CC BY
34
Сер. 4. 2009. Вып. 3
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
УДК 577.323: 538.9+621.383: 544.72
И. Л. Волков, Н. В. Базлов, А. С. Бондаренко, О. Ф. Вывенко, Н. А. Касьяненко
РАЗРАБОТКА СПОСОБА НЕКОВАЛЕНТНОЙ ФИКСАЦИИ ДНК НА ПОВЕРХНОСТИ МОНОКРИСТАЛЛА КРЕМНИЯ
Введение. Конструирование и исследование наноструктур на основе биополимеров представляют большой интерес в связи с развитием новых технологий. В частности, для направленного создания сложных трёхмерных структур с заданными свойствами широко используются нуклеиновые кислоты [1, 2]. Одним из наиболее интересных объектов для подобного манипулирования является молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Её уникальные физико-химические свойства: комплементарность цепочек, высокая плотность заряда, большая жёсткость, - позволяют создавать нано-размерные структуры, способствующие решению различных задач не только в области молекулярной медицины и биологии, но и наноэлектроники [3-5]. Особую важность представляет изучение возможности сопряжения макромолекул с элементами твёрдотельной электроники. Первым шагом в этом направлении является исследование условий закрепления ДНК на поверхности полупроводникового кристалла, так как её электрофизические свойства в значительной степени определяются способом фиксации на подложке. Поиск способов закрепления молекул на поверхности, дающих минимальные искажения структуры, является актуальной задачей. Обычно для фиксации ДНК на кремнии используется химически модифицированная поверхность [6-8], обеспечивающая формирование ковалентных связей полимера с подложкой. Нековалентная связь с подложкой используется для осаждения молекул ДНК из раствора на свежесколотую поверхность слюды [9-13]. Считается, что такая связь обусловлена электростатическим взаимодействием ионов магния и молекул с метастабильным отрицательным зарядом, который образуется в процессе расщепления слюды и который сохраняется в течение достаточного для фиксации молекул времени вследствие большого удельного сопротивления материала.
Реальная поверхность полупроводников также в той или иной степени заряжена вследствие существования поверхностных состояний. Основная идея настоящей работы состояла в том, что знак и величина заряда поверхности, зависящие от типа и величины проводимости кристалла, могут быть изменены посредством освещения светом подходящего спектрального диапазона [14]. Однако прямых экспериментальных подтверждений возможности фиксации молекул ДНК непосредственно на поверхности полупроводника, по нашим сведениям, в литературе не имеется.
В настоящей работе приводятся результаты исследований процесса фиксации молекул ДНК на поверхности монокристаллического кремния в зависимости от типа проводимости подложки, состава используемых растворов, способа подготовки поверхности образцов и условий освещения.
Приготовление образцов. В работе использовалась тимусная ДНК фирмы «Sigma», молекулярная масса которой M = 8 • 106 Да была определена по значению характеристической вязкости в 0,15 M NaCl [15]. Концентрацию ДНК определяли
© И. Л. Волков, Н. В. Базлов, А. С. Бондаренко, О. Ф. Вывенко, Н. А. Касьяненко, 2009
спектрофотометрически по разнице поглощения гидролизованных в 6 % НС104 растворов при двух длинах волн (270 и 290 нм) [16]. Нативность ДНК контролировали по величине коэффициента молярной экстинкции при 260 нм. Используемые растворы содержали ДНК в концентрации 2,5 мкг/мл, NaCl в концентрации 0,005 М и в зависимости от условий эксперимента MgC12 в концентрации 0,0005 М.
Подложки размером 0, 3 х 5 х 10 мм3 вырезались из пластин монокристаллического кремния р- и n-типа проводимости с ориентацией (100). Концентрация свободных носителей в пластине p-типа составляла 4 • 1014 см_3, в пластине n-типа - 3 • 1014 ем_3. Все образцы протравливались в смеси HF + 10H2O в течение 2 минут при комнатной температуре. Одна часть приготовленных таким образом подложек выдерживалась на воздухе в течение 1,5 часов, поверхности других подвергались химическому окислению в растворе «пираньи» H202 + H2S04 при температуре 50 °С в течение 20 секунд с последующим промыванием в дистиллированной воде. На поверхность образцов при комнатной температуре наносилась капля раствора ДНК. После 10 минут выдержки в темноте или на свету подложка промывалась струёй дистиллированной воды для удаления незафиксированных макромолекул, а затем сушилась в вакууме в течение 30 минут. В качестве источника света использовался светодиод с длиной волны 680 нм и током 10 мА, который находился на расстоянии 5 мм от поверхности кристалла непосредственно над каплей раствора.
Эффективность фиксации молекул на поверхности контролировалась с помощью атомного силового микроскопа (АСМ) Nanoscope IVa (Veeco) в режимах прямого сканирования и прерывистого контакта. Изображения обрабатывались в программах NanoScope 7.20 и WSxM 4.0 Develop 13.0 [17].
Оценка плотности поверхностных электронных состояний проводилась по измерениям вольт-фарадных характеристик (ВФХ) и частотных зависимостей барьерных ёмкостей контактов металл-полупроводник дополнительных образцов каждой из пластин с помощью прибора Agilent 4294A по методике [18]. Для создания диодов Шоттки на образцы p-типа в вакууме термически напылялся титан, на образцы n-типа - золото.
При других комбинациях способа подготовки поверхности и вне зависимости от присутствия ионов магния в растворе мы не наблюдали молекул ДНК на поверхности
Экспериментальные результаты.
На рис. 1 представлено типичное АСМ изображение участка поверхности исходной пластины р-типа проводимости. Как видно из рисунка, используемые в экспериментах подложки были гладкими и не имели заметных дефектов.
Рис. 1. АСМ изображение участка поверхности исходной пластины р-типа проводимости
Нанесение капли раствора на подложку р-типа проводимости в темноте не приводило к фиксации молекул ДНК ни для каких комбинаций способа подготовки поверхности и наличия или отсутствия ионов магния в растворе. Фиксация ДНК наблюдалась только при освещении капли раствора и только на специально неокисленной поверхности кремния р-типа при добавлении в раствор MgCl2 (рис. 2а).
Рис. 2. АСМ изображение поверхности кремниевой подложки р-типа проводимости с зафиксированными молекулами ДНК (а); фрагмент АСМ изображения, выбранный для измерения толщины нитей (б); поперечный профиль высоты нитей на поверхности кремния (в), АСМ изображение поверхности слюды с зафиксированными молекулами ДНК (г), фрагмент АСМ изображения, выбранный для измерения толщины нитей (д), поперечный профиль высоты нитей на поверхности слюды (е)
освещаемых образцов. Результаты исследования фиксации ДНК при вариации условий
эксперимента суммированы в табл. 1.
Таблица 1
Результаты фиксации ДНК на поверхности кремниевых подложек р-типа проводимости при разных условиях эксперимента
Экспериментальные условия 10 мин выдержки в темноте 10 мин выдержки при освещении светодиодом
С^С12) = 0 С(]\%С12) = = 0, 0005 М С^С12) = 0 С(]\%С12) = = 0,0005 М
поверхность, окисленная в «пиранье» нет фиксации нет фиксации нет фиксации нет фиксации
специально не окисленная поверхность нет фиксации нет фиксации нет фиксации фиксация ДНК (рис. 2а)
Для сравнения на рис. 2г приведено изображение молекул ДНК, зафиксированных на свежесколотой поверхности слюды с использованием того же раствора. Условия эксперимента (время выдержки капли раствора ДНК на слюде, отмывка поверхности после фиксации дистиллированной водой, сушка в вакууме) были аналогичны используемым для кремниевых подложек. Фиксацию проводили при дневном освещении. Как видно из рисунков, количество иммобилизованных молекул на поверхности слюды больше, чем на кремнии. При этом на слюде макромолекулы произвольно изогнуты, тогда как на кремнии они вытянуты в одном направлении.
3 нм
Рис. 3. АСМ изображения по-
верхности кремниевых подложек п-типа после нанесения раствора ДНК, содержащего
MgCl2:
образцы экспонировались при освещении (а) и в темноте (б)
Подложки п-типа.
Подобно тому, как было выше отмечено для подложек р-типа проводимости, на образцах п-типа, окисленных в «пиранье», молекулы ДНК не закреплялись на поверхности ни при каких условиях эксперимента. Присутствие ионов магния в растворе также не позволяло зафиксировать молекулы.
На рис. 3 представлены изображения специально неокисленных поверхностей кремниевых подложек п-типа, полученные после нанесения и выдержки капли раствора ДНК, содержащего MgCl2, на свету и в темноте. Как видно из рис. 3а, в противоположность картине, наблюдаемой для образцов р-типа, освещение подложки п-типа не приводило к фиксации ДНК. После же экспозиции капли раствора в темноте на поверхности были отчетливо видны иммобилизованные молекулы ДНК, вытянутые вдоль одного направления, рис. 3б.
Обсуждение результатов. Как следует из приведённых выше экспериментальных результатов, необходимыми условиями фиксации ДНК на поверхности подложек п- и р-типов проводимости являлось присутствие ионов магния в капле раствора и предварительное травление образцов во фтористоводородной кислоте. Как и при фиксации на поверхности слюды [9-12], присутствие ионов магния в растворе обеспечивало закрепление отрицательно заряженной макромолекулы на поверхности.
В равновесных условиях в полупроводнике р-типа некоторое количество дырок связывается на поверхностных состояниях, всегда присутствующих на реальной поверхности кристалла [14]. Положительный заряд поверхности +Qs (рис. 4а) приводит к возникновению электрического поля, которое выталкивает свободные дырки вглубь полупроводника, образуя область пространственного заряда в его объеме (ОПЗ), а ионы магния - вглубь раствора. Освещение образца индуцирует генерацию электрон-дырочных пар в объеме кристалла. Неравновесные электроны под действием электрического поля в ОПЗ накапливаются у поверхности и частично захватываются на поверхностные уровни, увеличивая отрицательную компоненту поверхностного заряда —AQs, рис. 4б.
Если предположить, что механизм фиксации ДНК на кремнии чисто электростатический, как это полагается для слюды, то поверхность р^1 должна нести абсолютный отрицательный заряд, что представляется маловероятным, так как в этом случае изгиб зон у поверхности должен соответствовать обогащению основными носителями - дырками. Другое объяснения факта фиксации ДНК при освещении р^1 состоит в том, что двухвалентные ионы магния при подходе к поверхности захватывают свободные электроны, созданные освещением, и фиксируются на поверхности с образованием новых устойчивых поверхностных состояний в нижней половине или вблизи середины запрещённой зоны кремния. При этом каждый ион магния захватывает только один
а) р-Б1 б) р-Б1 в) и-81
Рис. 4- Зонные диаграммы приповерхностной области кремния для р- и те-типов проводимости в условиях термодинамического равновесия (а и в) и для р-типа в условиях освещения в собственной области спектра при Нн > (Ес — Еь) (б):
показаны зарядовые состояния ионов магния на поверхности, обусловленные положением соответствующего им уровня относительно уровня Ферми Ер; Ес — дно зоны проводимости, Еу — потолок валентной зоны, Ер п — квазиуровень Ферми для электронов в образце р-типа при освещении
электрон, остаётся однократно положительно заряженным и становится связующим звеном между подложкой и макромолекулой как показано на рис. 4б. Захват второго электрона ионом магния не происходит, так как энергетический уровень нейтрального атома магния на поверхности лежит выше по энергии на величину электростатического взаимодействия между двумя им захваченными электронами (порядка 0,5 эВ) и остаётся выше уровня Ферми. Увеличение положительного заряда поверхности кремния при помещении образца в раствор, содержащий ионы магния, в условиях освещения было действительно установлено по измерениям ВФХ. Поверхностная концентрация вновь образованных положительно заряженных центров была оценена как 2 • 1010 см~2.
В условиях термодинамического равновесия свободная поверхность подложки п-ти-па проводимости содержит отрицательный заряд, обусловленный захватом основных носителей заряда на поверхностные состояния. Плотность поверхностных состояний на специально не окисленной подложке, оцененная по частотным зависимостям ёмкости шоттки-диода Аи-(п^1), составляла величину около 109 см~2. Столь малая плотность отрицательного поверхностного заряда соответствует относительно небольшому, порядка 0,1—0,2 эВ, изгибу зон вверх, при котором все уровни ниже середины запрещённой зоны, в том числе уровень магния должны быть заполненными электронами. Это объясняет в рамках предложенной выше модели факт фиксации ДНК в темноте на кремнии п-типа, рис. 4в. Освещение в этом случае приводит к захвату неравновесных дырок однозарядными состояниями магния на поверхности и обратному переходу их в раствор.
Как показали результаты проведённых экспериментов, во всех случаях на предокис-ленном кремнии обоих типов проводимости фиксация молекул ДНК не происходит. Как это следует из наших измерений вольт-амперных характеристик шоттки-диодов, наращиваемый слой является туннельно-прозрачным. Поэтому он не представляет большого препятствия для свободных носителей заряда, и уменьшение их концентрации на границе раствор-полупроводник не может быть причиной отсутствия фиксации в этом случае. Другими причинами может быть электростатический эффект встроенного в оксид заряда или отсутствие связанных состояний магния на его поверхности в противоположность с безокисной поверхностью кремния.
Окисный слой на кремнии всегда содержит встроенный положительный заряд [19], природа и величина которого обусловлены самим процессом окисления. Оценка величины этого заряда из данных ВФХ дала величину около 1,2 • 1010 см~2, которая
того же порядка, что и плотность поверхностных состояний на неокисленном образце. Заряд подобной величины должен приводить к значительному изгибу зон вниз независимо от типа проводимости и увеличению заселённости электронами тех уровней, которые до окисления находились выше уровня Ферми. Поэтому в предложенной модели электростатический эффект встроенного заряда не может объяснить отсутствие фиксации молекул. Отсюда можно предположить, что главной причиной отсутствия фиксации молекул ДНК является отсутствие фиксации ионов магния на поверхности оксида кремния.
Анализ результатов проведённых экспериментов показывает, что наиболее вероятным механизмом фиксации молекул ДНК на поверхности кремния является захват свободных электронов на поверхностные состояния магния на кремнии. При этом, как это ни парадоксально, каждый захваченный электрон приводит к появлению элементарного положительного заряда на поверхности, и, как отмечалось, искривлению зон вниз. В результате поток электронов к поверхности должен увеличиваться по мере увеличения концентрации абсорбированных ионов магния. Этот процесс будет ограничиваться процессом захвата второго электрона с последующей нейтрализацией ионов магния, которые не являются центрами иммобилизации молекул ДНК. Таким образом, концентрация активных однократно заряженных ионов магния на поверхности умеренно легированного полупроводника не может расти неограниченно, а будет лимитирована некоей величиной. Последняя, в свою очередь, будет определять конечную плотность зафиксированных молекул ДНК.
В диэлектриках и вырожденных полупроводниках подобное ограничение не имеет места, и концентрация адсорбированных ионов магния определяется в большей степени их концентрацией в растворе. Этим, по-видимому, объясняется различие в плотности и геометрии зафиксированных молекул на поверхности слюды (рис. 2г) и кремния (рис. 2а, 3б). Меньшее количество точек закрепления молекул на кремниевой подложке по сравнению со слюдой приводит к их меньшей плотности и их вытягиванию вдоль потока при промывке после фиксации.
Следует отметить, что закрепление макромолекул на поверхности кремниевых подложек сохранялось в течение нескольких месяцев после проведения процедуры фиксации. Может ли электростатическое взаимодействие между ионами магния и ДНК обеспечить такую устойчивость во времени или оно лишь способствует сближению молекул с поверхностью до расстояний, на которых начинают действовать другие силы [6, 20], - ответ на этот вопрос должны дать будущие исследования.
Полученные в работе результаты демонстрируют принципиальную возможность использования фотоиндуцированного осаждения макромолекул для построения заданных микроэлектронных структур. С другой стороны, показанная в работе возможность закрепления молекул на поверхности кремния без дополнительных буферных слоёв допускает прямое детектирование происходящих в них электронных процессов с помощью электрофизических методов исследования, развитых в твердотельной электронике. Первым шагом в этом направлении будут исследования электронных состояний интерфейса ДНК-кремний.
Выводы. Предложен новый способ нековалентной фиксации ДНК на поверхности кремния р- и п-типов проводимости. Фиксация молекул ДНК на специально не окисленной поверхности монокристаллов кремния р-типа проводимости реализуется из раствора, содержащего ионы магния, при освещении образца в собственной области спектра поглощения. Молекулы не закрепляются на поверхности подложки при увеличенной толщине окисного слоя, отсутствии ионов магния в растворе или без освещения образца.
Предложена модель фиксации молекул на поверхности твёрдых тел, предполагающая образование точек закрепления в результате адсорбции ионов магния из раствора, стимулированной захватом последними свободных электронов твёрдого тела. Управление зарядом поверхности полупроводника с помощью внешнего освещения допускает принципиальную возможность применения технологии фотолитографии для создания микроэлектронных устройств с использованием макромолекул.
Литература
1. Seeman N. C. Design and Engineering of Nucleic Acid Nanoscale Assemblies // Current Opinion in Structural Biology. 1996. Vol. 6. N 4. P. 519-526.
2. Goodman R. P., Schaap I. A. T., Tardin C. F. et al. // Rapid chiral assembly of rigid DNA building blocks for molecular nanofabrication // Science. 2005. Vol. 310. N 5754. P. 1661-1665.
3. Ben-Jacob E, Hermon Z., Caspi S. DNA transistor and quantum bit element: realization of nano-biomolecular logical devices // Phys. Lett. (A). 1999. Vol. 263. Issue 3. P. 199-202.
4. Ongaro A., Griffin F., Nagle L. et al. DNA-Templated Assembly of a Protein-Functionalized Nanogap Electrode // Adv. Mater. 2004. Vol. 16. Issue 20. P. 1799-1803.
5. Endres R. G., Cox D. L., Singh R. R. P. Colloquium: The quest for high-conductance DNA // Rev. Mod. Phys. 2004. Vol. 76. P. 195-214.
6. Lin Z., Strother T., Cai W. et al. DNA attachment and hybridization at the silicon (100) surface // Langmuir. 2002. Vol. 18. P. 788-796.
7. Heim T., Deresmes D., Vuillaume D. Conductivity of DNA probed by conducting-atomic force microscopy: effects of contact electrode, DNA structure, and surface interactions // J. Appl. Phys. 2004. Vol. 96. N 5. P. 2927-2936.
8. Kasumov A. Yu., Klinov D. V., Roche P.-E. et al. Thickness and low-temperature conductivity of DNA molecules // Appl. Phys. Lett. 2004. Vol. 84. N 6. P. 1007-1009.
9. Vesenka J., Guthod M., Tang C. L. et al. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope // Ultramicroscopy. 1992. Vol. 42-44.
10. Thundat T., Allison D. P., Warmack R. J. et al. Atomic force microscopy of DNA on mica and chemically modified mica // Scanning Microscopy. 1992. Vol. 6.
11. Thomson N. H., Kasas S., Smith B. et al. Reversible binding of DNA to mica for AFM imaging // Langmuir. 1996. V. 12. P. 911-918.
12. Pastre D., Pietrement O., Fusil S. et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study // Biophysical Journal. 2003. Vol. 85. P. 2507-2518.
13. Wyckoff R. W. G. Crystal Structures. New York: Wiley, 1960. Vol. 4.
14. Бонч-Бруевич В. Л., Калашников С. Г. Физика полупроводников. М., 1990. 320 c.
15. Eigner J., Doty P. The native, denatured and renatured states of deoxyribonucleic acid // J. Mol. Biol. 1965. Vol. 12. P. 549-580.
16. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. Т. 23. № 5. С. 656-662.
17. Horcas I., Fernandez R., Gomez-Rodriguez J. M. et al. // Rev. Sci. Instrum. 2007. Vol. 78. P. 013705-(1)-013705-(8).
18. Werner J., Ploog K., Queisser H. J. Interface-State Measurements at Schottky Contacts: A New Admittance Technique // Phys. Rev. Lett. 1986. Vol. 57. N 8. P. 1080-1083.
19. Барабан А. П., Булавинов В. В., Коноров П. П. Электроника слоёв SiO2 на кремнии. Л., 1988.
20. Sun Qiao Yu, de Smet L., van Lagen B. et al. // Covalently attached monolayers on crystalline hydrogen-terminated silicon: extremely mild attachment by visible light // J. Am. Chem. Soc. 2005. Vol. 127. N 8. P. 2514-2523.
Принято к публикации 26 декабря 2009 г.
