CC BY
13УДК 616.8-056.7
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ НА ОСНОВЕ AAV-RNAI ДЛЯ GNA01-ЭНЦЕФАЛ0ПАТИИ ВЫЗВАННОЙ ДОМИНАНТНОЙ МУТАЦИЕЙ C.607 G>A
DOI
Лунев Е. А. 1 2 3, Клементьева Н. В. 1 2, Васильева С. Г 1 2, Поликарпова А. В. 1 2, Шмидт А. А. 1 2 3, Воловиков Е. А. 1 4, Егорова Т. В. 1 2, Дейкин А. В. 5, Бардина М. В. 123
1 Лаборатория моделирования и терапии наследственных заболеваний, Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, Россия
2 ООО "Marlin Biotech", Сочи, Россия
3 Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, Россия
4 Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. академика Ю. М. Лопухина, Москва, Россия
5 Лаборатория генетических технологий и редактирования генома для биомедицины и ветеринарии Объединенного центра генетических технологий Белгородского национального исследовательского университета, Белгород, Россия
e.lunev.marlin@gmail.com
Ключевые слова: GNAOl-энцефалопатия, G-белки, генная терапия
GNAOl-энцефалопатия является орфанным неврологическим заболеванием, вызванным de novo мутациями в гене GNAO1 и проявляется в виде эпилепсии и/или двигательной дисфункции с задержкой развития. На данный момент не существует лечения данного заболевания, а механизм слабо изучен. Один из наиболее распространенных и тяжелых вариантов GNAOl-энцефалопатии вызывается гетерозиготной мутацией GNAO1 c.607 G>A (G203R). Ранее для этого варианта мы разработали подход генной терапии основанный на селективном подавлении мутантного аллеля с помощью РНК-интерференции. В настоящей работе мы уточнили фенотипическое проявление мутантного белка Gao-G203R в клеточной культуре, а также провели оптимизацию и оценку биобезопасности потенциального препарата генной терапии in vitro и in vivo. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия Gao в клетках
HEK293T, усиливает индуцируемый форсколином синтез цАМФ, в то время как мутантный Gao-G203R терял это свойство. Кроме того, нарушение этой функции проявлял устойчивый к коклюшному токсину белок Gao-C351G, используемый в ранних in vitro исследованиях GNAO1-энцефалопатии. Мы оценили токсичность короткой шпилечной РНК, специфичной для варианта GNAO1 c.607 G>A, на нейронах полученных из иПСК пациента. По результатам транскриптомного исследования мы не выявили критических нарушений в экспрессии генов. Для оптимизации доставки терапевтического вектора мы протестировали ней-ротропные серотипы ААВ1, 2, 5, 6, 8, 9, DJ, PHP.B и rh10, а также различные пути введения для таргетирования богатых Gnao1 областей в мозге мыши. Внутривенное введение серотипа ААВ9 обеспечивало наиболее равномерную трансдукцию Gnao1-позитивных клеток. Затем мы усовершенствовали геннотерапевтическую конструкцию, клонировав эффектор РНК-интерференции в виде искусственной miR30 под контроль нейроспецифического промотора hSyn1. Полученный вектор был упакован в серотип ААВ9 выбранный по результатам скрининга. Наличие шпилечной структуры в векторе не повлияло на продукцию вируса. Оценка безопасности препарата in vivo была проведена на гуманизированной линии мышей Gnao1-GGA. Проведенные поведенческие тесты и анализ биохимии крови не выявил патологических отклонений у испытуемых животных. Таким образом, наши результаты in vitro и in vivo подчеркивают потенциал AAV-RNAi терапии для лечения GNAO1 c.607 G>A энцефалопатии.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда No 23—25—00323, https://rscf.ru/project/23—25—00323/
AAV-RNAI-BASED GENE THERAPY FOR GNAO1-ENCEPHALOPATHY CAUSED BY DOMINANT MUTATION C.607 G>A
Lunev E. A. 1 2 3, Klementieva N. V. 1 2, Vassilieva S. G. 1 2, Polikarpova A. V. 1 2, Shmidt A. A. 1 2 3, Volovikov E. A. 1 4, Egorova T. V. 1 2, Deykin A. V. 5, Bardina M. V. 1 2 3
1 Laboratory of Modeling and Gene Therapy of Hereditary Diseases, Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
2 Marlin Biotech, Sochi, Russia
3 Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
4 Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, Moscow, Russia
5 Laboratory of Genetic Technologies and Genome editing for Biomedicine and Animal Health, Joint Center for Genetic Technologies, Belgorod National Research University, Belgorod, Russia
e.lunev.marlin@gmail.com
Key words: GNAO1 encephalopathy, G proteins, gene therapy
GNAO1 encephalopathy is an orphan neurological disease caused by de novo mutations in the GNAO1 gene and manifests as epilepsy and/or motor dysfunction with developmental delay. Currently, this disease has no treatment, and the mechanism is poorly understood. One of the most common and severe variants of GNAO1 encephalopathy is caused by the heterozygous mutation GNAO1 c.607 G>A (G203R). Previously, for this variant, we developed a gene therapy approach based on the selective suppression of the mutant allele by RNA interference. In the present study, we clarified the phenotypic manifestation of the Gao-G203R mutant protein in cell culture and optimized and assessed the biosafety of a potential gene therapy drug in vitro and in vivo. We found that overexpression of Gao in HEK293T cells enhanced forskolin-induced cAMP synthesis, while the mutant Gao-G203R lost this property. In addition, PTX-resistant protein Gao-C351G, used in early in vitro studies of GNAO1 encephalopathy, exhibited impairment of this function. We evaluated the toxicity of the shRNA specific for the GNAO1 c.607 G>A variant on patient-specific IPSC-derived neurons. RNAseq analysis did not reveal critical abnormalities in gene expression. To optimize therapeu-
tic vector delivery, we tested the neurotrophic serotypes AAV1, 2, 5, 6, 8, 9, DJ, PHP.B, and rh10, as well as different routes of administration to target Gnaol-rich regions in the mouse brain. Intravenous administration of the AAV9 serotype provided the most uniform transduction of Gnaol-positive cells. Then we improved the gene therapy vector by cloning the RNAi effector in the form of artificial miR30 under the control of the neurospecific hSynl promoter. The resulting vector was packaged in the AAV9 serotype selected based on the screening results. The presence of the hairpin structure in the vector did not affect the production of the virus. The drug's in vivo safety assessment was carried out on a humanized Gnaol-GGA mice. Conducted behavioral tests and biochemical blood analysis did not reveal pathological abnormalities in experimental animals. Thus, our in vitro and in vivo results highlight the potential of AAV-RNAi therapy for treating GNAO1 c.607 G>A encephalopathy.
The study was supported by the Russian Science Foundation grant No.
23—25—00323, https://rscf.ru/project/23—25—00323/
