CC BY-ND
15
40
ЗНиСО март nq (300)
Obshhie trebovanija k kompetentnosti ispytatel'nykh i kalibrovochnykh laboratorij: GOST ISO/MEK 17025-2009 [General requirements for the competence of testing and calibration laboratories: GOST ISO/IEC 17025-2009]. Available at: http://gostrf.com/normadata/1/4293801/ 4293801404.pdf (accessed 05.12.2016). (In Russ.)
Otsenka sootvetstvija. Osnovnye trebovanija k provedeniju proverki kvalifikatsii: GOST ISO/IEC 17043-2013 [Conformity assessment. Basic requirements for the qualification test: GOST ISO/IEC 170432013]. Available at: http://docs.cntd.ru/document/1200108187 (accessed 05.12.2016). (In Russ.)
Politika Rosakkreditatsii v otnoshenii proverki kvalifikatsii putem pro-vedenija MSI : Utv. rukovoditelem Federal'noj sluzhby po akkreditacii 28.10.2016: № 03.1-9.0099 [Policy of the Federal service for accreditation in respect of the qualification test by holding the ICT (approved by the Head of the Federal Service for Accreditation 28.10.2016, no. 03.19.0099)]. Available at: http://oookompetentnost'.rf/upload/iblock/aad/ aad35ccf9be34b3ceeb77ef526449f3f.pdf (accessed 05.12.2016). (In Russ.) Sterlikov A.V. Analiz protsessa akkreditatsii ispytatel'nykh laboratorij i organov inspektsii uchrezhdenij federal'nogo mediko-biologicheskogo agentstva [Analysis of the process of accreditation of testing laboratories and inspection agencies of the Federal medical-biological Agency]. Aktual'nye problemy mediko-sanitarnogo obespechenija dejatel'nosti objektov morskoj tehniki, predprijatij s vrednymi i (ili) opasnymi proiz-
vodstvennymi faktorami, a takzhe ekologicheskogo blagopoluchija ter-ritorij, obsluzhivaemykh Federal'nym mediko-biologicheskim agentst-vom: Materialy IV Vserossijskoj nauchno-prakticheskoj konferentsii pos-vjashhennoj 50-letiju Federal'nogo gosudarstvennogo unitarnogo pred-prijatija nauchno-issledovatel'skogo instituta promyshlennoj i morskoj mediciny Federal'nogo mediko-biologicheskogo agentstva (28-29 ijunja 2017 2 Sankt-Peterburg, Rossija). Saint Petersburg, 2017, pp. 302-303. (In Russ.)
11. ILAC Policy for Participation in Proficiency Testing Activities ILAC P9:06/2014. Available at: http://gac.gov.ge/files/ILAC.pdf (accessed 05.12.2016).
Контактная информация:
Стерликов Александр Васильевич, кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией ФГУП «Научно-технический центр радиационно-химической безопасности и гигиены» ФМБА России тел.: +7 (903) 231-91-88, e-mail: asterlikov@mail.ru
Contact information:
Sterlikov Alexander, Candidate of Medical Sciences, Head of laboratory of the Scientific and Technical Center of Radiation-Chemical Safety and Hygiene of the Federal Medical-Biological Agency of Russia phone: +7 (903) 231-91-88, e-mail: asterlikov@mail.ru
-V-
© Рыковская О.А., Полеева М.В., Чемисова О.С., Трухачев А.Л., 2018 УДК 579.843:57.083.18:576.3
РАЗРАБОТКА СПОСОБА ИДЕНТИФИКАЦИИ V. PARAHAEMOLYTICUS С ПОМОЩЬЮ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
О.А. Рыковская, М.В. Полеева, О.С. Чемисова, А.Л. Трухачев
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора, ул. Максима Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия
Бактерии V. parahaemolyticus - галофильные микроорганизмы, которые могут быть причиной возникновения острого кишечного заболевания у людей, протекающего по типу пищевой токси-коинфекции. Успех лечебно-профилактических и санитарно-эпидемиологических мероприятий, направленных на предотвращение распространения «галофилезов» во многом зависит от своевременной точной идентификации штаммов вибрионов, выделяемых от больных, из морепродуктов и при мониторинге объектов окружающей среды. В данной работе представлен способ идентификации штаммов вида V. parahaemolyticus методом ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR), который включает выделение хромосомной ДНК из исследуемого материала, постановку ПЦР со сконструированными нами праймерами, специфичными к участку гена коллагеназы vppC, и зондом, позволяющим детектировать амплифицированный фрагмент и проводить учет полученных результатов в режиме реального времени.
Ключевые слова: парагемолитические вибрионы; металлопротеаза (коллагеназа); ПЦР в режиме реального времени.
O.A. Rykovskaya, M.V. Poleeva, O.S. Chemisova, A.L. Trukhachev □ DEVELOPMENT OF A METHOD FOR IDENTIFYING OF V. PARAHAEMOLYTICUS BY REAL-TIME PCR □ Rostov-on-Don Research Institute for Plaque Control of Rospotrebnadzor, 117/40, Maxim Gorky str., Rostov-on-Don, 344002, Russia.
Bacteria of the species V. parahaemolyticus are halophilic microorganisms that may be causing acute enteric disease in humans, occurring according to the type of foodborne illness. The success of the treatment-and-prophylactic and samtary-epidemiological measures aimed at the prevention of the proliferation of «halophiles» largely depends on timely and accurate identification of strains of Vibrio secreted from patients, seafood, as well as in monitoring of environmental objects. This paper presents a method of identifying strains of the species V. parahaemolyticus by PCR in «real time» (Real-Time PCR), which enables the selection of chromosomal DNA from the test material, the PCR with the designed by us primers specific to the portion of a gene collagenase vppC and the probe, allowing to detect amplificatory the fragment and to incorporate the results in real-time. Key words: Vibrio parahaemolyticus; metalloprotease (collagenase); Real-time PCR.
В последние годы все большее внимание уделяется случаям пищевых инфекций среди людей, вызываемых галофильными вибрионами. Наиболее частым этиологическим агентом диарейных заболеваний, связанных с галофиль-ными микроорганизмами, являются штаммы V. parahaemolyticus. Средой обитания представителей вида V. parahaemolyticus является морская вода, а основным фактором передачи человеку служат инфицированные ими гидробионты. Опасность заражения V. parahaemolyticus существует везде, где население использует в питании продукты моря и контактирует с морской водой. Поэтому для практического здравоохранения важно быстро и достоверно определить возбудителя в исследуемом материале.
В настоящее время существует большое количество микробиологических методов детекции, основанных на культивировании, выделении чистых культур и биохимической идентификации этих вибрионов [1]. Сложность идентификации и дифференциации парагемолити-ческих от других близкородственных видов вибрионов традиционными методами обусловлена их большим фенотипическим сходством, вариабельностью признаков и, как следствие, небольшой относительной диагностической ценностью отдельных таксономических тестов. Для быстрой идентификации V. parahaemoly-Шш успешно применяется метод МЛЬ01-ТоР масс-спектрометрии; однако, не все лаборатории оснащены необходимым оборудованием [5].
март № (300) зНиСО
49
В связи с этим весьма перспективен метод ПЦР с видоспецифичными праймерами, позволяю-!zz щий определить в геноме бактерий участки молекулы ДНК, специфичные для каждого вида а микроорганизма [6, 8, 10]. Данный метод облает дает рядом преимуществ по сравнению с традиционными бактериологическим и серологическим методами, так как сочетает в себе быст-сэ роту и простоту исполнения, а также высокую специфичность и чувствительность при выявлении патогенных микроорганизмов. Однако недостатком данного метода является необходимость учета результатов реакции с помощью электрофореза, что требует дополнительное время и оборудование, а также отдельные рабочие зоны, для предотвращения контаминации анализируемых образцов.
В последние годы широкое распространение получил метод идентификации микроорганизмов с помощью полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (Real-Time PCR) [9]. Основными преимуществами Real-Time PCR является объединение этапов амплификации и детекции, что упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации, позволяет проводить количественный учет результатов, обеспечивает высокую специфичность и чувствительность анализа [3].
Ранее было показано, что для V. parahae-molyticus видоспецифичным является участок ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность генов металлопротеазы (коллагена-зы) - vppC [4, 7]. Однако в Российской Федерации отсутствуют зарегистрированные олиго-нуклеотидные праймеры и зонды для видовой идентификации вида V. parahaemolyticus. Поэтому цель исследования - разработка способа идентификации вида V. parahaemolyticus на основе метода полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (Real-Time PCR).
Материалы и методы. В работе было использовано 100 штаммов V. parahaemolyticus из коллекции Музея живых культур ФКУЗ «Рос-товский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора с точно установленной видовой принадлежностью, а также коллекционные штаммы других видов рода Vibrio: V. algino-lyticus, V. fluvialis, V. hollisae, V. vulnificus, V. harvey, V. mimicus, V. furnisii и V. fortis.
Для анализа нуклеотидной последовательности ДНК V. parahaemolyticus была использована база данных GeneBank. Для поиска уникальных последовательностей специфического гена были использованы ресурсы GeneBank -on-line Blast. Для конструирования праймеров и зонда было применено программное обеспечение PrimerM (ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора) и BLAST NCBI.
Синтез сконструированных нами праймеров и зонда был осуществлен компанией «Синтол» (г. Москва). Затем были подобраны оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (концентрация праймеров, температурные параметры и количество циклов амплификации). Для проведения амплификации использована коммерческая стандартизированная реакционная смесь для проведения ПЦР в режиме реального вре-
мени компании «Синтол» (г. Москва). Амплификацию и флуоресцентную детекцию проводили на автоматическом детектирующем тер-моциклере «ДТ-Lite» (ДНК-технология, Россия), в режиме реального времени.
Результаты исследования. Для дизайна праймеров был использован ген металлопротеазы (коллагеназы) V. parahaemolyticus. С помощью программного обеспечения PrimerM (ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора) и BLAST NCBI был проанализирован участок гена металло-протеазы (коллагеназы), в результате чего определен специфический фрагмент гена, который был использован в качестве мишени для конструирования специфического зонда, комплементарного соответствующей последовательности ДНК. Зонд имел следующую структуру: vppCProbaA (ROX-CG-TTC-ACA-ACC-ACC-AAC-AGC-AAC-GAC-TTG-BHQ2). Зонд
комплементарен специфическим продуктам ПЦР, гибридизуясь с ними и впоследствии разрушаясь под воздействием ДНК-полимеразы во время ферментативной реакации, что приводит к началу флуоресцентного свечения флуорофо-ра, связанного с зондом. Данный специфический зонд vppCProbaA, содержащий в своем составе флуоресцентную метку ROX, гаситель флуоресценции BHQ2.
Для амплификации в ПЦР фрагмента ДНК, содержащего мишень для зонда, и в соответствии с нуклеотидной последовательностью зонда были сконструированы и синтезированы специфичные для вида V. parahaemolyticus праймеры:
Праймер vppCFor (CGG-CAA-GCG-TGG-TTT-GTG-AC)
Праймер vppCRev (CGT-TGA-TGC-AAC-TTG-CAC-CTT-G).
Для постановки ПЦР суточные агаровые культуры суспендировали в дистиллированной воде до 1^10 микробных клеток в 1 мл и обеззараживали прогреванием при 100 °С в течение 15 минут, согласно МУ 1.3.2569-09 [2]. Затем дебрис осаждали центрифугированием при 10 тыс. об./мин в течение 5 минут, и суперна-танты использовали в качестве ДНК-матриц при ПЦР.
Следующий этап заключался в составлении реакционной смеси для ПЦР. Реакцию проводили в 25 мкл смеси, содержащей: 1 х (в финальной концентрации) буферный раствор для ПЦР в реальном времени (Интерлабсервис, Москва), 0,25 мМ каждого из дезоксинуклео-зидтрифосфатов (Thermo Scientific), 1 ед. Taq-полимеразы с функцией «горячего старта» (Ин-терлабсервис, Москва), 2,5 мМ хлористого магния (Интерлабсервис, Москва), 50 пкМ каждого праймера, 50 пкМ зонда и 20 нг хромосомной ДНК одного из исследуемых штаммов.
После приготовления реакционной смеси осуществляли постановку реакции амплификации в автоматическом детектирующем ампли-фикаторе ДТ-Lite (ДНК-технология, Россия), в котором были заданы следующие условия амплификации: первичной денатурации и активации Taq-полимеразы (94 °С, 15 мин), 35 циклов, включающих этапы 94 °С, 30 с, 55 °С, 30 с (детекция) и 72 °С, 30 с.
Детекция флуоресценции производится автоматически в ходе проведения ПЦР с помощью детектирующего амплификатора. При на-
5O
ЗНиСО МАРТ № (3OO)
личии в исследуемой пробе ДНК гена металло-протеазы (коллагеназы) вида V. parahaemoly-ticus с помощью используемой пары специфических праймеров гибридизируется зонд, так как является комплементарным ему (фрагменту), а последуещее разрушение зонда Taq-полимеразой приводит к началу флуоресцентного свечения флуорофора ROX с длиной волны 605 нм, которое регистрируется прибором.
Учет детекции флуоресцентного свечения по соответствующей длине волны в амплификаторе отражается на мониторе компьютера, связанного с прибором, в виде графиков, на которых представлены кривые и численные значения, отражающие уровни флуоресцентного свечения определенной длинны волны, соответствующие каждой пробе, взятой для исследования.
При апробации предложенного способа на коллекционных штаммах V. parahaemolyticus (100 штаммов) с точно установленной видовой принадлежностью и штаммах видов V. algino-lyticus (25 штаммов), V. fluvialis (10 штаммов), V. hollisae (5 штаммов), V. vulnificus (10 штаммов), V. harvey (5 штаммов), V. mimicus (5 штаммов), V. furnisii (5 штаммов) и V. fortis (2 штамма) разработанные праймеры и зонд показали 100%-ю специфичность по отношению к штаммам V. parahaemolyticus.
Таблица 1. Результаты идентификации клинических
Флуоресцентный сигнал с длиной волны 605 нм, характерной для флуорофора Rox, де- а тектировался в ПЦР выше порогового значения тогда, когда пробы содержали ДНК парагемо- i= литических вибрионов, и не детектировался в случае содержания в пробах ДНК других представителей рода Vibrio (табл. 1). ^ Заключение. В результате проведенной ра- ^J боты были сконструированы специфичные прай-меры и зонд к ДНК гена металлопротеазы (коллагеназы) V. parahaemolyticus. Были подобраны оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции с выбранной парой праймеров и флуоресцентным зондом в режиме реального времени. Использование предполагаемого способа выявления специфического участка ДНК гена ме-таллопротеазы (коллагеназы) V. parahaemolyticus с помощью ПЦР в режиме реального времени позволит быстро, точно и эффективно проводить идентификацию представителей вида V. parahaemolyticus и дифференцировать их от близкородственных видов. Простое в исполнении тестирование, небольшая себестоимость, высокая чувствительность и специфичность данных праймеров и зонда даст возможность применять их в практике бактериологических лабораторий Центров гигиены и эпидемиологии, а также в лечебно-профилактических, противочумных и других учреждениях.
штаммов V. parahaemolyticus методом Real-Time ПЦР
№ п/п Количество исследованных штаммов Результаты ПЦР
Вид микроорганизма количество положительных проб количество отрицательных проб
l V. parahaemolyticus l00 l00 0
2 V. alginolyticus 25 0 25
3 V. fluvialis l0 0 l0
4 V. hollisae 5 0 5
5 V. vulnificus l0 0 l0
6 V. harvey 5 0 5
7 V. mimicus 5 0 5
S V. furnisii 5 0 5
9 V. fortis 2 0 2
О
о
ЛИТЕРАТУРА (п. 6—10 References)
Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагем< тическими и другими патогенными для человека вибрионами: МУК 4.2.1793-03 (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 02.11.2003). М.: Минздрав России, 2003. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности: МУ 1.3.2569-09 (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009). М.: Минздрав России, 2009. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР в реальном времени. М: Бином. Лаборатория знаний, 2009. 223 с. Рыковская О.А., Чемисова О.С., Смоликова Л.М. и др. Дифференциация представителей Vibrio parahaemolyticus и Vibrio alginolyticus // Клиническая лабораторная диагностика. 2014. Т. 59. № 12. С. 50—55. Чемисова О.С., Телесманич Н.Р., Рыковская О.А. и др. Масс-спектрометрический анализ как метод идентификации и внутривидовой дифференциации Vibrio parahaemolyticus // Холера и патогенные для человека вибрионы: Материалы проблемной комиссии. Ростов-на-Дону. 2013. Вып. 26. С. 153—157.
REFERENCES
iches-
Laboratornaja diagnostika zabolevanij, vyzyvaemykh paragemolil. kimi i drugimi patogennymi dlja cheloveka vibrionami: MUK 4.2.179303 (utv. Glavnym gosudarstvennym sanitarnym vrachom Rossijskoj Federatsii 02.11.2003) [Laboratory diagnosis of diseases caused by parahaemolyticus and other pathogenic for humans vibrios: MUK 4.2.1793-03 (approved by Chief state sanitary doctor of the Russian Federation, 02.11.2003)]. Moscow: Minzdrav Rossii, 2003. (In Russ.) Organizatsija raboty laboratory, ispol'zujushchikh metody amplifikatsii nuk-leinovykh kislot pri rabote s materialom, soderzhashhim mikroorganizmy I-IV grupp patogennosti: MU 1.3.2569-09 (utv. Glavnym gosudarstvennym sanitarnym vrachom Rossijskoj Federatsii 22.12.2009) [Organization of work of laboratories using methods of nucleic acid amplification when working with material containing microorganisms of pathogenicity groups I-IV: MU 1.3.2569-09 (approved by the Chief state sanitary doctor of the Russian Federation, 22.12.2009)]. Moscow: Minzdrav Rossii, 2009. (In Russ.) Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Ju. et al. PCR v real! meni [Real-time PCR]. Moscow: Binom. Laboratorija znanij, 2009. (In (R I)
Rykovskaja O.A., Chemisova O.S., Smolikova L.M. et al. Differentsia-tsija predstavitelej Vibrio parahaemolyticus i Vibrio alginolyticus [Differentiation of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus representatives]. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika, 2014, vol. 59, no. 12, pp. 50-55. (In Russ.)
Chemisova O.S., Telesmanich N.R., Rykovskaja O.A. et al. Mass-spektrometricheskij analiz kak metod identifikatsii i vnutrividovoj differentsiatsii Vibrio parahaemolyticus [Mass spectrometric analysis as a method of identification and intraspecific differentiation of Vibrio parahaemolyticus]. Holera i patogennye dlja cheloveka vibriony: Mater. probl. komissii. Rostov-on-Don, 2013, issue 26, pp. 153-157. (In Russ.) Chakraborty R. et al. Species-specific identification of Vibio_.fluvialis by PCR targeted to the conserved transcriptional activation ; brane tether regions of the toxRgene / R. Chakraborty, S.
l0.
nd variable mem-Sinha, A.K. Muk-
hopadhyay [et al.] // J. Med. Microbiol. 2006. Vol. 55. P. 8U5-808. 7. Di Pinto A. et al. A collagenase-targeted multiplex PCR assay for
Vibrio cholerae, and Vibrio rese, G. Tantillo // J. of Food
identification of Vibrio alginolyt parahaemolyticus/ A. Di Pinto, G. Cicca Protection. 2005. Vol. 6s. № l. P. l 10-^53.
Khamesipour F. et al. Detection of Vibrio spp. in shrimp from aqua sites in Iran using polymerase chain reaction (PCR) /F.Khame E.Noshadi, M.Moradi [et al.] // J. AACL Biofux. 2014. Vol. 7. № 1. P
9. Panicker G. et al. Real-time PCR detection of Vibrio vulnificus in oysters:
comparison of oligonucleotide primers and probes targeting vvhA cker, A.K. Bej // J. Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71. № 10. P. 5 Reham A.A. et al. Specific Detection of Pathogenic Vibrio s shellfish by using multiplex polymerase chain reaction / A.A. M.S. Amani // J. Global Veterinaria. 2012. Vol. 8. №5. P. 525
C—s
ani-Ю9
Контактная информация:
Рыковская Оксана Алексеевна, научный сотрудник музея живых культур с центром патогенных для человека вибрионов ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора тел.: +7 (928) 191-15-42, e-mail: rykowskaya_oa@antiplague.ru Contact information:
Rykowskaya Oksana, Researcher of the Museum of living cultures with the Center of human pathogenic vibrions of Rostov-on-Don Research Institute for Plaque Control of Rospotrebnadzor phone: +7 (928) 191-15-42, e-mail: rykowskaya_oa@antiplague.ru
S
