [12].
Исходя из этого, информация о структурной организации и динамике относительной активности молекулярных форм (МФ) МДГ - одного из ключевых ферментов цикла Кребса - может быть использована для определения фазы вегетации [6, 11].
Объектами исследования являлись образцы свежесобранного лекарственного сырья травы горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного на территории Самарской области в разные фазы вегетации: бутонизация, цветение и плодоношение в течение 2014-2016 гг.
Для выявления структурных особенностей маладегидрогеназы на разных фазах вегетации исследуемых растений, использовали метод электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле.
Пробоподготовка лекарственного растительного сырья.
Навеску свежего растительного сырья 1,0 г, дезинтегрировали в фарфоровой ступке с 5,0 мл
охлажденного до 4°С 1/15 М фосфатного буферного раствора рН 7,2 в течение 5 мин.
Далее дезинтеграт количественно переносили в колбу, добавляли 5,0 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 7,2 и 10 капель тритона Х-100 в конечной концентрации 20 мг/мл. Колбу помещали на магнитную мешалку для солюбилизации фермента на 1 час.
Гомогенат из колбы количественно переносили в центрифужную пробирку, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. Полученный супернатант помещали в пробирку с пробкой и хранили в замороженном виде не более 6 суток.
В супернатанте определяли молекулярные формы малатдегидрогеназы.
Электрофоретическое разделение проб проводили в камере для вертикального электрофореза VE-10 (компания «Хеликон»).
Для приготовления полиакриламидного геля использовали акриламид и метиленбисакрила-мид фирмы «Sigma», с целью удаления акриловой кислоты проводили перекристаллизацию указанных компонентов. Заранее приготовленные и хранимые в холодильнике реактивы перед работой выдерживали некоторое время при комнатной температуре. Для электрофореза готовили 7,5 % полиакриламидный гель. Полученный раствор разделяющего геля заливали в кюветы прибора, далее шприцом на поверхность наслаивали холодную воду. Окончание полимеризации фиксировали по образованию хорошо видимой границе раздела между гелем и наслоенной водой. После удаления воды на поверхность мелкопористого геля наслаивали раствор крупнопористого геля, на который осторожно наносили охлажденный верхний электродный буфер. Фотополимеризацию крупнопористого геля проводили с помощью ультрафиолетового излучения. Окончание полимеризации крупнопористого концентрирующего геля устанавливали по образованию чётко видимой границы между гелем и наслоенным буферным раствором.
После окончания полимеризации гелей камеры заливали верхним и нижним буферными растворами. В качестве электродного буфера использовали 1 М трис-ЭДТА-боратный буфер рН 9,2.
Анализируемые образцы супернатанта непосредственно перед началом электрофореза смешивали с 40 % раствором сахарозы в соотношении 2:1 и 0,5 мл полученной смеси наносили на линию старта.
Режим электрофореза подбирали опытным путем в предварительных экспериментах. Первые 30 мин электрофорез проводили при силе тока 5,0 мА/см, затем 10,0 мА/см до окончания электрофореза. Индикатор окончания процедуры электрофореза - положение зоны красителя бромфенолового синего.
По окончании электрофореза буферные растворы сливали, гели из кювет извлекали путем введения шприцем дистиллированной воды между поверхностью геля и стенкой кюветы.
Выявление на пластинках геля молекулярных форм малатдегидрогеназы проводили феназин-метасульфат-тетразолиевой реакцией в чашках Петри в оптимизированной инкубационной среде: водный раствор никотинамидаденина ди-нуклеотида (1 мг/мл) - 40 мл; раствор нитроси-него тетразолиевого (1 мг/мл) - 30 мл; 1 М раствор натрия малата (рН=7,0) - 10 мл; раствор фе-назинметасульфата (1 мг/мл) - 4 мл; 0,2 М трис-НС1 буферный раствор (рН =7,1) - до 100 мл.
Гелевые пластины инкубировали 12 ч при 37°С. Молекулярные формы МДГ выявлялись в виде темно-синих полос. Регистрацию проявленных зон на электрофореграммах проводили методом денситометрии с помощью компьютерной программы «ТСХ - менеджер 4.00» (разработчик - И.Н. Плахотний)
Результаты исследования и их обсуждение. В результате проведенных исследований были определены наборы МФ МДГ в разные фазы вегетации (бутонизации, цветения, плодоношения) для свежесобранного растительного сырья горца птичьего, горца перечного и горца почечуйного.
Количество МФ является качественной характеристикой, присущей конкретным видам горцев при вышеописанных условиях электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле.
Для горца птичьего в фазе бутонизации обнаруживается одна МФ МДГ-1 со значением относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) 0,83±0,05, в фазе цветения одна МФ МДГ 1 со значением ОЭП 0,50±0,06 и в фазе плодоношения обнаруживаются две МФ МДГ: МДГ 1 с ОЭП 0,65±0,05 и МДГ 2 с ОЭП 0,45±0,06 (таблица 1).
Таблица 1
Молекулярные формы МДГ травы горца птичьего в разные фазы вегетации
Фазы вегетации
Бутонизация Цветение Плодоношение
ОЭП (М+m) МФ МДГ ОА, % ОЭП (М+m) МФ МДГ ОА, % ОЭП (М+m) МФ МДГ ОА, %
0,83±0,05 МДГ 1 100 0,50±0,06 МДГ 1 100 0,65±0,05 0,45±0,06 МДГ 1 МДГ 2 50±5 50±5
Для горца перечного в фазе бутонизации обнаруживается две МФ МДГ: МДГ 1 с ОЭП 0,63±0,07 и МДГ 2 с ОЭП 0,42±0,05. В фазе цветения обнаруживается только МДГ 1 с
ОЭП 0,60±0,06 и в фазе плодоношения обнаруживаются все три МФ МДГ: МДГ 1 с ОЭП 0,64±0,05, МДГ 2 с ОЭП 0,44±0,05 и МДГ 3 с ОЭП 0,12±0,07 (таблица 2).
Таблица 2
Молекулярные формы МДГ травы горца перечного в разные фазы вегетации
Фазы вегетации
Бутонизация Цветение Плодоношение
ОЭП МФ МДГ ОА, % ОЭП МФ МДГ ОА, % ОЭП МФ МДГ ОА, %
(М+m) (М+m) (М+m)
0,63±0,07 МДГ-1 50±5 0,60±0,06 МДГ 1 100 0,64±0,05 МДГ 1 50±5
—--—
0,42±0,05 МДГ-2 50±5 0,44±0,05 МДГ 2 25±5
0,12±0,07 МДГ 3 25±5
Для горца почечуйного в фазе бутонизации обнаруживается одна МФ МДГ: МДГ 1 с ОЭП 0,63±0,05. В фазе цветения обнаруживается только МДГ 1 с ОЭП 0,76±0,05. В
фазе плодоношения обнаруживаются все три МФ МДГ: МДГ 1 с ОЭП 0,64±0,05, МДГ 2 с ОЭП 0,42±0,05 и МДГ 3 с ОЭП 0,10±0,05 (таблица 3).
Таблица 3
почечуйного в разные фазы вегетации
Молекулярные формы МДГ травы горца
Фазы вегетации
Бутонизация Цветение Плодоношение
ОЭП (М+m) МФ МДГ ОА, % ОЭП (М+m) МФ МДГ ОА, % ОЭП (М+m) МФ МДГ ОА, %
0,63±0,05 МДГ 1 100 0,76±0,05 МДГ 1 100 0,64±0,05 0,42±0,05 0,10±0,05 МДГ 1 МДГ 2 МДГ 3 50±5 25±5 25±5
Плодоношение
Рисунок - Электрофореграммы травы горца птичьего.
На рисунке представлены электрофореграммы травы горца птичьего, заготовленного в разных фазах вегетации: бутонизации, цветения, плодоношения.
Как видно из таблиц 1-3, в сырье горцев может обнаруживаться как одна МФ МДГ, так и
сразу все три МФ МДГ. Количество МФ МДГ зависит от фазы вегетации растений и его физиологического состояния.
Обнаружение МДГ 1 возможно, начиная с ранних стадий развития растений, до цветения на стадии бутонизации. Свидетельствует о том, что происходит активный рост растения, накопление
массы и биосинтез биологически активных веществ.
МДГ 2 в большей степени свидетельствует о стабилизации обменных процессов в растении. Обнаружение возможно в разные фазы вегетации.
МДГ 3 появляется в растениях, когда начинают преобладать окислительные процессы в растительном организме, поэтому обнаружение этой МФ возможно после цветения растений до отмирания включительно.
Набор МФ МДГ на разных физиологических стадиях можно использовать для описания и характеристики различных процессов как генетический и физиологический маркер. МДГ со всей совокупностью изоферментных систем и их белковых кофакторов представляют собой важнейшую область биологического и генетического маркирования растительного организма.
Кроме того, в динамике активность МДГ разных видов растений, в том числе горцев, имеют качественную основу. Набор МФ МДГ растений обладает видовой и тканевой специфичностью. Установлено, что характер изоферментного спектра зависит от типа метаболизма, от физиологического состояния и от возраста организма
В предлагаемом способе определение фазы цветения горцев проводится по физиологическим маркерам - МФ МДГ. Количество МФ и значения ОЭП являются качественными характеристиками, присущими конкретному виду горцев при стандартизированных условиях электрофореза.
Для фазы цветения характерным диагностическим признаком является обнаружение одной молекулярной формы МДГ 1 со значениями ОЭП в диапазоне 0,50-0,76 для различных видов горцев. Следует отметить, что наиболее доказательным этот способ является в случае определения фазы цветения горца перечного - так как в предшествующую фазу бутонизации выявляются МДГ 1 и МДГ 2, а в последующую фазу плодоношения - все три МФ МДГ. Для травы горца птичьего ключевым моментом для дифференциации фаз бутонизации и цветения следует считать значимое отличие величины ОЭП МДГ 1 - 0,83 и 0,50 соответственно.
Наименее достоверным является определение фазы цветения у травы горца почечуйного - в фазы бутонизации и цветения выявляется только
МДГ 1 с близкими по величине значениями ОЭП.
Выводы. В результате проведенных исследований разработан и предложен объективный способ определения фазы цветения лекарственного растительного сырья горца птичьего травы, горца перечного травы и горца почечуйного травы методом электрофореза в 7,5% полиакри-амидном геле. Установлены объективные критерии определения фазы цветения вышеуказанных растений по количеству МФ МДГ и их значениям ОЭП.
Разработанный способ определения фазы цветения вышеуказанных растений семейства гречишные позволяет контролировать качество заготавливаемого лекарственного растительного сырья и может быть использован предприятиями, осуществляющими его культивирование и заготовку.
ЛИТЕРАТУРА
1. Активность и изоферментный спектр перокси-даз некоторых видов растений, произрастающих на берегах озера Байкал, при абиотическом стрессе / М.А. Живетьев, Е.И. Раченко, Т.Е. Путилина [и др.] // Известия Иркутского государственного университета. Серия «Биология. Экология». - 2010. - Т.3, №3. - С. 3-12.
2. Актуальные вопросы совершенствования стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов, содержащих фенольные соединения / В.А. Куркин // Современные наукоемкие технологии. - 2016. - №8-2. С. 247-250.
3. Биохимия фенольных соединений / под ред. Дж. Харборна. - М.: Изд-во «Мир». - 1968. - 450 с.
4. Куркин В.А. Основы фитотерапии: Учебное пособие для студентов фармацевтических вузов. -Самара: ООО «Офорт»; ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2009. 963 с.
5. Куркин В.А., Авдеева Е.В. Проблемы стандартизации растительного сырья и препаратов, содержащих фенилпропаноиды // Фармация. 2009. Т. 57. №1. С. 51-54.
6. Малатдегидрогеназа высших растений: свойства, функции и регуляция: автореф. дис. ...канд. биол.наук: 03.01.04: 03.00.12 / Пинейру де К. Мигель Анжело А. - Воронеж, 1991. - 24 с.
7. Молекулярные формы малатдегидрогеназы лекарственных растений семейства Сложноцветные / И.Ф. Шаталаев, Н.В. Расцветова // Известия Самарского научного центра РАН. - 2014. - Т.16, №5(2). -С.1033-1035.
8. Основы биохимии фенольных соединений / М.Н. Запрометов. - М.: Высш. шк., 1974. - 214 с.
9. Фенольные соедиенния и активность оксидоре-дуктаз лекарственных растений (обзор) / А.В. Воронин, Д.Е. Редкокашин // Аспирантский вестник Поволжья. - 2015. - №5-6 (2). - С. 330 - 334.
10. Флавоноиды лекарственных растений: прогноз антиоксидантной активности / В.А. Куркин, В.В. Поройков, А.В. Куркина, Е.В. Авдеева, О.Е. Правдив-цева // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №2-2. - С.517.
11. Function of malatdehyrogenase complex of Maize mesophyll and bundle sheath cells under salt stress condition / A.T. Eprintsev, O.S. Fedorina // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2006. - Vol.2, №2. - P.4-9.
12. Light influence on succinate dehydrogenase activity in Maize leaves / V.N. Popov, A.T. Eprintsev, D.N. Fedorin [et al.] // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2005. - Vol.1, №1. - P.30-36.
THE ELABORATION OF METHOD FOR DETERMINATION FLOWERING PHASE OF POLYGONACEAE MEDICINAL PLANTS
Voronin A.V., Redkokashin D.E., Shatalaev I.F.
Samara State Medical University, Samara, Russian Federation
Annotation. The research paper contains data of determination flowering phase medicinal plants of Polygonum aviculare L., Polygonum hydropiper L., Polygonum persicaria L. by polyacrylamide gel electrophoresis on malate dehydrogenase molecular forms.
Key words: flowering phase, electrophoresis, Polygonum aviculare L., Polygonum hydropiper L., Polygonum persicaria, malate dehydrogenase.
REFERENCES
1. Activnost I izofermentnii spectr peroksidaz nekotorih vidov rastenii, proizrostauschih na beregakh ozera Baikal, pri abioticheskom stresse / M.A. Zhivitiev, E.N. Rachenko, T.E. Putilina [I dr.] // Izvestiya Ir-kutskogo gosudarstvennogo universiteta. Seria "Biologia. Ecologia". - 2010. - T.3, №3. - s. 3-12.
2. Actualnie voprosi sovershenstvovaniya standar-tizacii lekarstvennogo rastitelnogo siriya I lekarstvennih rastitelnih preparatov, soderzhaschikh fenolnie soedi-neniya / V.A. Kurkin // Sovremennie naukoemkie tech-nologii. - 2016. - №8-2. S. 247-250.
3. Biochimiya fenolnikh soedinenii / pod red. J. Har-born. - M.:izd-vo "Mir". - 1968. - 450 s.
4. Kurkin V.A. Osnovi fitoterapii: uchebnje posobie dlya studentov pharmacevticheskih vuzov. - Samara: OOO "Ofort": GOU VPO "SamGMU Roszdrava", 2009. 963 s.
5. Kurkin V.A., Avdeeva E.V. Problemi standar-tizacii rastitelnogo siriya I preparatov, soderzhaschikh fenilpropanoidi // Farmaciya. 2009. T. 57. №1. S. 51-54.
6. Malatdegidrogenasa vischikh rastenii: svoistva, funkcii I regulyaciya: avtoref. dis. ...kand. biol. nauk: 03.01.04: 03.00.12 / Pineiru de K. Migel Angelo A. - Voronezh, 1991. - 24 s.
7. Molekulyamie formi malatdegirogenasi le-karstvennikh rastenii semeistva slozhnocvetnie / I.F. Shatalaev, N.v. Rastsvetova, // Izvestiya Samarskogo nauch-nogo centra RAN. - 2014. - T. 16, №5 (2). - S. 10331035.
8. Osnovi biokhimii fenolnikh soedinenii / M.N. Zaprometov. - M.: Vish. shk., 1974. - 214 s.
9. Fenolnie soedineniya I activnost oksidoreductas lekarstvennih rastenii (obzor) / A.V. Voronin, D.E. Redkokashin // Aspirantskii vestnik Povolziya. - 2015. -№5-6 (2). - s. 330-334.
10. Flavonoidi lekarstvennih rastenii: prognoz anti-oksidantnoy aktivnosti / V.A. Kurkin, V.V. Poroykov, A.V. Kurkina, E.V. Avdeeva, O.E. Pravdivceva // Sovremennie problemi nauki I obrazovaniya. - 2015. - №2-2. - S. 517
11. Function of malatdehyrogenase complex of Maize mesophyll and bundle sheath cells under salt stress condition / A.T. Eprintsev, O.S. Fedorina // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2006. - Vol.2, №2. - P.4-
9.
12. Light influence on succinate dehydrogenase activity in Maize leaves / V.N. Popov, A.T. Eprintsev, D.N. Fedorin [et al.] // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2005. - Vol.1, №1. - P.30-36
