CC BY
14
DOI: https://doi.org/10.17650/1726-9784-2021-20-3-47-56
Разработка полимерных микрочастиц с радахлорином и оценка перспектив их использования в фотодинамической терапии
А.М. Мирошкина1, С.П. Кречетов2, Н.Л. Соловьева1, И.И. Краснюк1
ФГАОУВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет); Россия, 119991 Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 2;
ФГАОУ ВО «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»; Россия, 141701 Долгопрудный, Институтский пер., 9
Контакты: Анастасия Максимовна Мирошкина asyamir@mail.ru
Введение. Сегодня активно ведутся разработки по получению систем доставки на основе микро- и наночастиц для повышения избирательности и эффективности действия фотосенсибилизаторов при фотодинамической терапии. Такие частицы позволяют повысить эффективность уже использующихся химиотерапевтических препаратов за счет их накопления в опухоли, а также способствуют преодолению лекарственной устойчивости опухолевых клеток.
Цель исследования - получение микрочастиц на основе биосовместимого блок-сополимера молочной и гли-колевой кислот с включением фотосенсибилизатора радахлорина, магнитных наночастиц и перфтордекалина и последующая оценка их использования в качестве терапевтических агентов для фотодинамической терапии. Материалы и методы. Микрочастицы были получены с помощью метода двойной эмульсии, описаны с помощью электронной микроскопии. Оценка фотодинамических свойств таких микрочастиц была проведена с помощью спектрофотомерии и МТТ-теста на культуре клеток.
Результаты. Получены микрочастицы сферической формы размером менее 1 мкм. Высвобождение действующего вещества из микрочастиц происходило постепенно, в течение 2 нед, а в микрочастицах с магнитными наночастицами концентрация радахлорина оставалась практически неизменной в течение месяца. Воздействие на микрочастицы светом красного светодиода сопровождалось образованием синглетного кислорода. Электронная микроскопия показала внутриклеточное положение микрочастиц в опухолевых клетках. МТТ-тест выявил значительное угнетение жизнеспособности клеток в присутствии микрочастиц.
Заключение. Результаты исследования позволяют рассматривать полученные биосовместимые полимерные микрочастицы с включением в них радахлорина в качестве депо радахлорина для местного применения при фотодинамической терапии опухолей.
Ключевые слова: микрочастицы, радахлорин, перфтордекалин, магнитные наночастицы, фотодинамическая терапия
Для цитирования: Мирошкина А.М., Кречетов С.П., Соловьева Н.Л., Краснюк И.И. Разработка полимерных микрочастиц с радахлорином и оценка перспектив их использования в фотодинамической терапии. Российский биотерапевтический журнал 2021;20(3):47-56. DOI: 10.17650/1726-9784-2021-20-3-47-56.
Development of polymeric microparticles with radachlorine and estimation of the prospects of their use in photodynamic therapy
Anastasia M. Miroshkina1, Sergey P. Krechetov2, Natalia L. Solovieva1, Ivan I. Krasnyuk1
1I.M. SechenovFirst Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia (Sechenov University); Bld. 2, 8 Trubetskaya St., Moscow 119991, Russia;
2Moscow Institute of Physics and Technology (NationalResearch University); 9Institutskiy per., Dolgoprudniy 141701, Russia Contacts: Anastasia Maximovna Miroshkina asyamir@mail.ru
Introduction. Nowadays, the development of delivery systems based on micro- and nanoparticles is being actively pursued to increase the selectivity and efficiency of photosensitizers in photodynamic therapy. Such microparticles
could increase the effectiveness of the already used chemotherapeutic drugs due to their accumulation in the tumor and help to overcome the drug resistance of tumor cells.
The aim of this research was to obtain microparticles based on a biocompatible block copolymer of lactic and gly-colic acids with the inclusion of the photosensitizer radachlorin, magnetic nanoparticles, and perfluorodecalin and their subsequent evaluation as therapeutic agents for photodynamic therapy.
Materials and methods. Microparticles were obtained using the double emulsion method, described using of electron microscopy. Evaluation of their photodynamic properties was carried out using spectrophotometry and MTT-test on cell culture.
Results. Spherical microparticles with a size of less than 1 |jm were obtained. The release of the active substance from microparticles occurred gradually over two weeks, and in the case of the presence of magnetic nanoparticles, the concentration of radachlorin remained practically unchanged for a month. Exposure of microparticles to the light of LED is accompanied by the formation of singlet oxygen. Electron microscopy indicated intracellular position of microparticles in tumor cells. The MTT test revealed a significant inhibition of cell viability in the presence of microparticles. Conclusion. The research results allow us to consider the obtained biocompatible polymer microparticles with the inclusion of radachlorin as a depot of radachlorin for local use in photodynamic therapy of tumors.
Key words: microparticles, radachlorin, perfluorodecalin, magnetic nanoparticles, photodynamic therapy
For citation: Miroshkina A.M., Krechetov S.P., Solovieva N.L., Krasnyuk I.I. Development of polymeric microparticles with radachlorine and estimation of the prospects of their use in photodynamic therapy. Rossiyskiy bioterapev-ticheskiy zurnal = Russian Journal of Biotherapy 2021;20(3):47-56. (In Russ.). DOI: 10.17650/1726-9784-2021-2 0-3-47-56.
Введение
Основным недостатком применения химиотерапии при лечении онкологических заболеваний является системное токсическое действие противоопухолевых препаратов [1]. Использование фотодинамической терапии (ФДТ) в клинической практике характеризуется высоким процентом положительных результатов в лечении опухолей на ранних стадиях [2] и относительно меньшим количеством побочных эффектов по сравнению с химиотерапией [3]. В основе метода ФДТ лежит способность предварительно введенных в организм фотоактивных веществ — фотосенсибилизаторов (ФС) — накапливаться в опухоли и под воздействием лазерного облучения с определенной длиной волны генерировать цитотоксичный синглетный кислород. Применение процедуры ФДТ уменьшает побочные системные эффекты даже при введении ФС в системный кровоток [4]. В сочетании с эндоскопией ФДТ используется для лечения опухолей желудочно-кишечного тракта, легких, мочеполовых путей, перитонеальной и плевральной полостей [5].
Радахлорин® (РХ) является ФС 2-го поколения, который используется для флуоресцентной диагностики и ФДТ злокачественных опухолей [6]. В качестве действующих веществ он содержит натриевые соли хлорина е6 (до 90 %), хлорина р6 (5—7 %) и пурпурина 5 (1—5 %). Привлекательность использования РХ обусловлена наличием у него выраженного максимума в красной области спектра поглощения (662 нм) и высоким квантовым выходом образования синглет-ного кислорода при поглощении света в этой области [7]. Высокая фототоксичность РХ [8], хорошая избирательность накопления препарата в опухоли и быстрое выведение его из организма обусловливают
отсутствие гиперфоточувствительности кожных покровов и малое количество побочных системных эффектов после ФДТ [8]. Эффективность ФДТ с использованием РХ показана для злокачественных новообразований кожи, легких, желудочно-кишечного тракта, мочеполовых путей [9, 10].
Системы доставки на основе микро- и наноча-стиц (МЧ и НЧ) позволяют повысить эффективность действия на опухоли уже использующихся при лечении рака химиотерапевтических препаратов [11, 12] путем увеличения местного воздействия на молекулярные мишени в результате накопления таких частиц в опухоли. Еще одним положительным моментом использования систем доставки на основе МЧ и НЧ является преодоление лекарственной устойчивости опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам в молекулярной форме [13].
Включение ФС в состав МЧ и НЧ позволяет повысить эффективность ФДТ не только с помощью описанных выше общих преимуществ использования МЧ и НЧ в качестве систем доставки [14]. Наличие у ФС собственной флуоресценции позволяет визуализировать частицы с этими веществами в тканях организма, что делает МЧ и НЧ с ФС пригодными для тераностики: диагностики, лечения и наблюдения за изменениями в опухоли в ходе лечения [15].
Использование биоразлагаемых полимеров в качестве основы для получения систем доставки стало возможным благодаря их способности образовывать стабильные МЧ и эффективному включению лекарственных веществ различной физико-химической природы в полимерную матрицу. Основными критериями выбора материала для каркаса МЧ являются биосовместимость с клетками, простота изготовления,
отсутствие токсичности и ответных воспалительных процессов, иммунологических и тромбогенных ответов [16].
Включение магнитных наночастиц (МНЧ) в полимерную матрицу МЧ и дальнейшее управление ими с помощью внешнего магнитного поля позволяют рассматривать подобные МЧ в качестве системы целевой доставки лекарственного препарата к соответствующему биологическому объекту [17]. Способность МНЧ поглощать внешнюю электромагнитную энергию и преобразовывать ее в тепло привлекательна для использования таких частиц в качестве гипертермических агентов, улучшающих эффективность лучевой и химиотерапии за счет ускорения процесса поражения и деструкции клеток опухоли [18]. Накопление МЧ, содержащих МНЧ, в пораженной области организма также способствует контрастированию картины, получаемой с помощью магнитно-резонансной томграфии [19].
Совместное включение РХ и МНЧ в полимерную матрицу МЧ рассматривается как перспективное направление повышения эффективности использования РХ для ФДТ и флуоресцентной диагностики. Создание таких частиц должно способствовать внутриклеточному накоплению и депонированию РХ, а также пролонгированию его действия. Это позволит еще больше локализовать действие ФС и увеличить продолжительность терапевтического окна для ФДТ.
Цель данного исследования — получение биосовместимых, биодеградируемых полимерных МЧ с включением РХ и МНЧ и оценка возможности использования таких частиц в качестве терапевтических агентов для ФДТ.
Материалы и методы
При изготовлении МЧ в качестве ФС использовали концентрат для приготовления раствора для ин-фузий «Радахлорин» («РАДА-ФАРМА», Россия), содержащий 3,5 мг/мл смеси натриевых солей хлорина е6, хлорина р6, пурпурина 5.
В работе были использованы: блок-сополимер 65:35 молочной и гликолевой кислот (СМГК) Resomer RG 653 H (Evonik Industries AG, Германия); лецитин Lipoid S 100 (Lipoid GmbH, Германия); перфторде-калин (ПФД), 1,3-дифенилбензофуран (ДФБФ), ди-метилсульфоксид (Sigma, США); поливиниловый спирт 18—88 (Merck, Германия); метилцеллюлоза A4M (Ashland, США). Хлористый метилен, ацетонитрил, а также реактивы, применявшиеся для приготовления буферных растворов, имели квалификацию «химически чистый» или «чистый для анализа» и были получены от «Химмед» (Россия). Суспензия стабилизированных олеиновой кислотой гидрофобных МНЧ в хлороформе (18,5 мг / мл) была предоставлена Е.Л. Колчиным (лаборатория нанобиотехнологий
МФТИ, Россия). В работе использовали деиони-ованную воду, полученную на установке обратного осмоса УВОИ 1812С6 («НПК Медиана-Фильтр», Россия).
Метод изготовления МЧ. Для приготовления МЧ по методу множественной дисперсии «твердое в масле в воде» (Т/М/В) лиофильно высушивали 30 мкл раствора для инфузий «Радахлорин». Затем лиофилизат диспергировали в растворе 2,5 % СМГК и 0,1 % лецитина в хлористом метилене. Полученную первичную дисперсию «твердое в масле» эмульгировали по каплям в 20 мл водного раствора 1 % поливинилового спирта и 0,5 % метилцеллюлозы при температуре 4 °С с использованием Ultra Turrax 25 (IKA, Германия). Готовую вторичную эмульсию Т/М/В смешивали с охлажденными до 4 °С 500 мл воды и выдерживали в течение 6 ч при комнатной температуре с перемешиванием при 300 мин-1 верхнеприводной мешалкой Eurostar 20 digital (IKA, Германия) с пропеллерным перемешивающим элементом до удаления дихлорметана и затвердевания МЧ. Созревшие МЧ осаждали центрифугированием при 2000 g. Суперна-тант сливали, а осадок промывали ресуспендирова-нием в 50 мл воды с последующим осаждением в указанных выше условиях. Отмытые МЧ замораживали при -25 °С и высушивали в течение 15 ч в лиофиль-ной сушилке VaCo 2 (ZIRBUS, Германия).
При включении в МЧ стабилизированных олеиновой кислотой МНЧ и ПФД на стадии получения первичной дисперсии «твердое в масле» в раствор СМГК и лецитина в хлористом метилене добавляли 55 мкл суспензии МНЧ и 20 мкл ПФД перед диспергированием лиофилизата РХ.
Растровая электронная микроскопия (РЭМ). Изображения получены с использованием микроскопа MAIA3 (TESCAN, Чехия). Образцы частиц для электронной микроскопии наносили на кремниевые подложки в виде суспензии в воде и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Изображения получали при ускоряющем напряжении 10 кВ.
Измерение размеров и дзета-потенциала МЧ. Размеры и дзета-потенциал МЧ измеряли в водной суспензии на анализаторе размеров частиц и дзета-потенциала Photocor Compact-Z («Фотокор», Россия).
Определение содержания РХ в МЧ. Для определения содержания РХ навеску МЧ растворяли в ацето-нитриле и измеряли оптическую плотность при длине волны 662 нм относительно ацетонитрила. Для калибровки использовали растворы РХ в ацетони-триле, получаемые разведением раствора для инфузий «Радахлорин». Содержание воды в калибровочных растворах было менее 0,05 % по объему. Измерения оптической плотности и снятие оптических спектров поглощения образцов проводили на спектрофотометре UV 3600 (Shimadzu, Япония).
50 Оригинальные статьи / Original reports
Высвобождение РХ из МЧ. Высвобождение РХ температуре 37 °С в увлажненной атмосфере с 5 % из МЧ исследовали в 50 мМ калий-фосфатном буфе- содержанием CO2. После 24 ч культивирования и фор-ре с pH 7,4. В 5 мл буфера в центрифужной пробирке мирования монослоя в одной трети лунок 1-го план-суспендировали 8—10 мг МЧ, разливали по 0,4 мл шета культуральную среду заменяли на свежую, в другой в пробирки Eppendorf 1,5 мл и инкубировали в тер- трети лунок — на раствор 1,75 мкг/мл РХ в культу-мостате при температуре 37 °С. Перед отбором проб ральной среде, и в остальных лунках — на суспензию для определения высвободившегося РХ суспензию 0,5 мг/мл различных видов МЧ в культуральной сре-перемешивали до однородности встряхиванием, а за- де. Через 24 ч во всех лунках культуральную среду тем осаждали МЧ центрифугированием при 10 000 g заменяли свежей и половину лунок каждого вида 10 мин. На каждый срок отбирали по 0,3 мл суперна- облучали 10 мин светом СИД LZ1 00R202 с облученно-танта. Отобранные пробы супернатанта хранили в за- стью на поверхности культуральной среды 100 мВт/см2. мороженном состоянии при —20 °С. По завершении Влияние МЧ и фотодинамического облучения на эксперимента все отобранные пробы размораживали клетки оценивали через 24 ч. Микрофотографирова-с последующим определением концентрации РХ ние клеток осуществляли на световом микроскопе по его флуоресценции с использованием планшетно- Axio Observer.A1 (Carl Zeiss, Германия), оборудован-го считывателя CLARIOstar (BMG LABTECH, Гер- ном осветителями HAL 100, HBO 100 и цифровой мания) в 96-луночных планшетах. Флуоресценция монохромной камерой Axiocam 503 mono, работа-возбуждалась на длине волны 401 нм, регистрирова- ющей под управлением программного обеспечения лась на длине волны от 660 нм. Для калибровки ис- ZEN 2. При микроскопии устанавливали блок свето-пользовали растворы РХ в 50 мМ калий-фосфатном фильтров 45 HQ TexasRed (EX BP 560/40, BS FT 585, буфере, получаемые разведением раствора для инфу- EM BP 630/75). зий «Радахлорин». Высвобождение РХ из МЧ срав- Оценка жизнеспособности клеток. Для оценки нивали с его разрушением при инкубации в тех же жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста во условиях. всех лунках культуральную среду заменяли на свежую, Генерация синглетного кислорода МЧ. Способ- содержащую 0,5 мг/мл МТТ, и инкубировали 0,5 ч ность РХ в составе МЧ к образованию синглетного в темноте при температуре 37 °С в атмосфере с 5 % СО2. кислорода оценивали при облучении светом све- После этого среду удаляли и содержимое лунок рас-тоизлучающего диода (СИД) LZ1 00R202 (OSRAM творяли в 1 мл диметилсульфоксида. Количество об-SYLVANIA LED Engin, США) с максимумом излуче- разовавшегося формазана характеризовали оптиче-ния 660 нм. 0,5 мг/мл МЧ в 50 мМ калий-фосфат- ской плотностью полученных растворов в лунках при ном буфере с pH 7,4 помещали в стандартную кювету 550 нм, измеренной с использованием планшетного спектрофотометра при температуре 25 °С. К полученной считывателя CLARIOstar. Жизнеспособность клеток суспензии добавляли 20 мкл 1 мМ раствора ДФБФ после воздействия МЧ и фотодинамического об-в этаноле, и кювету в заданное время облучали свер- лучения характеризовали отношением оптических ху светом СИД. До и после облучения измеряли оп- плотностей в лунках с клетками, подвергшимися воз-тическую плотность при 415 нм в полосе поглощения действию, и в лунках с контрольными клетками ДФБФ, превращающегося при взаимодействии с син- без каких-либо воздействий (100 % жизнеспособ-глетным кислородом в эндоперекись, не поглощающую ность). при этой длине волны. Убыль оптической плотности Статистическая обработка. Статистическую об-использовали в качестве характеристики интенсивно- работку экспериментальных данных проводили с ис-сти образования синглетного кислорода. Образование пользованием программы Microsoft Excel. Приводи-синглетного кислорода МЧ, содержащими РХ, срав- мые экспериментальные данные представляют собой нивали с образованием синглетного кислорода в рас- среднее значение ± стандартное отклонение по ре-творе РХ с концентрацией 8,75 мкг/мл. зультатам как минимум 3 независимых измерений. Исследование фотодинамического эффекта МЧ Достоверность различий оценивали по ^-критерию в культуре клеток. Клеточные культуры CHO (клетки Стьюдента. яичников сирийского хомячка) были получены из Российской коллекции клеточных культур позво- Результаты и обсуждение ночных (Институт цитологии РАН, Санкт-Петер- Полученные МЧ характеризуются субмикронным бург). При изучении влияния МЧ на клетки исполь- размером. Отрицательный заряд частиц обусловли-зовали 6-луночные планшеты. Высевали по 105 клеток вает наличие концевых карбоксильных групп у ис-в лунку в 2 мл среды DMEM 12, содержащей 10 % пользуемой для получения МЧ СМГК. Полученная эмбриональной телячьей сыворотки, 100 МЕ/мл пе- величина дзета-потенциала находится на уровне зна-нициллина, 0,1 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глю- чений, известных из литературы для немодифициро-тамина. Клетки культивировали в темноте при ванных частиц, что указывает на отсутствие заметного
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 3'2021 том 20 | vol. 20
Оригинальные статьи / Original reports 51
влияния РХ в составе МЧ на их заряд. На изображениях РЭМ видно, что полученные МЧ без МНЧ вне зависимости от присутствия ПФД — сферической формы (рис. 1). При наличии МНЧ в полимерной матрице МЧ имеют неправильную форму с выраженными складками. Данные изменения формы могут быть связаны с образованием 2 фаз — на поверхности МЧ и в ее ядре в начале созревания МЧ. Отсутствие растворимости СМГК в углеводородах [20] предполагает низкое сродство этого полимера к олеиновой кислоте, покрывающей МНЧ, что является предпосылкой для образования внутри созревающей МЧ гидрофобной фазы, обогащенной МНЧ, но с низким содержанием СМГК. Эта фаза более гидрофобна, чем окружающий ее раствор с более высоким содержанием СМГК в хлористом метилене. Диффузия и испарение хлористого метилена из системы приводят в начале созревания МЧ к концентрированию этого раствора с формированием достаточно плотной оболочки, которая по мере диффузии через нее растворителя и уменьшения объема внутренней фазы сморщивается и формирует видимые на изображениях РЭМ складки. Сходным образом происходит образование складок на поверхности частиц, получаемых из полимеров распылительной сушкой с высокой скоростью [21].
Включение РХ в МЧ составило около 10 % от расчетного в образцах без МНЧ (см. таблицу). Наличие МНЧ в МЧ приводит к существенному увеличению включения РХ — до 60—70 %. Необходимо отметить, что добавление лецитина в значительной степени способствует включению РХ в полимерную матрицу МЧ: по результатам предварительных экспериментов при его отсутствии включение РХ в МЧ без МНЧ не превышает 1 %.
На спектрах поглощения образцов, полученных при растворении МЧ в ацетонитриле, присутствуют характерные для РХ пики (рис. 2): длинноволновый в районе 662 нм и коротковолновый в районе 402 нм. Это указывает на то, что РХ, инкапсулированный в МЧ, сохраняет исходные оптические свойства, важные для ФДТ.
Выявляемое достоверно (р <0,05) более высокое образование синглетного кислорода МЧ с РХ по сравнению с МЧ без РХ при облучении водной суспензии МЧ красным СИД указывает на возможность использования таких частиц для ФДТ (рис. 3). Присутствие в полимерной матрице ПФД и МНЧ значительно увеличивает генерацию синглетного кислорода. В МЧ с ПФД это может быть связано с повышенным общим содержанием кислорода в дисперсии из-за его большей растворимости в перфторуглеродах. Интенсификация образования синглетного кислорода в МЧ с МНЧ может быть объяснена выявленным в данном случае увеличением включения РХ в МЧ.
Состав МЧ / MP composition
Разбавленная Концентрированная суспензия / суспензия / Concent-Diluted suspension rated suspension
СМГК / PLGA
СМГК + РХ / PLGA + RC
СМГК + РХ + МНЧ / PLGA + RC + MNP
СМГК + РХ + ПФД / PLGA + RC + PFD
СМГК + РХ + МНЧ + ПФД / PLGA + RC + MNP + PFD
СМГК + МНЧ / PLGA + MNP
СМГК + ПФД / PLGA + PFD
Рис. 1. Растровая электронная микроскопия микрочастиц разного состава. Масштабная метка — общая для всех изображений. Здесь, а также на рис. 2—6 и в таблице: МЧ — микрочастицы, СМГК — сополимер молочной и гликолевой кислот, РХ — радахлорин, МНЧ — магнитные наночастицы, ПФД — перфтордекалин Fig. 1. Scanning electron microscopy of microparticles with different composition. Scale mark is common to all images. Here, on figures 2—6 and in table: MP — microparticles, PLGA — Poly(lactide-co-glycolide acid), RC — radachlorin, MNP — magnetic nanoparticles, PFD — perfluoro-decalin
Согласно полученным данным (рис. 4), в водной дисперсии МЧ в течение 1-го часа достигается
Характеристики МЧ Characteristics of MP
Состав МЧ
MP composition
Гидродинамический радиус МЧ (R ± e_), мкм
Hydrodynamic radius of MP
( R ± eR ), (im
Коэффициент полидисперсности МЧ
(ei /R2)*
Polydispersity factor of MP ( eR /R2 ) *
Дзета-потен-
Содержание РХ
циал МЧ, мВ в МЧ, мкг/мг в МЧ**, %
RC content in MP, ig/mg
СМГК PLGA 0,270 ± 0,143 0,280 -16,6 ± 2,0 - -
СМКГ + РХ PLGA + RC 0,112 ± 0,018 0,027 -19,5 ± 4,5 0,27 ± 0,11 6,6 ± 2,7
СМГК + РХ + МНЧ PLGA + RC + MNP 0,240 ± 0,045 0,035 -23,6 ± 6,8 2,34 ± 0,78 60,6 ± 20,1
СМГК + РХ + ПФД PLGA + RC + PFD 0,138 ± 0,054 0,150 -18,7 ± 0,4 0,27 ± 0,20 16,9 ± 12,3
СМКГ + РХ + МНЧ + ПФД PLGA + RC + PFD + MNP 0,318 ± 0,150 0,224 -19,6 ± 1,8 1,16 ± 0,59 72,3 ± 36,8
СМГК + МНЧ PLGA + MNP 0,315 ± 0,092 0,086 -17,6 ± 2,0 - -
СМГК + ПФД PLGA + PFD 0,378 ± 0,129 0,116 -16,0 ± 1,1 - -
*Рассчитан по приведенным результатам измерения размеров частиц; **доля от теоретического содержания РХ в МЧ при условии его полного включения. *Calculated according to the given results of measuring the particle sizes; **fraction of the theoretical content of RC in the MP, subject to its full inclusion.
-о Ö
0,50 0,40 0,30 0,50 0,20 0,10 0,00 -0,10
0,50 0,40 0,30
tf 0,50
РХ / RC МЧ / MP
-A
0,10 0,00 -0,10
300 400 500 600 700 800
Â, нм / X, nm
- РХ / RC
----МЧ / MP
У* A
300 400 500 600 700 800
Â, нм / X, nm
-o Ö
0,50 0,40 0,30 0,50 5 0,20 0,10 0,00 -0,10
0,50 0,40 0,30
ID
Q, 0,50
5 0,20 0,10 0,00 -0,10
A
300 f
400
РХ / RC МЧ / MP
A_.
500 600 Â, нм / X, nm
700
800
РХ / RC МЧ / MP
300
400
500 600 Â, нм / X, nm
700
800
Рис. 2. Спектры поглощения РХ (8,75 мкг/мл) и МЧ (1 мг/мл) в ацетонитриле: a - СМГК + РХ; б - СМГК + РХ+МНЧ; в - СМГК + РХ+ПФД; г - СМГК + РХ + ПФД + МНЧ
Fig. 2. Absorption spectra of RC (8.75 ßg/ml) and MP (1 mg/ml) in acetonitrile: a - PLGA + RC; б - PLGA + RC + MNP; в - PLGA + RC + PFD; г - PLGA + RC + PFD + MNP
а
в
г
Время облучения, с / Time of irradiation, sec
О РХ / RC
X МЧ (СМГК) / MP (PLGA)
• МЧ (СМКГ + РХ) / MP (PLGA + RC)
ф МЧ (СМГК + РХ + ПФД) / МP (PLGA + RC + PFD)
■ МЧ (СМГК + РХ + МНЧ) / MP (PLGA + RC + MNP)
▲ МЧ (СМГК + РХ + ПФД + МНЧ) / MP (PLGA + RC + PFD + MNP)
Рис. 3. Генерация синглетного кислорода Fig. 3. Generation of singlet oxygen
близкая к максимальной концентрация РХ, которая затем медленно снижается в течение периода до 1 мес. В растворе РХ без частиц с исходной концентрацией РХ, практически равной максимальной концентрации высвободившегося из МЧ РХ, его содержание убывает существенно быстрее и уже через сутки оказывается достоверно ниже, чем в суспензии МЧ. При этом в суспензии МЧ без МНЧ концентрация РХ убывает лишь до половины от максимальной только через 2 нед, а в случае присутствия в полимерной матрице МНЧ концентрация РХ остается практически неизменной в течение 30 дней. Описанная кинетика высвобождения характеризует МЧ как депо с пролонгированным высвобождением РХ, пригодное для проведения нескольких последовательных сеансов ФДТ без повторных инъекций ФС.
Согласно результатам проведенных исследований с использованием световой микроскопии, МЧ с РХ поглощаются клетками и накапливаются в цитоплазме, не вызывая при этом существенных изменений в плотности монослоя (рис. 5). Хорошо различимая флуоресценция МЧ на изображениях флуоресцентной микроскопии указывает на возможность использования таких частиц в качестве агентов для диагностики посредством визуализации поглотивших их клеток.
В результате МТТ-теста выявлено, что поглощение МЧ, содержащих РХ, клетками CHO в культуре сопровождается снижением их жизнеспособности различной степени в зависимости от состава МЧ (рис. 6). Наблюдаемое угнетение метаболизма может быть связано как с цитотоксическим действием высвобождающегося внутри клеток РХ, так и с нарушением их структуры поглощенными МЧ. Наиболее значи-
Время, сут / Time, day
О РХ / RC
▲ МЧ (СМГК + РХ + ПФД + МНЧ) / MP (PLGA + RC + PFD + MNP) ■ МЧ (СМГК + РХ + МНЧ) / MP (PLGA + RC + MNP)
б
Время, сут / Time, day
О РХ / RC
• МЧ (СМКГ + РХ) / MP (PLGA + RC)
♦ МЧ (СМГК + РХ + ПФД) / MP (PLGA + RC + PFD)
Рис. 4. Высвобождение РХ из МЧ: a - РХ (0,875 мкг/мл), МЧ (СМГК + РХ + ПФД + МНЧ), МЧ (СМГК + РХ + МНЧ); б - РХ (0,0875мкг/мл), МЧ(СМКГ + РХ), МЧ (СМГК+РХ+ПФД), *p <0,05 для отличий от пробы только с РХ
Fig. 4. RC release from MP: а - RC (0.875pg/ml), MP (PLGA + RC + PFD + MNP), MP (PLGA + RC + MNP); б - RC (0.0875pg/ml), MP (PLGA + RC), MP (PLGA + RC + PFD); *p <0.05 for the dfferences from samples with RC alone
тельное угнетение жизнедеятельности клеток заметно для МЧ, содержащих в полимерной матрице РХ и МНЧ. Однако это, по-видимому, не связано с описанными особенностями поверхности таких частиц, поскольку в отсутствие РХ не наблюдается угнетающего действия на клетки МЧ, содержащих МНЧ. Кроме того, согласно полученным данным, наличие МНЧ не способствует фотодинамическому действию на клетки РХ в составе МЧ. В то же время свободный РХ и МЧ, содержащие только РХ, обладают заметным фотодинамическим повреждающим действием. Наличие ПФД в составе МЧ не сопровождается заметным
54 Оригинальные статьи / Original reports
Микроскопия в проходящем свете / Microscopy in transmitted light
Флуоресцентная микроскопия / Fluorescent microscopy
160 140 120 100 80 60 40 20
ZH Без СИД / Without irradiation ИЗ Облучение СИД / With irradiation
JL|
ir
о ce
го "с
(О -Q
о а
а 1-
О ее
а §
х
а =г г
£ 5
Îl +
Îl +
ГГ ;
О ce
65
Q.
© с
0
Добавка в культу-ральную среду (состав МЧ) / Additive to the culture medium (MP composition)
Без добавок / Without additives
МЧ (СМГК) / MP (PLGA)
РХ / RC
МЧ (СМГК + РХ) / MP (PLGA + RC)
МЧ (СМГК + РХ + МНЧ) / MP (PLGA + RC + MNP)
МЧ (СМГК + РХ + ПФД) / MP (PLGA + RC + PFD)
МЧ (СМГК + РХ + МНЧ + ПФД) / MP (PLGA + RC + MNP + PFD)
МЧ (СМГК + МНЧ) / MP (PLGA + MNP)
МЧ (СМГК + ПФД) / MP (PLGA + PFD)
Рис. 5. Световая микроскопия монослоя клеток CHO (клетки яичников сирийского хомячка) через 1 сут после инкубации с МЧ разного состава. Масштабная метка — общая для всех изображений Fig. 5. Light and fluorescence microscopy of a monolayer of CHO cells (Syrian hamster ovary cells) 1 day after incubation with MPs of different composition. Scale mark is common to all images
Рис. 6. Влияние РХ и содержащих РХ МЧ на жизнеспособность клеток и фотодинамическое действие на эти клетки облучения свето-излучающим диодом (СИД) по результатам МТТ-теста; *p <0,05 для отличий от контроля без облучения СИД и воздействия МЧ и РХ; **p <0,05 для отличий между облученными СИД клетками по отношению к клеткам без облучения СИД после инкубации с определенным видом МЧ или РХ
Fig. 6. Influence of RC and RC-containing MPs on cell viability and photodynamic effect of light irradiation on these cells according to the MTT test results; *p <0.05 for differencesfrom the line cells without any additives and irradiation; **p <0.05 for differences between irradiated cells in relation to cells without irradiation after incubation with certain type of MP or RC
влиянием на особенности реакции поглотивших МЧ клеток и на фотодинамический эффект. Можно лишь отметить более сильное повреждающее действие МЧ, в которых одновременно присутствуют РХ, МНЧ и ПФД.
Заключение
Применение технологии Т/М/В позволяет получить содержащие РХ МЧ, пригодные для использования в качестве депо, которое в течение 30 дней может поддерживать в своем микроокружении концентрации ФС, способные вызывать цитотоксиче-ский фотодинамический эффект. При введении полученных МЧ в опухоль их поглощение клетками будет способствовать повышению эффективности ФДТ за счет внутриклеточного высвобождения действующего вещества.
Поскольку МЧ имеют размер меньше 1 мкм и отрицательный заряд, то их поглощение клетками должно протекать в основном по типу фагоцитоза. При внутрисосудистом введении накопление полученных МЧ, вероятнее всего, будет происходить главным образом в печени, селезенке, легких и других
органах с высоким содержанием клеток системы мо-нонуклеарных фагоцитов. Выход полученных МЧ из кровеносного русла в других местах будет невысоким. Однако присутствие в полимерной матрице таких МЧ МНЧ позволит накапливать полученные МЧ в интересующих местах кровеносного русла за счет воздействия на них внешнего магнитного поля. Присутствие МНЧ в полимерной матрице МЧ значительно увеличивает включение в них РХ, а также продолжительность его постепенного выхода в среду по отношению к простым МЧ с РХ, что позволяет рассматривать такие частицы в качестве фотодинамического средства пролонгированного действия.
В целом полученные результаты показывают, что на основе биодеградируемого СМГК могут быть
получены биосовместимые МЧ с включением РХ, обладающие способностью к его пролонгированному высвобождению. Воздействие на такие частицы светового излучения, применяемого при ФДТ с использованием РХ, сопровождается образованием син-глетного кислорода, обладающего цитотоксическим эффектом для опухолевых клеток. Присутствие в полимерной матрице МЧ МНЧ и ПФД увеличивает процент включения РХ и интенсифицирует образование синглетного кислорода. Длительное высвобождение инкапсулированного РХ из таких частиц и их возможное накопление в проблемных областях с помощью воздействия внешних факторов позволяет увеличить терапевтическое окно при использовании ФС.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Falzone L., Salomone S., Libra M. Evolution of Cancer Pharmacological Treatments at the Turn of the Third Millennium. Front Pharmacol 2018;9:1300.
DOI: 10.3389/fphar.2018.01300.
2. Гамаюнов С.В., Шахова Н.М., Денисенко А.Н. и др. Фотодинамическая терапия — преимущества новой методики и особенности организации службы. Тихоокеанский медицинский журнал 2014;2:101-4. [Gamayunov S.V., Shakhova N.M., Denisenko A.N. et al. Photodynamic therapy: the benefits of the new technique and service organization details. Tikhookeanskiy meditsinskiy zhurnal = Pacific Medical Journal 2014;2:101-4. (In Russ.)].
3. Филоненко Е.В., Серова Л.Г. Фотодинамическая терапия в клинической практике. Biomedical Photonics 2016;5(2):26-37. [Filonenko E.V., Serova L.G. Photodynamic therapy
in clinical practice. Biomedical Photonics 2016;5(2):26-37 (In Russ.)].
4. Ozog D.M., Rkein A.M., Fabi S.G. et al. Photodynamic Therapy: A Clinical Consensus Guide. Dermatol Surg 2016;42(7):804-27.
DOI: 10.1097/DSS.0000000000000800.
5. Yanovsky R.L., Bartenstein D.W., Rogers G.S. et al. Photodynamic therapy for solid tumors: A review of the literature. Photodermatol Photoimmunol Photomed 2019;35(5):295-303.
DOI: 10.1111/phpp.12489.
6. Bergh H., Vogel A. Therapeutic Laser Applications and Laser-Tissue Interactions II. Proceedings of the SPIE 2005;5863:186-97.
7. Vargas F., Diaz Y., Yartsev V. et al. Photophysical properties of novel PDT
photosensitizer Radachlorin in different media. Ciencia 2004;12(1):70-7.
8. Douillard S., Lhommeau I., Olivier D., Patrice T. In vitro evaluation
of Radachlorin sensitizer for photodynamic therapy. J Photochem Photobiol B 2010;98(2):128-37. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2009.11.011.
9. Juzeniene A. Chlorin e6-based photo-sensitizers for photodynamic therapy and photodiagnosis. Photodiagnosis Photodyn Ther 2009;6(2):94-6. DOI: 10.1016/j.pdpdt.2009.06.001.
10. Shiryaev A.A., Musaev G.K., Levkin V.V. et al. Combined treatment of nonresec-table cholangiocarcinoma complicated by obstructive jaundice. Photodiagnosis Photodyn Ther 2019;26:218-23.
DOI: 10.1016/j.pdpdt.2019.04.006.
11. Nair P.R. Delivering Combination Chemotherapies and Targeting Oncogenic Pathways via Polymeric Drug Delivery Systems. Polymers (Basel) 2019;11(4):630.
DOI: 10.3390/polym11040630.
12. Pan J., Rostamizadeh K., Filipczak N., Torchilin V.P. Polymeric Co-Delivery Systems in Cancer Treatment: An Overview on Component Drugs' Dosage Ratio Effect. Molecules 2019;24(6):1035. DOI: 10.3390/molecules24061035.
13. Zhou L., Wang H., Li Y. Stimuli-Responsive Nanomedicines for Overcoming Cancer Multidrug Resistance. Theranostics 2018;8(4):1059-74. DOI: 10.7150/thno.22679.
14. Li T., Yan L. Functional Polymer Nanocarriers for Photodynamic Therapy. Pharmaceuticals (Basel) 2018;11(4):133. DOI: 10.3390/ph11040133.
15. Wang J.W., Xu J.H., Li J. et al. Improvement of the Antitumor Efficacy of Intratumoral Administration
of Cucurbitacin Poly(Lactic-co-Glycolic
Acid) Microspheres Incorporated in In Situ-Forming Sucrose Acetate Isobutyrate Depots. J Pharm Sci 2016;105(1):205-11. DOI: 10.1002/jps.24695.
16. Mariana B.O., Joao F.M. Polymer-Based Microparticles in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Biotechnol Prog 2011;27(4):897-912.
DOI: 10.1002/btpr.618.
17. Никифоров В.Н. Биомедицинские применения магнитных наночастиц. Наука и технологии в промышленности 2011;1:90-9. [Nikiforov V.N. Biomedical applications of magnetic nanoparticles. Nauka i tekhnologii v pro-mishlennosty = Science and technology in industry 2011;1:90-9. (In Russ.)].
18. Wang Zh., Zhang F., Shao D. et al. Janus Nanobullets Combine Photodynamic Therapy and Magnetic Hyperthermia
to Potentiate Synergetic Anti-Metastatic Immunotherapy. Adv Sci 2019;6(22): 1901690. DOI: 10.1002/advs.201901690.
19. Pröspero A.G., Quini C.C., Bakuzis A.F. et al. Real-time in vivo monitoring
of magnetic nanoparticles in the bloodstream by AC biosusceptometry. J Nanobiotechnologoy 2017:15(1):22. DOI: 10.1186/s12951-017-0257-6.
20. Thomasin C., Ho N.T., Merkle H.P., Gander B. Drug microencapsulation by PLA/PLGA coacervation in the light of thermodynamics. 1. Overview and theoretical considerations. J Pharm Sci 1998;87(3):259-68.
DOI: 10.1021/js970047r.
21. Jablczynska K., Janczewska M., Kulikowska A., Sosnowski T.R. Preparation and characterization of biocompatible polymer particles
as potential nanocarriers for inhalation therapy. Int J Polymer Sci 2015;22:1-8. DOI: 10.1155/2015/763020.
Вклад авторов
А.М. Мирошкина: получение экспериментальных данных, анализ полученных данных, написание текста рукописи; С.П. Кречетов: разработка дизайна исследования, получение экспериментальных данных, анализ полученных данных;
H.Л. Соловьева: обзор публикаций по теме статьи, анализ полученных данных; И.И. Краснюк: разработка дизайна исследования.
Authors contributions
A.M. Miroshkina: obtaining data for analysis, analysis of the obtained data, writing the text of the manuscript; S.P. Krechetov: research design development, obtaining data for analysis, analysis of the obtained data; N.L. Solovieva: review of publications on the topic of the article, analysis of the data obtained;
I.I. Krasnyuk: research design development.
ORCID авторов / ORCID of authors
А.М. Мирошкина / A.M. Miroshkina: https://orcid.org/0000-0001-7028-0966 С.П. Кречетов / S.P. Krechetov: https://orcid.org/0000-0003-2861-6010 Н.Л. Соловьева / N.L. Solovieva: https://orcid.org/0000-0002-0781-7553 И.И. Краснюк / I.I. Krasnyuk: https://orcid.org/0000-0003-4382-7377
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (договор № 02.G25.31.0001) в рамках реализации Постановления Правительства Российской Федерации от 09.04.2010 № 218. Financing. The work was carried out with the financial support of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation (contract No 02.G25.31.0001) as part of the implementation of the Decree of the Government of the Russian Federation No 218 of 09.04.2010.
Статья поступила: 26.03.2021. Принята к публикации: 20.08.2021. Article submitted: 26.03.2021. Accepted for publication: 20.08.2021.
