CC BY
615
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2014, № 4
УДК 615.322:582.665.11:615.11
РАЗРАБОТКА ПРОЕКТА ФАРМАКОПЕЙНОЙ СТАТЬИ НА СВЕЖУЮ ТРАВУ ГОРЦА ПТИЧЬЕГО (POLYGONUM AVICULARE L.)
© Киселева Т.Л., Прохоренко О.А., Фролова Л.Н., Чаузова А.В.
Научно-исследовательский центр профессиональной ассоциации натуротерапевтов, Москва
E-mail: KiselevaTL@vandex.ru
Обобщены результаты собственных исследований по разработке показателей подлинности и критериев оценки качества свежей травы спорыша, или горца птичьего (Polygonum aviculare L.), используемой для приготовления настойки матричной гомеопатической. Экспериментальные данные подвергнуты анализу, обобщены, структурированы и включены в проект Фармакопейной статьи «Горца птичьего трава свежая». Предложенные методы: макро- и микроскопия и качественные реакции позволяют с большой степенью достоверности установить подлинность свежей травы горца птичьего. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в свежей траве горца птичьего с помощью метода дифференциальной спектрофотометрии. Предложены обоснованные значения числовых показателей для оценки качества свежей травы горца птичьего.
Ключевые слова: гомеопатическая матричная настойка, горец птичий, Polygonum aviculare L., стандартизация, Фармакопейная статья.
DEVELOPMENT OF THE PHARMACOPOEIA ARTICLE DRAFT FOR KNOTWEED (POLYGONUM AVICULARE L.) FRESH HERB (RAW MATERIAL)
Kiseleva T.L., Prochorenko О.А., Frolova L.N., Chauzova А. V.
Research Center of the Non-Profit Organization “Professional Association of Naturotherapeutists”, Moscow
The article includes the results of our own research to develop indicators of authenticity and quality assessment criteria for Knotweed (Polygonum aviculare L.) fresh herb (raw material), which is used for the preparation of homeopathic Mother tinctures. We proposed the following methods: macro- and microscopy and qualitative reactions, which allow to get a high degree of credibility to establish the authenticity of fresh raw material of Knotweed. We have developed the technique of quantitative determination of total flavonoids in terms of rutin in Knotweed fresh raw material (using the method of differential spectrophotometry). And we offered the reasonable value of numerical indicators for assessing the quality of Knotweed fresh raw material. The experimental data were analyzed, summarized, structured and included in the project of Russian Pharmacopoeia (ХП) Monography “Knotweed (Polygonum aviculare L.) fresh herbs”.
Keywords: Homeopathic Mother tincture, Polygonum aviculare L., standardization, Pharmacopea Monography.
В соответствии с ФЗ РФ «Об обращении лекарственных средств» (от 12.04.2010 г. N 61-ФЗ), гомеопатические препараты подлежат государственной регистрации (при наличии проекта нормативной документации (НД) на сырье, гомеопатическую матричную настойку и препарат [14, 17]) и внесению в Государственный реестр лекарственных средств [8, 17]. В связи с подготовкой и изданием очередного выпуска Государственной Фармакопеи России (ГФ РФ) и гармонизацией требований к лекарственным препаратам (ЛП) и исходному сырью, используемым в гомеопатии и аллопатии, актуальными являются исследования по разработке НД на свежесобранное сырье и гомеопатические матричные настойки из него [9,
10].
В современной гомеопатической практике применяются ЛП, в состав которых входит гомеопатическая матричная настойка (ГМН) горца птичьего (Polygonum aviculare L., сем. Polygona-ceae), которую готовят из свежесобранной травы спорыша [2, 3, 8,11, 18]. Отечественная нормативная документация (НД) на свежую траву горца
птичьего и матричную настойку из него отсутствует.
Целью настоящей работы являлось обобщение результатов собственных исследований по стандартизации свежей травы горца птичьего и создание проекта Фармакопейной статьи (ФС).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служила свежесобранная трава горца птичьего (спорыша), заготовленная на юго-востоке Московской области, в Тульской, Калужской, Ростовской областях в фазу бутонизации и начала цветения.
Макроскопический анализ сырья проводится по методике, описанной в первом выпуске ГФ XI, вып. 1, стр. 256 [7]. Для определения внешних признаков использовали не менее 3 образцов, собранных не менее чем в 1 метре друг от друга. Микроскопическое исследование проводили в соответствии с общей статьей ГФ XI изд., вып. 1 «Техника микроскопического и микрохимическо-
71
Вопросы фармации
го исследования лекарственного растительного сырья» [7]. Свежее сырье помещали в смесь спирт-глицерин-вода (1:1:1).
Изучение анатомических диагностических признаков проводили с использованием микроскопа «Olympus CX 41» (Япония) с окулярами 19х и объективами 10х, 20х, 40х и 100х. Для фотосъемки использовали фотокамеру «Olympus Digital Camera C-3000 Zoom» (Япония).
Из свежей травы получали водно-спиртовые извлечения путем экстракции 40%, 70%, 95% спиртом на кипящей водяной бане с обратным холодильником. Количественное определение проводили методом дифференциальной спектрометрии, основанным на реакции комплексообразования суммы флавоноидов извлечений из свежей травы горца птичьего со спиртовым раствором A1C13 в слабокислой среде с последующим определением оптической плотности окрашенного продукта.
Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре модели U-2800, фирмы Hitachi (Япония). В качестве стандартного образца использовали рутин (Fluka, каталожный №84082), дифференциальный спектр поглощения которого с раствором AlCl3 совпадает с диффе-ренцальным спектром поглощения флавоноидов водно-спиртового извлечения из свежей травы горца птичьего; максимум поглощения окрашенных комплексов составляет 414±2 нм (рис. 1). Стандартные растворы готовили по общим правилам.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В проект ФС для определения подлинности и установления качества нами включены следующие разделы: «Внешние признаки», «Микроскопия», «Качественные реакции», «Количественное определение», «Числовые показатели», «Микробиологическая чистота», «Радиологический контроль», «Упаковка», «Маркировка», «Транспортирование», «Хранение», «Срок годности».
Вводная часть содержит информацию о том, что настоящая ФС распространяется на собранную во время цветения свежую траву дикорастущего однолетнего травянистого растения горца птичьего - Polygonum aviculare L. семейства гречишные - Polygonacae, используемую для приготовления настойки матричной гомеопатической.
В разделе «Внешние признаки» изложены основные морфологические признаки, видимые невооруженным глазом или под стереомикроскопом и лупой, позволяющие идентифицировать данное сырье. Критерий оценки подлинности нами сформулирован следующим образом: сырье представляет собой облиственные верхушки цветоносных частей стебля. Стебли тонкие, ветвистые, цилиндрические, не опушенные, коленчатые, зеленые или сизовато-зеленые, длиной до 40 см. Листья простые, очередные, цельнокрайние, не опушенные, широколопатчатые или широкоэллиптические, обратнояйцевидные, реже узкопродолговатые или почти линейные, тупые или островатые, длиной до 3 см, шириной до 1 см, с раструбами при основании. Раструбы длиннозаостренные, пленчатые, почти до основания прозрачно-серебристые, длиной до 1,0 см. Цветки расположены в пазухах мелких листьев по 2-5, мелкие, зеленовато-белые. Запах слабый. Вкус слегка вяжущий.
Рис. 1. УФ-спектр продуктов реакции комплексообразования суммы флавоноидов водно-спиртового извлечения из свежесобранного сырья горца птичьего и раствора СО рутина с 2% спиртовым раствором А1С1з.
72
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье ", 2014, № 4
Рис. 2. Трава горца птичьего. Фрагмент листовой пластинки. Препарат с поверхности (ув. 40х). Участок эпидермиса верхней стороны: 1 - изодиаметрические клетки многоугольной формы с прямыми четковид-но-утолщенными стенками и бурым содержимым; 2 - устьичный комплекс (анизоцитный тип).
Рис. 3. Трава горца птичьего. Фрагмент листовой пластинки. Препарат с поверхности (ув. 40х). Участок эпидермиса верхней стороны: 1 - сосочковидные выросты клеток эпидермиса по краю листа; 2 - механические волокна.
»* ' 1
і1/"' ' - ■у і « *■
f Ч. ■
' ‘ 1/ _ J « ! . ... v ,• f\. \ - ' s V Щ
, .•✓s 1 *
■> ‘ ' ' , < 4 J Ч ' ’ '' . 5Г.. ' : у^-'АК ; ■- і ^ - У • - .
v ' ^ #
. , ...
■•і
* 1 Ъ
•' ■ -'v;
W,
- -уКЛЇ+у- V :L ’ ,-’V ' *: “V-
* . »
Рис. 4. Трава горца птичьего. Фрагмент листовой пластинки. Препарат с поверхности (ув. 40х). Мезофилл: 1 - тупоконечные друзы; 2 - жилка. 73
73
Вопросы фармации
Микроскопия. При рассмотрении микропрепаратов листа с поверхности видно, что клетки эпидермиса как с верхней, так и с нижней стороны с прямыми утолщенными стенками и нередко с бурым содержимым, стенки клеток верхнего и нижнего эпидермиса часто четковидноутолщенные. По краю листа и над крупными жилками клетки имеют продольно-морщинистую кутикулу. Устьица расположены с обеих сторон листа. Устьица окружены чаще 3 клетками эпидермиса, из которых одна значительно меньше других (анизоцитный тип). Устьица овальной формы, с чечевицевидными устьичными клетками. По краю листовой пластинки 1-3 ряда клеток эпидермиса имеют толстые оболочки и слегка вытянуты в сосочек.
В мезофилле листа, стебля и раструба встречаются тупоконечные друзы оксалата кальция. В мезофилле листа встречаются призматические кристаллы оксалата кальция. Характерно наличие длинных механических волокон, расположенных на листовой пластинке и над жилками с верхней и нижней стороны листа. Механические волокна имеют извилистый контур и толстые оболочки. Вдоль края листа они образуют механическую прокладку и дают ответвления, отходящие далеко от жилки.
Совокупность этих диагностических признаков является необходимой и достаточной для установления подлинности данного вида сырья методом микроскопии.
В разделе «Качественные реакции» определение подлинности рекомендовано проводить по качественным реакциям на флавоноиды и дубильные вещества [12,13].
Аналитическую пробу свежесобранного сырья измельчают до 3 мм. В пробирку помещают 1 мл раствора А (см. раздел «Количественное определение»), прибавляют 2-3 капли хлористоводородной кислоты концентрированной, нагревают в течение 1 минуты в водяной бане. Затем в пробирку вносят несколько гранул цинка. Наблюдается появление розового окрашивания (флавоноиды).
В пробирку помещают 1 мл раствора А (см. раздел «Количественное определение»), прибавляют 4-5 капель раствора железа(Ш)-аммония сульфата. Наблюдается появление черно-зеленого окрашивания (дубильные вещества).
Количественное определение. В аллопатии при стандартизации любого вида ЛРС требуется нормирование содержания действующих или доминирующих групп БАВ. В сырье горца птичьего одной из доминирующих групп БАВ, обладающих широким спектром фармакологической активности, являются флавоноиды [5, 10, 12, 15, 16]. В связи с мировой тенденцией к гармониза-
ции требований к критериям оценки качества ЛРС и препаратов на его основе, используемых в аллопатии и гомеопатии [9], нами предложен один из критериев доброкачественности - содержание суммы флавоноидов, что согласуется с общепринятыми методами стандартизации фла-воноидоносного сырья [12]. Предложена методика количественного определения суммы флаво-ноидов в свежесобранном сырье спорыша.
В основу методики положен спектрофотометрический метод после реакции комплексообразования суммы флавоноидов со спиртовым раствором алюминия хлорида (AlCl3) [1, 12]. В результате образования комплекса наблюдается бато-хромный сдвиг I полосы поглощения основных флавоноидов [1, 12] от 330-350 до 390-410 нм [1, 4, 12]. Эта область достаточно удалена от спектров поглощения других фенольных соединений, содержащихся в исходном сырье (фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества и др.), что практически исключает их влияние на результаты количественного определения флавоноидов.
При подборе оптимальных условий экстрагирования флавоноидов из сырья исследовали влияние ряда факторов: соотношение сырья и экстрагента; продолжительность экстракции; режимы экстракции. В качестве экстрагента использован спирт этиловый различной концентрации.
Экспериментально установлено, что оптимальными условиями выделения суммы флавоно-идов из свежесобранного сырья горца птичьего являются: экстрагент - 40% спирт; соотношение сырья и экстрагента 1:20; экстракция на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 часов. Полученные результаты использованы нами при дальнейшей разработке методики.
Для отработки условий фотометрической реакции комплексообразования суммы флавонои-дов извлечений из сырья со спиртовым раствором AlCl3 исследовали следующие параметры: область максимального поглощения света комплексом, концентрация и количество спиртового раствора AlCl3, необходимые для полного связывания суммы флавоноидов в комплексное соединение, зависимость светопоглощения фотометрируемых соединений от времени.
При регистрации оптической плотности продуктов реакции комплексообразования при различных длинах волн установлено, что максимумы поглощения света анализируемым раствором наблюдаются при длине волны 414 нм (рис. 1). Параллельно регистрировали оптическую плотность комплекса СО рутина со спиртовым раствором AlCl3. На рисунке 1 видно, что области максимального светопоглощения комплексов суммы флавоноидов извлечения из свежесобранного сырья горца птичьего и СО рутина со спир-
74
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2014, № 4
товым раствором AlCl3 близки. Поэтому в методике количественного определения суммы фла-воноидов оптическую плотность предложено регистрировать при длине волны 414 нм, а расчет процентного содержания суммы флавоноидов в сырье проводить в пересчете на СО рутина.
В дальнейших исследованиях изучено влияние концентрации и количества спиртового раствора AlCl3 на полноту протекания реакции комплексообразования. На основании полученных данных для проведения фотометрической реакции в методике нами предложено использовать 2 мл 3% спиртового раствора AlCl3. Для изучения зависимости светопоглощения от времени фотометрической реакции комплексообразования суммы флавоноидов с 3% спиртовым раствором AlCl3 регистрировали оптическую плотность раствора через каждые 5 мин. На основании полученных данных построен график (рис. 5).
Проведенное исследование позволило установить, что в течение 30-35 мин идет процесс образования комплекса, при этом оптическая плотность растет. При дальнейшем наблюдении какого-либо значительного роста оптической плотности не происходит, что соответствует на графике почти горизонтальному участку. Поэтому
в методике количественного определения суммы флавоноидов в сырье горца птичьего регистрацию оптической плотности целесообразно осуществлять через 35 мин после добавления реактива.
Для расчета метрологических характеристик методики определение суммы флавоноидов про-ведили на одном лабораторном образце сырья горца птичьего в 7 независимых повторностях (табл. 1).
Как видно из данных таблицы 1, относительная ошибка единичного определения с 95 % доверительной вероятностью составляет ±2,58 %, что свидетельствует о воспроизводимости методики. Относительная ошибка при проведении анализа в трех повторностях не превышает ±1,96 %, поэтому в методике рекомендуется проводить анализ в трех повторностях. Отсутствие систематической ошибки методики доказано при помощи опытов с добавками СО рутина. Результаты представлены в таблице 2.
Данные таблицы 2 указывают на отсутствие систематической ошибки методики, так как относительная ошибка опытов с добавками при проведении анализа в трех повторностях находится в пределах ошибки единичного определения.
Рис. 5. График зависимости оптической плотности от времени фотометрической реакции комплексообразования суммы флавоноидов водно-спиртового извлечения из свежей травы горца птичьего с 3% спиртовым раствором AlCl3
Таблица 1
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов
в свежей траве горца птичьего 75
Сырье n f х S P % t(P,f) Ах 8, % 83, %
Трава горца птичьего 7 6 1,798 0,01021 95 2,45 0,00946 ±2,58 ±1,96
75
Вопросы фармации
Таблица 2
Результаты опытов с добавками СО рутина
Название сырья Взято суммы флавоноидов (мг) Добавлено рутина (мг) Суммы флавоноидов (мг) Ошибка
должно быть опреде- лено абс., (мг) отн.,%
Трава горца птичьего 1,6250 0,07 0,01632 0,01652 0,0002 1,23
0,14 0,01639 0,01679 0,0004 2,44
0,21 0,01646 0,01616 -0,0003 -1,82
0,28 0,01653 0,01673 0,0002 1,21
Раздел «Количественное определение» изложен в следующей редакции: аналитическую пробу сырья измельчают до состояния кашицы. Около 2,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 200 мл, прибавляют мерной пипеткой 50 мл 40% спирта. Колбу взвешивают с погрешностью ± 0,01 г, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры колбу вновь взвешивают и доводят до первоначальной массы 40% спиртом. Содержимое колбы перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 2 мл раствора А, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, доводят объем колбы 96% спиртом до метки, перемешивают. В качестве раствора сравнения используют следующий раствор: 2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют
2-3 капли уксусной кислоты разведенной 30% и доводят объем раствора 96% спиртом до метки.
Оптическую плотность полученного раствора измеряют через 35 мин на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 414 нм. Параллельно в указанных выше условиях измеряют оптическую плотность 0,05% спиртового раствора СО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору с одним уточнением: в мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора СО рутина.
Содержание суммы флавоноидов (Х) в процентах в пересчете на СО рутина и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:
Х (%) =
А х a0 х 1 х 50 х 25 х 100 A0 х 100 х 25 х а х 2 х (100 - W)
х 100%
х 100%
A х а0 х 25
А0 х а х (100 - W)
где:
А - оптическая плотность испытуемого раствора;
А0 - оптическая плотность спиртового раствора СО рутина;
а0 - масса навески СО рутина, в граммах;
а - навеска сырья, в граммах;
W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.
На основании результатов собственных исследований сырья из различных регионов РФ (2009-2012 г.) в раздел «Числовые показатели» проекта ФС включены следующие критерии оценки качества: содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1,0%; влажность не менее 60,0%; золы общей не более 13,0%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, не более 5,0%; органической примеси не более 1,0%; минеральной примеси не более 0,5%.
Контроль за микробиологической чистотой
должен осуществляться в соответствии с требованиями ГФ XII, ч.1, ст. 32 (категория 3.2) [6]. Учитывая, что сырье подвергается немедленной переработке, считаем необходимым дополнить этот раздел предложением: «Определение микробиологической чистоты должно осуществляться по специальному требованию потребителя», поскольку анализ достаточно длительный. В разделе «Радиологический контроль» указано, что контроль должен проводиться в соответствии с СанПиН 2.3.2560-96, раздел 6.10. Допускается цезия - 137 не более 200 Бк/кг, стронция - 90 не более 100 Бк/кг.
Упаковку сырья рекомендуется производить в соответствии с ГОСТ 17768-90 в ящики с отверстиями в боковых стенках и крышках, по 0,5 кг нетто. Маркировка транспортной тары в соответствии с требованиями ГОСТ 14192-96. Продукция прошла радиологический контроль СанПиН 2.3.2560 - 96. Транспортирование. Свежесобранное сырье следует отправлять для переработки немедленно после сбора любым видом транспорта.
Условия хранения. Сырье подлежит переработке в течение 24 часов с момента сбора. Срок годности 24 часа.
76
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2014, № 4
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Разработаны и описаны критерии оценки подлинности («Внешние признаки», «Микроскопия», «Качественные реакции») свежесобранной травы горца птичьего (Polygonum aviculare L.), используемой для изготовления гомеопатической матричной настойки.
2. Предложенные методы: макро- и микроскопия и качественные реакции позволяют с большой степенью достоверности установить подлинность свежей травы горца птичьего.
3. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в свежей траве горца птичьего с помощью метода дифференциальной спектрофотометрии.
4. Предложены обоснованные значения числовых показателей для оценки качества свежей травы горца птичьего.
5. Разработан проект ФС на свежую траву горца птичьего, используемую для изготовления гомеопатической матричной настойки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беликов В.В., Точкова Т.В., Шатунова Л.В., Колесник Н.Т., Баяндина И.И. Количественное определение основных действующих веществ у видов Hypericum L. // Раст. ресурсы. - 1990. - Т. 26, вып. 4. - С. 571-578.
2. Белодубровская Г.А., Жохова Е.В. Номенклатура лекарственных растений, используемых в гомеопатии: Методическое пособие. - СПб. : СПХФА,
1998. - С. 5.
3. Берике В. Материя Медика гомеопатических препаратов. - М. : «Гомеопатическая медицина», 2000. - 720 с.
4. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа.- 2-е изд., пере-раб. и доп. - Л. : «Химия», Ленингр. отд., 1968. -384 с.
5. Высочина Г.И. Фенольные соединения в систематике и филогении семейства гречишные / Центр. Сиб. бот. сад. - Новосибирск: Наука, 2004. - 240 с.
6. Государственная фармакопея РФ. 12-е издание. Часть 1. - М. : Научный центр экспертизы средств медицинского назначения, 2008. - 704 с.
7. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. -М. : Медицина, 1987. - 336 с.
8. Государственный реестр лекарственных средств.-М. : Информационно-издательское агентство «Ремедиум». - 2008. - Т. I. - 1398 с.
9. Киселева Т.Л., Смирнова Ю.А. Лекарственные растения в мировой медицинской практике: государственное регулирование номенклатуры и качества / Т.Л. Киселева, Ю.А. Смирнова. - М. : Издательство профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2009. - 295 с.
10. Киселева Т.Л., Смирнова Ю.А., Блинков И.Л., Дро-нова М.А., Цветаева Е.В. Краткая энциклопедия современной фитотерапии с основами гомеопатии: Справочник практического врача // Под ред. Т.Л. Киселевой. - М. : Изд-во Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2010. - 592 с.
11. Киселева Т.Л., Цветаева Е.В. Номенклатура производящих растений и сырья для производства гомеопатических лекарственных средств в России. -М. : Изд-во НПЦ традиционной медицины и гомеопатии Минздрава России, 2002. - 124 с.
12. Куркина А.В. Флавоноиды фармакопейных растений: монография. - Самара : Офорт, ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России, 2012. -290 с.
13. Ладыгина Е.Я., Сафронич Л.Н., Отряшенкова Л.А. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. - М. : Высшая школа, 1983. - С. 112.
14. Сборник методических рекомендаций по стандартизации лекарственных средств. - М. : Издательский дом «Пеликан», 2006. - С. 293- 309.
15. Турова А.Д., Сапожникова Э.Н. Лекарственные растения СССР и их применение. - 3- изд., пере-раб. и доп. - М. : Медицина, 1982. - С. 277-279.
16. Флора СССР, т. 5 / Под ред. акад. Комарова В.Л. -Л. : Издательство Академии наук СССР, 1936. -762 с.
17. Федеральный закон от 12.04.2010 № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств».
18. Homeoden-Heel. Catalogus, Baden-Baden: Simile-Gent, 1998. - 204 p.
77
