CC BY
21
ISSN2221-7711 Национальные приоритеты России. 2021. № 3 (42)
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. МУ 3.1.3.2600-10. Мероприятия по борьбе с лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации.
2. Молчанова Е.В. Мониторинговые исследования арбовирусных инфекций, передающихся комарами, на территории Волгоградской области / Е.В. Молчанова, Д.Н. Лучинин, А.О. Негоденко, Д.Р. Прилепская [и др.]. Здоровье населения и среда обитания - ЗНиСО 2019; (6):60-66.
3. Негоденко А.О. Анализ результатов мониторинга арбовирусных инфекций на территории Волгоградской области в 2019 г. / А.О. Негоденко, Е.В. Молчанова, Д.Р. Прилепская, П.Ш. Коновалов [и др.]. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2021; 20 (1):51-59. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2021-20-1-51-59.
REFERENCES
1. MU 3.1.3.2600-10. Meropriyatiya po bor'be s lihoradkoj Zapadnogo Nila na territorii Rossijskoj Federacii.
2. Molchanova E.V. Monitoringovye issledovaniya arbovirusnyh infekcij, peredayushchihsya komarami, na territorii Volgogradskoj oblasti / E.V. Molchanova,
D.N. Luchinin, A.O. Negodenko, D.R. Prilepskaya [i dr.]. Zdorov'e naseleniya i sreda obitaniya - ZNiSO 2019; (6):60-66.
3. Negodenko A.O. Analiz rezul'tatov monitoringa arbovirusnyh infekcij na territorii Volgo-gradskoj oblasti v 2019 g. / A.O. Negodenko,
E.V. Molchanova, D.R. Prilepskaya, P.SH. Konovalov [i dr.]. Epidemiologiya i vakcinoprofilaktika. 2021;
20 (1):51-59. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2021-20-1-51-59.
Никитин Дмитрий Николаевич - научный сотрудник лаборатории эпидемиологического анализа и противоэпидемического обеспечения; Удовиченко Светлана Константиновна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории эпидемиологического анализа и противоэпидемического обеспечения; Путинцева Елена Викторовна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории эпидемиологического анализа и противоэпидемического обеспечения; Бородай Наталья Владимировна - старший научный сотрудник сектора эпизоотологического мониторинга; ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Волгоград.
УДК 616.98:579.842.23
Никифоров К.А., Оглодин Е.Г., Куклева Л.М., МакашоваМ.А., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В.
Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", Роспотребнадзора, Саратов, Россия
РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS АНТИЧНОГО И СРЕДНЕВЕКОВОГО БИОВАРОВ РАЗНЫХ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛИНИЙ
Разработана система аллель-специфических ПЦР-РВ для дифференциации филогенетических линий античного и средневекового биоваров Y. pestis, использование которой сократит время, необходимое для определения внутривидовой принадлежности штаммов чумы в рамках эпидемиологического расследования вспышек или заносов чумы на территорию РФ.
Ключевые слова: возбудитель чумы, штаммы, идентификация, ПЦР, аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени
ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЕ ИНФЕКЦИИ И ИНВАЗИИ
Nikiforov K.A., Oglodin E.G., Kukleva L.M., MakashovaM.A., Eroshenko G.A., Kutyrev V. V.
Federal State Healthcare Institution Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Rospotrebnadzor, Saratov, Russia
DEVELOPMENT OF A SYSTEM OF ALLEL-SPECIFIC REAL TIME PCR FOR DIFFERENTIATION OF YERSINIA PESTIS STRAINS OF ANTIQUE AND MEDIEVAL BIOVARS OF DIFFERENT PHYLOGENETIC LINE
A system of allele-specific RT-PCR has been developed for the differentiation of phylogenetic lines of ancient and medieval biovars of Y. pestis, the use of which will reduce the time required to determine the intraspecific affiliation of plague strains within the framework of an epidemiological investigation of outbreaks or intrusions of plague into the territory of the Russian Federation.
Keywords: plague pathogen, strains, identification, PCR, allele-specific real-time PCR.
Природные очаги чумы находятся на всех континентах, за исключением Австралии и Антарктиды в различных ландшафтно-климатических регионах (высокогорных, равнинно-предгорных, степных, полупустынных, пустынных), обладающих разными природными условиями [1]. Это послужило причиной значительного внутривидового разнообразия штаммов Y. pestis и различий в свойствах.
На основании данных полногеномного секвенирования проведено усовершенствование внутривидовой классификации возбудителя чумы с выделением семи подвидов: основной, тибетский (0.PE7), кавказский (0.PE2), ангольский (0.PE3), центральноазиатский (0.PE4), цинхайский (0.PE10), улегейский (0.PE5) [2].
Штаммы основного подвида делятся с образованием трех биоваров - античного, средневекового и восточного, характеризующихся высокой вирулентностью и эпидемической значимостью. Античный биовар образован несколькими филогенетическими линиями: 0.ANT (включает ветви 0.ANT1, 0.ANT2 штаммы которых распространены в Китае; а штаммы ветвей 0.ANT3, 0.ANT5 циркулируют на территории Кыргызстана), 1. ANT (Центральная Африка), 2.ANT (ряд очагов Китая и Забайкальский степной природный очаг чумы), 3.ANT (некоторые очаги Китая и Монголии), 4.ANT (Горно-Алтайский высокогорный и Сайлюгемский природные очаги РФ и Монголии). Эволюция линии 1.ANT привела к возникновению восточного биовара (линия 1.ORI), распространившемуся по всем континентам (Европа, Юго-Восточная Азия, Африка, Северная и Южная Америки) во время тре-
тьей пандемии чумы. Линия 2.АМГ является предковой по отношению к средневековому биовару, который в свою очередь состоит из нескольких филогенетических ветвей. На территории Российской Федерации распространены штаммы ветвей 2.MED0 (Центрально-Кавказский высокогорный очаг чумы) и 2.MED1 (большинство очагов РФ и других стран СНГ). Штаммы филогенетических ветвей 2.MED2 и 2.MED3 характерны для ряда очагов Китая.
Таким образом, на территории Российской Федерации и сопредельных государств распространены штаммы разных ветвей эволюции возбудителя чумы античного и средневекового биоваров. Это требует разработки системы быстрой и надежной дифференциации штаммов Y. pestis по их происхождению, которая значительно повысит эффективность эпидемиологического расследования вспышек или заноса чумы на территории РФ.
Наиболее перспективным методом для такой системы является ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуорес-центным учетом результатов (ПЦР-РВ). Не все филогенетические ветви К pestis имеют в своем геноме маркерные протяженные делеции или вставки, и зачастую требуется определение специфических единичных полиморфных нуклеотидов (SNPs), являющихся наиболее распространенными генетическими маркерами в геноме [3]. Детекция маркерного SNP может быть осуществлена с помощью фрагментного секвенирования, однако, это требует большего времени, чем ПЦР-РВ. В связи с этим становится очевидной необходимость разработки аллель-специфической ПЦР-РВ (ас-ПЦР-РВ).
ISSN2221-7711 Национальные приоритеты России. 2021. № 3 (42)
Метод основан на разной эффективности элонгации спаренного и неспаренного 3'-нуклеотида ДНК-полимеразой. Это приводит к отсутствию продукта амплификации при несовпадении 3'- нуклеотида праймера и матрицы ДНК [4].
Цель настоящего исследования состояла в разработке системы ас-ПЦР-РВ для дифференциации ветвей эволюции античного и средневекового биоваров Y. pestis, в связи с преимущественной циркуляцией штаммов средневекового и античного биовара в природных очагах чумы РФ и стран СНГ и их высокой вирулентностью, и эпидемической значимостью.
В рамках данной работы мы разработали комплекты праймеров и зондов для дифференциации штаммов филогенетических линий античного и средневекового биоваров: 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 0.ANT5, 3.ANT, 4.ANT, 2.MED0, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3.
В качестве маркерных SNPs были выбраны: для штаммов филогенетической линии 0.ANT1 - замена Т на С в позиции 2283467 (ген pth) от начала генома согласно номенклатуре генома референсного штамма СО92 (Nc_003143.1); для штаммов линии 0.ANT2 -замена G на T в позиции 418282 (ген YPO RS03000); для штаммов линии 0.ANT3 -замена С на T в позиции 2003542 (ген manX); для штаммов линии 0.ANT5 - замена С на А в позиции 121618 (ген metJ); для штаммов линии 3.ANT - замена С на А в позиции 4466107 (ген YP0RS20945); для штаммов линии 4.ANT - замена G на А в позиции 1610851 (ген rlmKL); для штаммов линии 2.MED0 - замена С на Т в позиции 574446 (ген leuC); для штаммов линии 2.MED1 - замена G на A в позиции 3596834 (ген dinB); для штаммов линии 2.MED2 - замена С на Т в позиции 1458747
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Попов Н.В. [и др.]. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири [Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева]. М. : Медицина, 2004, 192 с.
2. Kutyrev V.V., Eroshenko G.A., Motin V L. [et al.]. Phylogeny and classification of Yersinia pestis through the lens of strains from the plague foci of Commonwealth of Independent States. Front. Microbiol. 2018, 9, 1106. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01106.
3. Soleimani, V.D., Baum, B.R. and Johnson, D.A. (2003) Efficient validation of single nucleotide polymor-
(ген fruK); для штаммов линии 2.MED3 - замена С на Т в позиции 710418 (ген YPORS04240).
При подборе аллель-специфичных праймеров был выбран подход, при котором маркерный SNP соответствует позиции -1 от конца аллель-специфичного прямого прайме-ра. Кроме того, в составе прямого праймера три последних нуклеотида на 3'-конце были заменены на LNA-олигонуклеотиды (нуклео-тиды с замкнутым кольцом рибозы в позициях С2 и С4 и метильной группой, повышающей температуру плавления цепей по сравнению с обычными нуклеотидами).
В результате для дифференциации штаммов филогенетических линий античного и средневекового биоваров были подобраны комплекты праймеров и зондов. Подобраны оптимальные программы амплификации. Специфичность рассчитанных праймеров подтверждена с использованием 50 штаммов разных филогенетических линий. Наличие сигналов флуоресценции регистрировалось только у штаммов линий эволюции 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 0.ANT5, 3.ANT, 4.ANT, 2.MED0, 2.MED1, 2.MED2 и 2.MED3 при использовании соответствующих комплектов праймеров и зондов.
Таким образом, разработана система ас-ПЦР-РВ для дифференциации ветвей эволюции античного и средневекового биоваров Y. pestis, использование которых значительно сократит время, требуемое для получения результата, при проведении внутривидовой дифференциации штаммов чумы в рамках эпидемиологического расследования вспышек или заноса чумы на территорию РФ, а также эпидемиологического мониторинга очаговых по чуме территорий России и сопредельных государств.
REFERENCES
1. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., Popov N.V. [et al.]. Natural plague foci in the Territory of Caucasus, Caspian-Sea Region, Central Asia and Siberia. Mos-cow:Medicine, 2005. 192 p.).
2. Kutyrev V.V., Eroshenko G.A., Motin V. L. [et al.]. Phylogeny and classification of Yersinia pestis through the lens of strains from the plague foci of Commonwealth of Independent States. Front. Microbiol. 2018, 9, 1106. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01106.
3. Soleimani, V.D., Baum, B.R. and Johnson, D.A. (2003) Efficient validation of single nucleotide polymor-
ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЕ ИНФЕКЦИИ И ИНВАЗИИ
phisms in plants by allele-specific PCR, with an example from barley. Plant Mol. Biol. Rep. 21, 281-288.
4. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, Markham AF. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989;17(7):2503-16.
phisms in plants by allele-specific PCR, with an example from barley. Plant Mol. Biol. Rep. 21, 281-288.
4. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, Markham AF. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989;17(7):2503-16.
Никифоров Константин Алексеевич - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии; Оглодин Евгений Геннадьевич - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии; Куклева Любовь Михайловна -кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии; Макашова Марина Александровна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, Ерошенко Галина Александровна - доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, Кутырев Владимир Викторович - доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, директор; ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.
УДК 578.833.29:614.3
Нышанов Н.С., Кузьмина А.Р., Орынкожа А.О.
Департамент санитарно-эпидемиологического контроля Туркестанской области, г. Туркестан, Казахстан
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИМ НАДЗОР ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ ККГЛ В ТУРКЕСТАНСКОМ РЕГИОНЕ ТУРКЕСТАНСКОЙ ОБЛАСТИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН В 2006-2018 гг.
Проведен сравнительный ретроспективный эпидемиологический анализ по изучению причин возникновения и распространения особо опасной вирусной инфекции. Спорадическая заболеваемость геморрагической инфекции свидетельствует наличии актуальной проблемы в области эпидемиологии и разработки новых алгоритмов противоэпидемиологических и профилактических мероприятий за переносчиками трансмиссивной инфекции для прогнозирования эпидемиологической ситуации.
Ключевые слова: ККГЛ (Конго-Крымская геморрагическая лихорадка), переносчики - иксодовые кле-щи, природные очаги, спорадическая заболеваемость, вирус ККГЛ, профилактика.
Nyshanov N.S., Kuzmina A.R., Orynkozha A. O.
Department of Sanitary and Epidemiological Control of Turkestan region, Turkestan, Kazakhstan
EPIDEMIOLOGICAL SURVEILLANCE OF THE INCIDENCE OF CCGL IN THE TURKESTAN REGION OF THE TURKESTAN REGION OF THE REPUBLIC OF KAZAKHSTAN FOR THE PERIOD 2006-2018
A comparative retrospective epidemiological analysis was conducted to study the causes of the occurrence and spread of a particularly dangerous viral infection. The sporadic incidence of hemorrhagic infection indicates the presence of an urgent problem in the field of epidemiology and the development of new algorithms for anti-epidemic and preventive measures for vector-borne infection vectors to predict the epidemiological situation.
Keywords: CCGL (Congo-Crimean hemorrhagic fever), vectors-ixode mites, natural foci, sporadic incidence, virus, prevention.
