CC BY
19
УДК 579.62 DOI 10.18286/1816-4501-2019-2-140-146
разработка систем Пцр-дЕтЕкции бактериофагов PROTEUS PHAGE (PR 4 - УГСХА), ENTEROBACTER PHAGE (E7) И YERSINIA PHAGE (YE3-F2)
Сульдина Екатерина Владимировна, ассистент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Мастиленко Андрей Владимирович, кандидат биологических наук, доцент «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза» ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; 8(8422)55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru
Ключевые слова: бактериофаг, Proteus phage, Enterobacter phage, Yersinia phage, ПЦР, детекция, система, праймеры, филогенетическое дерево
В статье представлены результаты исследований по разработке системы ПЦР-детекции бактериофагов Proteus phage (PR 4 - УГСХА), Enterobacter phage (E7) и Yersinia phage (Ye3-F2). Построено филогенетическое дерево соответствия их генетической организации между собой и установлено, что соответствие между геномами Proteus phage (Pr 4 - УГСХА), Enterobacter phage (E7) и Yersinia phage (Ye3-f2) составляет от 24 до 31%. Определено, что специфичный фрагмент для Proteus phage (Pr 4 - УГСХА) расположен в области генома 3700-4500 п.н. Высокоспецифичных фрагментов, характерных только Enterobacter phage E7 и Yersinia phage Ye3-f2 в исследуемых геномах не было выявлено, однако были обнаружены области, при совместном использовании ПЦР для которых, позволит детектировать только геном данной группы. Установлены две области, одновременное выявление которых характерно для Enterobacter phage и для Yersinia phage. В системе BLAST были определены системы праймеров для одновременного выявления фрагментов генома, характерных для группы изучаемых бактериофагов. В результате проведенных исследований были разработаны системы праймеров для ПЦР типирования бактериофагов Protes, Enterobacter и Yersinia групп, позволяющие проводить индикацию бактериофагов, относящихся к определенным группам в материале, полученном из объектов окружающей среды и патологического материала без выделения чистой культуры при скринигах указанных групп при детекции фрагмента генома размером 125 п.н. в области 3700-4500 п.н. ДНК Proteus phage (Pr 4 - УГСХА); размерами 294 и 431 п.н. в областях 17500-18000 и 26500-27500 п.н. соответственно ДНК Enterobacter phage (E7) и размерами 226 и 85 п.н. в областях 2000-2500 и 24100-24300 п.н. соответственно Yersinia phage (Ye3-f2).
Исследования проводятся при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект «Геномика и биология кандидатных бактериофагов для терапии энтеробактери-альных инфекций в ветеринарной медицине» №16-44-732038.
Введение
Вирусы бактерий, количество которых намного превышает общее количество бактерий, могут стать отличным специфичным инструментом в борьбе против бактериальных инфекций, так как при этом ни один из них не вреден для здорового
и
Sä es »1
s«
р Ü ш и '«! ■ i
00 s!
человека. Большое количество этих вирусов находится в природе - в почве, в воде, в кишечнике и тех же местах, где есть бактерии [1]. Известно, что при воздействии на лизогенные бактериальные культуры индуцирующим фактором (например, митомицином С и УФО) продукция фага в значи-
тельной степени возрастает, поэтому, применяя данную методику, удается выявить бактериофаг в значительно большем проценте случаев, чем при изучении только спонтанной его продукции [2-4].
В специальной литературе описывается ряд методов выделения бактериофагов из объектов окружающей среды и т.п.: прямой метод выделения из исследуемого материала, выделение методом обогащения «без подсева» и «с подсевом», обнаружение на плотных питательных средах методом Отто и двуслойным методом по Грациа [5-7]. Это длительные и материалоемкие исследования, требующие высокой квалификации, завершение которых не гарантирует получение положительного результата [8]. Поэтому разработка метода, позволяющего на начальном этапе получить исследователю достоверную информацию о наличии или об отсутствии в анализируемом объекте искомого бактериофага - это актуальная задача, позволяющая расширить коллекцию фагов за счет сокращения времени работы с одной пробой при выделении и возможности анализа нескольких проб одновременно при экономии материалов и сокращении трудозатрат.
Цель работы - разработать систему ПЦР-детекции бактериофагов Proteus phage (PR 4 -УГСХА), Enterobacter phage (E7) и Yersinia phage (Ye3-F2).
Объекты и методы исследований
Объекты исследований - вирулентный бактериофаг Ye3-f2, характеризующийся следующими свойствами: бляшкообразующие единицы - прозрачные, без зоны неполного лизиса, 1,0±1,5 см; ли-тическая активность - титр по Грация - 1,5±0,1х1010 БОЕ/мл, титр по Аппельману - 10-6; специфичен для культур, идентифицированных как Yersinia enterocolitica; культивирование при температуре 580 С в 30 минут приводит к инактивации [9].
В исследованиях использовали бактериофаг Е7, имеющий следующие характеристики: бляшкообразующие единицы - прозрачные округлой формы, 3,5±0,5 мм; литическая активность - титр по Грация- 2,0±0,2х1010 БОЕ/мл, титр по Аппельману - 10-9; специфичен для культур, идентифицированных как Enterobacter spp.; культивирование при температуре 650 С в 30 минут приводит к инактивации [10].
Бактериофаг Pr - 6 УГСХА выделен в 2017 году из объектов внешней среды - диаметр бляш-кообразующих единиц - 0,5±0,1 мм, титр по Грация - 1,3±0,2х109 БОЕ/мл, титр по Аппельману - 10-8, устойчив у воздействию трихлорметана в течение 15 минут и специфичен для культур Proteus mirabilis и Proteus vulgaris [11].
Материалы: 5-кратный раствор c ксиленциа-нолом, 7,5 мМMgG2 (ООО «Интерлабсервис» Кат. № 861), смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфа-
тов (дНТФ). Водный раствор дезокси-нуклеозид-трифосфатов с конценртацией 1,76 мМ каждого. (ООО «Интерлабсервис», Кат. № R3-1), смесь ти-поспецифических праймеров по 10 пкМ каждого (НПФ «Литех», Москва); Taq ДНК-полимераза (5 ед./мкл) (Promega, USA., Cat. №М5001), агароза («Хеликон» LOT 2308В504) или аналогичная, Трис-HCl, («Amresco» Cat. № Am-0234-0.5) или аналогичный, тритон Х-100, («Amresco» Cat. № Am-O694-1.0) или аналогичный, борная кислота Хеликон (KaT № H-0202-0.5, (о.с.ч.), ^ATA-Na,(«Amresco » Cat. № Am-0105-0.1) или аналогичный, NaCl («Хеликон» H-1401-1.0 (х.ч.), 0,1 %-ный бромид этидия («Amresco », Cat.№ Am-0492-1,0), маркер молекулярного веса, (ООО «Интерлабсервис», Кат.№ MDNA-100bp), набор для очистки ДНК от агароз-ного геля «QIAquick Gel Extraction», QIAGEN, Германия), набор для секвенирования, набор для выделения ДНК «АмплиПрайм ДНК-сорб-В», («Интер-ЛабСервис», Москва), микроцентрифуга на 12000 об./мин. для пробирок объемом 1,5 мл и 0,5 мл (EppendorfMinispin, Германия), автоматические пи-петочные дозаторы на 20 мкл, 100 мкл и 1000 мкл (ThermoScientific), полипропиленовые пробирки на 0,2 мл, 0,5 мл и 1,5 мл (Axygen, США), сменные наконечники к автоматическим пипеточным дозаторам (Axygen, США), амплификатор для проведения ПЦР («MaxyGene», AXYGEN Scientific, США), смеситель «Vortex» (Biosan, Латвия), твердотельный термостат (Термит, ДНК Технология, Москва), фильтрующие насадки Миллекс 0,22мкм (PVDF) (Millipore, Ирландия), генетический анализатор («Applied Biosystems 3130XL», Applied Biosystems, ^А), набор компонентов для очистки сиквенсовой смеси («BigDye Terminator kit 3.1», Applied Biosystem, СШA). Праймеры (F1__C2, F2__C2, F3__C2, F3__C2,
R1_C2, R2_C2, R3_C2, F1__B, R1__B, F1_PODO,
R1_PODO, terS-F, terS-R, mcp-F, mcp-R, mtp-F, mtp-R, tmp-F, tmp-R) были синтезированы в ООО «ЛИТЕХ». Реактивы производства «Fermentas» и «Альфа фермент».
Для постановки ПЦР «в режиме реального времени» кроме праймеров требуется флуоресцентный олигонуклеотидный зонд, несущий флуоресцентную метку. В системе Blast был осуществлен подбор наиболее оптимальных зондов для каждого из бактериофагов и определены их основные характеристики. Далее были проведены эксперименты с использованием ПЦР и специального оборудования - амплификатора с детекцией RealTime (в данном проекте ДТ-прайм-5 (ДТ-96), ДНК-Технология, РФ). ДНК денатурировали при 95 °С в течение 1 мин. Затем проводили 35 циклов, включающих денатурацию ДНК при 95 °С в течение 10 сек, отжиг праймеров при температуре 60 °С в течение 20 сек. Детекция осуществлялась на каждом
i 1
SEIS es »1
Si
р и ш i I H ■ i
са s!
Таблица 1
Соответствие геномов Proteus phage (Pr 4 - УГСХА), Enterobacter phage (E7) и Yersinia phage (Ye3-f2)
Yersima_phage Proteus_phage Enterobacter_phage
Yersmia_phage 39210 12274 10032
Proteus_phage 12274 44580 10596
Enterobacter_phage 10032 10596 36030
Таблица 2
Относительное соответствие геномов Proteus phage (Pr 4 - УГСХА), Enterobacter phage (E7) и Yersinia phage (Ye3-f2)
Рис. 1 - Филогенетичсекое дерево соответствия генетической организации Proteus phage (Pr 4 - УГСХА), Enterobacter phage (E7) и Yersinia phage (Ye3-f2)
Yersinia_phage Proteus_phage Enterobacter_phage
Yerstma_phage 100% 31% 26%
Proteus_phage 28% 100% 24%
Enterob acter_phage 28% 29% 100%
U
3Enterobactetia phage K1-5. complété génome
-^E sellerie lu a virus VEc3. complété getiome
Eschcrichù viras AAPEcG. complété getiome
^ a Eschenchia virus KIE. complété genome «Eiiterobactena pliage klE. complété eenome
Eschenchia phage vBEeoPR, complété genome EscHcrtclua pliage vB EcoP B complété genome ^Eschericlna pliage vBEcoPC. complété genome
Enterobacteri» pliage v8JEcoP_ACG-C91. complété génome Eschenchia vims tmitPK 1A2. complété génome Eschericliiït pliage I I U. compleie getionte ■Citrobacter pliage vBCtoPCtRpV cotitpleie génome —»Enterobactena pliage SP6. complété eenome •Salawiiella pliage BP12B complété génome
JE' f
r-e "Est
IL 0[
10.07
г—e Proteus pliage PM 93. complete genome Q— ^Proteus phage vB_PuiiP_Pni5460, complete genome 1 ^Proteus phage PM 8?. complete geironte
—j <*Pioieiis phage
• Proteus phage PM 116. complete genome Рис. 2 - Филогенетическое дерево соответствия ДНК Proteus phage (Pr 4 - УГСХА) возможным
аналогиям
из циклов при температуре 60 °С по каналу Fam.
Сравнение собранных геномов бактериофагов с геномами известных аннотированных бактериофагов проводили при помощи алгоритма blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и баз данных нуклеотидных последовательностей NCBI (Национальный центр биотехнологической информации, США). Визуализацию выравнивания собранных нами геномов с известными мы проводили с использованием программного обеспечения BLAST RinglmageGenerator (BRIG).
Результаты исследований
Для целей возможной типизации выделен-
ных бактериофагов по группам нами было построено филогенетическое дерево соответствия их генетической организации между собой (рис. 1, табл. 1-2).
Поскольку соответствие между геномами Proteusphage (Pr 4 - УГСХА), Enterobacter phage (E7) и Yersinia phage (Ye3-f2) составляет от 24 до 31%, организация их в общую группу не представляется целесообразной. Исходя из этого, нами были разработаны системы для ПЦР-типирования групп бактериофагов в соответствии с их филогенетическим родством.
На основании сиквенсовых данных [8] были
11
SES es »1
Si
P ü Ш Sä ni H ■ i
CS s!
phjpc СЮС Я0001. cnupklc fClURK
Я'. pir-ui¿xiMit?
-Sibnunelb :1ц.: яд 4767, aMiotee inn к
1 EidKItlü ¡iii..' II7.KS .Ufr ['ilc : м I. п,
lanebiitriijiu^cTI.wciifil.'kdrujitiLi ^ Вк>.'|»р1е< T.i <«npkie paflfw. vrjiii Luii < kjrv-iiS.Vi u phi pj T7M, owipk?« /акис
^Iftliriijph^c ll]|B4-S)C,i»mp)CfCiOi««:
"'EtdieWiil filljC IX- nirrpldf yrlk4th!
—»S*wdi ph>jt3№(tf2 («иЫНорсйилг
*GlrutUr'krpliifc pliCFP-1, tt^tplcfc {кшотк
Enkiutuite I :m;LL [ehj.-JC
J ClM'-j.ln SH2, '.utrpku ftilMTK • BCIkkIIM ¡riu£« БСД-. олпрлл* ¿«май
^ЫклЛчскг ^up: E-3,«oifMH рею« 41-rnüWHCICr phijf [¡4,11-iWplHf /ffk<№
рис. 3 - Филогенетическое дерево соответствия днк Enterobacter phage E7 возможным аналогиям
^ л Lscherictiu plmge LjG I. contplele ^eiiuiue
i Escherichia pluge HZ2RS. oompfcie gtaome
Enterobacter« phage vB HcoP 1МЕЭ90. eompleie genonie —* F-vdicrkhiu pfuige Г1ГГ ftOOÜl. c«nplne genome
- EMcrobacteria phage ! ia. conpicle genome "* Yersinia pluue YpsP-G, h.hii|i1lle sequence , Я Yersinia pliaee Y, coiupiele genome
- .yi Yersinia pcui* phage phiA] 122. outiijtfcte genome
'-9 Yerania phage R. complete genome
Ye г и пи pluge YpP-R, complete «equettee
MiHlter sequences л kl miusc* | 8 leaves Synthetic plu).4> clone NRG П. complete usque nee ^ vinlMs | 2 leaves Escherichia phage WW_«cl. complete рякчие rkhüi pjucc N1.1. vrawletc genome Escherichia phage N.*i>, compacte genome
f.
4 Lschctk. hu plu ge CS, cxitapJelc peiknue
^^irmes ¡2 leav«. ;; Enterobacter« phage TV complete genome Efiteu&uclc i ia phage Э/7, partial genome
ßacleriopiiage "П complete ccnoine. strain Luiia •Enterohioeiui jiIuikc 'Г7М. complete genome Barte riopluge T3 ^cne I lu ;mc 11 «Cfcrotorier phigepliiCFP-l, complete g«u«ne
-d Setraii» phage 2050112. complete genome
^Ciltolucler plu je 5112. complete »c гимне
Lodertia ptiave 101ЫКП. сompleIc genome - LiXlcrciajiiiJiic 101fr4-J()2. cuinplele scnonie
eC?tliohatIer phage SHI. cotiipleie genome ■ FiHernbiiciei phage E-3. annplete genome ■» Seiuiia ph.ij.-e SM9-3Y. k<vi>plcie gefMme ■»Sjlnn4ic!Upluj:t pluSG-JL2. complole getiome
' Ye гмilia phage \ В YeliP .-\rS. umtplete getiunke
4Iii«ctiibaacr plLiiee coiitplctc genoiite hnlertihaclei [4iaj!e li-4. umipldt getn>me
J Ewheix hu phage 1.1.2.complete genome » F.4cheiK hia ]>hage ЕСЛ2. complete genome л Пл icfui|Jmj!e |4iiYcO!t 12 umtplele genome
fYeninia phase Yersinia phage phi Ye-1 10, complete gatonte
рис. 4 - Филогенетическое дерево соответствия днк Yersinia phage Ye3-f2 возможным аналогиям
построены филогенетические деревья соответствия ДНК Proteus phage (Pr 4 - УГСХА), Enterobacter phage (E7), Yersinia phage Ye3-f2 возможным аналогиям (рис. 2-4).
Затем были определены фрагменты для разработки системы праймеров для целей генетической идентификации и определения типовой принадлежности к группе бактериофагов, активных в
отношении Proteus spp., Enterobacter spp. и Yersinia enterocolitica. Установлено, что специфичный фрагмент для Proteus phage (Pr 4 - УГСХА) расположен в области генома 3700-4500 п.н.
При использовании системы BLAST были определены несколько пар праймеров (рис. 5 - 6).
После синтеза праймеров были проведены эксперименты (рис. 7) по индикации определяе-
и
Sä es »1
Si
р и ш и si н ■ i
00 и
Рис. 5 - Системы праймеров на последовательности ДНК Proteus phage Pr 4 - УГСХА
мых фрагментов генома Proteus phage Pr 4 - УГСХА, позволяющие проводить скрининг наличия бактериофага непосредственно в материале без этапов выделения и очистки.
Высокоспецифичных фрагментов, характерных только Enterobacter phage E7 и Yersinia phage Ye3-f2 в исследуемых геномах не было выявлено, однако были обнаружены области, позволяющие в совокупности детектировать геном данной группы. Так, фаги, аналогичные Enterobacter phage, можно обнаружить при одновременном выявлении двух областей 17500-18000 п.н. и 26500-27500 п.н., характерных только для них, а одновременное выявление двух области 2000-2500 п.н. и 24100-24300 п.н., характерно только для Yersinia phage.
В системе BLAST были определены 2 системы праймеров для одновременного выявления фрагментов генома, характерных для группы бактериофагов, активных в отношении Enterobacter и 2 системы праймеров - для бактериофагов, специфичных для бактерий Yersinia enterocolitica.
Далее были проведены эксперименты (рис. 8) по индикации определяемых фрагментов генома Enterobacter phage E7 и Yersinia phage Ye3-f2 (рис. 9) (обязательное наличие фрагментов, фланкируемых двумя системами праймеров), которые позволяют осуществлять анализ исследуемого материала на наличие бактериофага без этапов выде-
ления и очистки. Выводы
В результате проведенных исследований были разработаны системы праймеров для ПЦР ти-пирования бактериофагов Protes, Enterobacter и Yersinia групп, которые позволяют определять наличие бактериофагов, относящихся к определенным группам в материале, полученном из объектов окружающей среды и патологического материала без выделения чистой культуры.
Данная характеристика, наряду с высокой специфичностью, характерной для всех типов мо-лекулярно-генетических исследований [12-15], позволяет использовать эти системы при скрини-гах бактериофагов указанных групп при детекции фрагмента генома размером 125 п.н. в области 3700-4500 п.н. ДНК Proteus phage (Pr 4 - УГСХА); размерами 294 и 431 п.н. в областях 17500-18000 и 26500-27500 п.н. соответственно ДНК Enterobacter phage (E7) и размерами 226 и 85 п.н. в областях 2000-2500 и 24100-24300 п.н. соответственно Yersinia phage (Ye3-f2).
Библиографический список
1.Dublanchet, A. The epic of phage therapy / A. Dublanchet, S. Bourne // Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. - 2007. - V.18, No.1. - P.15-18.
2. Выделение бактериофагов, специфичных к Bacillus anthracis [Электронный ресурс] / Е.И. Кли-мушкин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // БиоКиров-2015: сборник материалов III Международного форума. - 2015. - С. 10-12.
3. Золотухин, Сергей Николаевич. Создание и разработка схем применения диагностиче-
Рис. 6 - Дизайн праймеров на последовательности ДНК Proteus phage Pr 4 - УГСХА
И Is
и
iE Si
ge
и 'SS
ш §1 II
Он gi
Качественный анализ
Зависимость флуоресценции канала FAM от номера
Номер лунки Идентификатор пробирки ОаЕшл Результат
А1 0бразец_1 13,4 +
А2 Образец_2 13,9 +
A3 Образец_3 16,8 +
В2 Образец_4 -I
D7 D8 Образец_5 К- -
Рис. 7 - График амплификации специфических фрагментов при идентификации ДНК Proteus phage: образец 1 -Pr 4 - УГСХА, образец 2 - Pr 6 - УГСХА, образец 3 - Pr 7 - УГСХА
И 16 21 25 Номер цикла
Зависимость флуоресценции канала FAM от номера
Рис. 8 - График амплификации специфических фрагментов при идентификации ДНК Enterobacter phage в областях 17500-18000 п.н. и 26500-27500 п.н.: образец 1 - E3, образец 2 - E4, образец 3 - E6, образец 4 - E7
11 16 21 Номер цикла
Зависимость флуоресценции канала FAM от номера
500
. 400
£300
L 200
100-
Рис. 9 - График амплификации специфических фрагментов при идентификации ДНК Yersinia phage в областях 2000-2500 п.н. и 24100-24300 п.н.: образец 1 - Ye3-f2, образец 2 - Ye2-f3, образец 3 - Ye1-f4, образец 4 - Ye2-f5
-
щ
!
16 21 Номер цикла
ских биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: автореф. дисс. ... д-ра биологических наук: 03.00.23 / С.Н. Золотухин. - Ульяновск, 2007. - 39 с.
4. Нифонтова, В.В. Получение бактериофагов и их применение в ветеринарии // В.В. Нифонтова, О.Е. Чугунова // Вестник Пермского научного центра. - 2015. - № 2. - С. 54-59.
5. Bacteriophages. Methods and Protocols, / Martha R.J. Clokie, A. M. Kropinski, R. Lavigne // Humana Press. - 2018. - Vol. 3. - 311 p.
6. Aleshkin, A.V. Вacteriophages in therapy and prevention of acute intestinal infections in children / A.V. Aleshkin, M.V. Zeigarnik, S.S. Bochkareva // Вопро-
сы практической педиатрии. - 2016. - Том 11, № 1. - С. 52-56.
7. Kutter, E. Bacteriophages: biology and applications / Е. Kutter, А. Sulakvelidze. - Boca Raton: CRC Press, 2005. - 510 p.
8. Геномика и биология кандидатных бактериофагов для терапии энтеробактериальных инфекций в сельскохозяйственной ветеринарии [Электронный ресурс]: научная монография / Д. А. Васильев [и др.]. - Ульяновск: УлГАУ, 2019. - 1294 с.
9. Бактериофаги бактерий Enterobacter и их основные биологические свойства / Е.В. Сульди-на, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, И.И. Богданов // Вестник Ульяновской государственной сельскохо-
зяйственной академии. - 2017. - № 4 (40). - С. 9498.
10. Сульдина, Е.В. Выделение бактерий и бактериофагов Yersinia enterocolitica / Е.В. Сульдина, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2017. - № 3 (39). - С. 50-55.
11. Феоктистова, Н.А. Протейные бактериофаги: изучение некоторых биологических свойств / Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2017 - № 4(40). - С. 75-80.
12. Генетическая характеристика и спектр антибактериальной активности бактериофагов, входящих в состав промышленных серий лекарственного препарата пиобактериофаг поливалентный очищенный / Н.В. Тикунова, Н.Н. Ворошилова, О.А. Полыгач, В.В. Морозова, А.Ю. Тикунов, А.М.
Курильщиков, В.В. Власов // Эпидемиология и вак-цинопрофилактика. - 2016. - Том 15, № 2 (87). - С. 93-100.
13. Мирошников, Константин Анатольевич. Геномика и протеомика литических бактериофагов Pseudomonas aeruginosa: автореф. дис. ... д-ра химических наук: 03.01.04, 03.01.06 / К.А Мирошников. - Москва, 2013. - 169с.
14. Вакарина, А.А. Бактериофаги. Современные аспекты их применения / А.А. Вакарина, Л.В. Катаева // Важнейшие вопросы инфекционных и паразитарных болезней: сборник научных работ. -Ижевск, 2016. - С. 28-35.
15. Conrotto, P. Proteomic approaches in biological and medical sciences: principles and applications / Р. Conrotto, S. Souchelnytskyi // Exp. Oncol. - 2008. - Vol. 30, № 3. - P. 171-180.
DEVELOPMENT OF PCR-DETECTION SYSTEMS OF BACTERIOFAGES OF PROTEUS PHAGE (PR 4 - UGSKHA), ENTEROBACTER PHAGE (E7) AND YERSINIA PHAGE (YE3-F2)
Suldina E.V., Feoktistova N.A., Vasiliev D.A., Mastilenko A.V. FSBEI HE Ulyanovsk SAU 432017, Ulyanovsk, Novyi Venets Boulevard, 1; 8 (8422) 55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru
Key words: bacteriophage, Proteus phage, Enterobacter phage, Yersinia phage, PCR, detection, system, primers, phylogenetic tree
The article presents results of studies on development of PCR detection system of such bacteriophages as Proteus phage (PR 4 - UGSKhA), Enterobacter phage (E7) and Yersinia phage (Ye3-F2). A phylogenetic tree was constructed to match their genetic organization with each other, and it was found that the correspondence between the genomes of Proteus phage (Pr 4 - UGSKhA), Enterobacter phage (e7) and Yersinia phage (Ye3-f2) is from 24 to 31%. It was determined that the specific fragment for Proteus phage (Pr 4 - UGSKhA) is located in the genome region of 3700-4500 bp. Highly specific fragments, characteristic only for Enterobacter phage E7 and Yersinia phage Ye3-f2, were not found in the studied genomes, however, areas were found that would allow only the genome of this group to be detected when PCR was used. Two areas were established, the simultaneous detection of which is characteristicfor Enterobacter phage and for Yersinia phage. Primer systems were identified in the BLAST system for simultaneous detection of fragments of the genome characteristic of the group of bacteriophages studied. As a result of the studies, primer systems were developed for PCR typing of bacteriophages of the Proteus, Enterobacter and Yersinia groups, allowing to indicate bacteriophages belonging to certain groups in material obtained from environmental objects and pathological material without isolating pure culture in when screening the indicated groups in case of detection of a genome fragment of 125 bp in the range of3700-4500 bp of DNA Proteus phage (Pr 4 - UGSKhA); sizes of294 and 431 bp in the range of 17500-18000 and 26500-27500 bp respectively, Enterobacter phage DNA (E7) and sizes of226 and 85 bp. in the range of 2000-2500 and 24,100-24300 bp - Yersinia phage (Ye3-f2), respectively.
Bibliography
1. Dublanchet, A. The epic of phage therapy/A. Dublanchet, S. Bourne // Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. - 2007. - V.18, No.1. - P.15-18.
2. Isolation of bacteriophages specific for Bacillus anthracis [Electronic resource] / E.I. Klimushkin, N.A. Feoktistova, D.A. Vasiliev [et al.] // BioKirov-2015: a collection of materials of the III International forum. - 2015. - P. 10-12.
3. Zolotukhin, Sergey Nikolaevich. Creation and development of schemes for use of diagnostic biological products based on isolated and studied bacteriophages of enterobacteria: author's abstract of dissertation of Doctor of Biological Sciences: 03.00.23 /S.N. Zolotukhin. - Ulyanovsk, 2007. - 39 p.
4. Nifontova, V.V. Obtaining bacteriophages and their use in veterinary medicine //V.V. Nifontova, O.E. Chugunova //Vestnik of Perm Scientific Center. - 2015. - № 2. - P. 54-59.
5. Bacteriophages. Methods and Protocols, /Martha R.J. Clokie, A. M. Kropinski, R. Lavigne//Humana Press. - 2018. - Vol. 3. - 311 p.
6. Aleshkin, A.V. Bacteriophages in therapy and prevention of acute intestinal infections in children/A.V. Aleshkin, M.V. Zeigarnik, S.S. Bochkareva // Вопросы практической педиатрии. - 2016. - Том 11, № 1. - С. 52-56.
7. Kutter, E. Bacteriophages: biology and applications /Е. Kutter, A. Sulakvelidze. - Boca Raton: CRC Press, 2005. - 510 p.
8. Genomics and biology of candidate bacteriophages for treatment of enterobacterial infections in agricultural veterinary medicine: monograph / D.A. Vasiliev [et al.]. - Ulyanovsk: UlSAU, 2019. -1294 p.
9. Bacteriophages of Enterobacter bacteria and their basic biological properties / E.V. Suldina, D.A. Vasiliev, S.N. Zolotukhin, I.I. Bogdanov // Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. - 2017. - № 4 (40). - P. 94-98.
10. Suldina, E.V. Isolation of bacteria and bacteriophages of Yersinia enterocolitica / E.V. Suldina, D.A. Vasiliev, S.N. Zolotukhin // Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. - 2017. - № 3 (39). - P. 50-55.
11. Feoktistova, N.A. Protein bacteriophages: the study of some biological properties / N.A. Feoktistova, D.A. Vasiliev, S.N. Zolotukhin //Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. - 2017 - № 4 (40). - P. 75-80.
12. Genetic characteristics and spectrum ofantibacterial activity of bacteriophages included in the industrial series of the medication, named polyobacteriophage polyvalent purified / N.V. Tikunova, N.N. Voroshilova, O.A. Polygach, V.V. Morozova, A.Yu. Tikunov, A.M. Kurilshchikov, V.V. Vlasov// Epidemiology and vaccine prevention. - 2016. - Vol. 15, No. 2 (87). - P. 93-100.
13. Miroshnikov, Konstantin Anatolyevich. Genomics and proteomics of the lytic Pseudomonas aeruginosa bacteriophages: author's abstract dissertation of Doctor of Chemical Sciences: 03.01.04,01.03.06/ K.A. Miroshnikov. - M., 2013. - 52 p.
14. Vakarina, A.A. Bacteriophages. Modern aspects of their application / A.A. Vakarina, L.V. Kataeva // Major issues of infectious and parasitic diseases: Collection of scientific works. - Izhevsk, 2016. - P. 28-35.
15. Conrotto, P. Proteomic approaches in biological and medical sciences: principles of applications / R. Conrotto, S. Souchelnytskyi // Exp. Oncol. - 2008. - Vol. 30, No. 3. - P. 171-180.
