CC BY
0УДК 616.8-056.7
РАЗРАБОТКА ПОДХОДА ГЕННОЙ ТЕРАПИИ "SILENCE-AND-REPLACE" ДЛЯ GNAOI-ЭНЦЕФАЛОПАТИИ
DOI 10.24412/CL-37228-2024-124-126 А. Юсеф12, Е. А. Лунев3, А. А. Карань2, М. В. Бардина3
'Московский физико-технический институт, Москва, Россия 2ООО «Марлин Биотех», Сочи, Россия
'Лаборатория моделирования и терапии наследственных заболеваний, Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, Россия E-mail: a.yousef.marlin@gmail.com
Аннотация. Работа посвящена разработке генной терапии на основе аденоассоциированных вирусов (ААВ) для неврологического заболевания GNAO1-энцефалопатия. Мы создали ААВ-вектор для реализации стратегии «Silence-and-Replace», универсальной для всех патогенных вариантов гена GNAO1. В клеточных культурах мы продемонстрировали, что ААВ-вектор снижает экспрессию GNAO1 дикого типа и обеспечивает синтез здоровой копии GNAO1 с кодон-оптимизацией. Наши результаты могут быть использованы для создания прототипа препарата и доклинических испытаний.
Ключевые слова: GNAO1 -энцефалопатия, генная терапия, аденоассо-циированные вирусы, Silence-and-Replace.
GNAO1-энцефалопатия является орфанным неврологическим заболеванием, вызванным гетерозиготными вариантами гена GNAO1. Заболевание проявляется преимущественно в виде младенческой эпилепсии и/или нарушением развития мозга с непроизвольными движениями [1]. Ген GNAO1 кодирует альфа-субъ-единицу гетеротримерного G-белка (G ), которая играет важную роль в передаче сигналов. Gao широко распространен в центральной нервной системе, особенно в полосатом теле, таламусе, черной субстанции и мозжечке [2]. Различные мутации в GNAO1 могут приводить к потере или усилению функции белка Gao, а также к доминантно-негативной активности. Генная терапия с использованием аденоассоциированных вирусов (ААВ) является перспективной для лечения таких заболеваний.
Нашей целью является разработка универсальной генной терапии "Silence-and-Replace" для большинства мутаций GNAO1. Подход заключается в подавлении экспрессии эндогенного GNAO1 (Silence) эффекторами РНК интерференции и доставке функциональной копии гена, устойчивой к подавлению (Replace). На первом этапе мы подобрали искусственную микроРНК для подавления GNAO1, а также создали CDS GNAO1 с кодон-оптимизацией (coGNAOl), обеспечивающей устойчивость к подавлению. Затем мы сконструировали плазмидный ААВ-вектор для одновременной экспрессии искусственной микроРНК и coGNAO1 c НА-тагом под контролем CMV-промотора. Полученный ААВ-вектор мы проверили в культуре клеток HEK293T методами ОТ-кПЦР и вестерн-блота. Мы подтвердили эффективную экспрессию coGNAO1, а также устойчивость к подавлению эффекторами РНК интерференции. На следующем этапе мы проверили функциональность компонентов ААВ-вектора в первичной культуре нейронов, выделенных из цельного мозга новорожденных мышей. Мы собрали рекомбинантные частицы ААВ серотипа DJ и заражали нейроны при множественности инфекции 105 геномных копий на клетку. ААВ-вектор обеспечивал эффективную экспрессию гетерологичного coGNAO1, существенно превышающую уровень мРНК и белка эндогенного Gnao1. Таким образом, созданный нами ААВ-вектор, несущий coGNAO1 и микроРНК, является хорошим кандидатом для изучения подхода «Silence-and-Replace», поскольку соответствует ожидаемым параметрам.
В дальнейшем мы планируем протестировать подход "Silence-and-Replace" в пациент-специфических нейронах с патогенным вариантом GNAO1 с.607С>Л (p.G203R). Результаты исследования прояснят перспективы генной терапии Silence-and-Replace для лечения GNAOl-энцефалопатии.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-25-00323, https://rscf.ru/project/23-25-00323/
Список литературы
1. Feng H., Khalil S., Neubig R. R., Sidiropoulos C. A mechanistic review on GNAOl-associated movement disorder // Neurobiol Dis. — 2018. — No 116. — P. 131-141.
2. Polikarpova A. V., Egorova T. V., Lunev E. A., Tsitrina A. A., Vassilie-va S. G., Savchenko I. M., Silaeva Y. Y., Deykin A. V. & Bardina M. V. CRISPR/Cas9-generated mouse model with humanizing single-base substitution in the Gnaol for safety studies of RNA therapeutics // Frontiers in genome editing. — 2023. — No 5. — P. 1034720.
DEVELOPMENT OF A "SILENCE-AND-REPLACE" GENE THERAPY APPROACH FOR GNAO1-ENCEPHALOPATHY
Abstract. The work is devoted to the development of gene therapy based on adeno-associated viruses (AAV) for the neurological disease GNAO1-encephalopathy. We have created an AAV vector to implement the "Silence-and-Replace" strategy, which is universal for all pathogenic variants of the gnaol gene. In cell cultures, we have demonstrated that the AAV vector reduces the expression of wild-type GNAO1 and ensures the synthesis of a healthy copy of GNAO1 with codon optimization. Our results can be used to create a prototype of the drug and pre-clinical trials.
Key words: GNAO1-encephalopathy, gene therapy, adeno-associated viruses, Silence-and-Replace.
