CC BY
0
ТЕМА НОМЕРА: ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ / ISSUE TOPIC: ADVANCED THERAPY MEDICINAL PRODUCTS
УДК 578.22:577.29
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-2-215-228 Оригинальная статья | Original article
Ц) Check for updates
(ее) ПЕН
Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo методом секвенирования нового поколения
Д.О. Максимов1-2-4, Д.А. Наумова1, Е.А. Астахова1, В.В. Артемьев1,
С.А. Бирюков1, И.С. Абрамов134, А.А. Навойкова1, Н.В. Рудев14,
С.Г. Феоктистова14, О.В. Глазова14, О.Н. Митяева124, н, П.Ю. Волчков1234
1 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)», Институтский переулок, д. 9, Долгопрудный, Московская область, 141700, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Москва, 119991, Российская Федерация
3 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения г. Москвы «Московский клинический научно-практический центр имени А.С. Логинова Департамента здравоохранения г. Москвы», ул. Новогиреевская, д. 1, Москва, 111123, Российская Федерация
4 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских
и фармацевтических технологий», ул. Балтийская, д. 8, Москва, 125315, Российская Федерация
И Митяева Ольга Николаевна; mitiaeva.on@mipt.ru
РЕЗЮМЕ ВВЕДЕНИЕ. Создание синтетических векторов на основе аденоассоциированных вирусов
(ААВ) при разработке препаратов для генной терапии является трудоемким и дорогостоящим процессом. Для ускорения и снижения стоимости разработки генотерапевтических препаратов оптимальным представляется совершенствование методов оценки биораспределения и эффективности трансдукции in vivo ААВ векторов.
ЦЕЛЬ. Разработка методики биоинформатической оценки библиотек синтетических векторов на основе ААВ для анализа биораспределения и эффективности трансдукции ААВ in vivo.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Конструировали синтетические ААВ векторы путем добавления специальной метки (баркода), специфичной для каждого исследуемого серотипа ААВ -12-нуклеотидной последовательности, фланкированной с 5'-конца кодирующей последовательностью репортерного белка (зеленый флуоресцентный белок). Плазмиды с уникальными баркодами нарабатывали в компетентных клетках Escherichia coli XL10-Gold и использовали для сборки ААВ-библиотек: ААВ-библиотека L1 - с количеством вирусных геномов (вг) 1010; библиотека L2 с количеством вг - 1011. Для продукции ААВ проводили трансфекцию клеток НЕК293Т. Векторы в виде двух ААВ-библиотек вводили внутривенно мышам линии С57В1/6^ Из органов и тканей животных выделяли ДНК и РНК для последующего анализа методом секвенирования нового поколения. Анализировали количество ДНК- и РНК-баркодов в органах мышей для оценки биораспределения и эффективности трансдукции ААВ. Баркоды идентифицировали с помощью выравнивания на ожидаемые последовательности, затем подсчитывали их количество и нормировали на количество в исходной библиотеке.
© Д.О. Максимов, Д.А. Наумова, Е.А. Астахова, В.В. Артемьев, С.А. Бирюков, И.С. Абрамов, А.А. Навойкова, Н.В. Рудев,
С.Г. Феоктистова, О.В. Глазова, О.Н. Митяева, П.Ю. Волчков, 2024
Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo...
РЕЗУЛЬТАТЫ. Созданы 7 вирусных конструкций на основе ААВ различных серотипов, 6 из которых - синтетические ^ААВ1, sААВ2, sААВ3, sААВ4, sААВ5, sААВ6), в составе двух ААВ-библиотек. При проведении секвенирования образцов из органов мышей обнаружено значимое количество ДНК-баркодов обеих ААВ-библиотек в образцах всех органов, за исключением мозга. Для библиотеки L1 детектированы РНК-баркоды на достаточном уровне в четырех органах: скелетная мускулатура, сердце, печень и надпочечники; для библиотеки L2 - дополнительно к перечисленным органам в гонадах и почках. При анализе эффективности трансдукции (по уровню РНК-баркодов с поправкой на ДНК-баркоды) показано, что наиболее перспективными вариантами для генной терапии заболеваний печени является sAAВ5, а для заболеваний надпочечников - sAAВ2 и sAAВ6. ВЫВОДЫ. Разработанная методика биоинформатической оценки библиотек синтетических векторов на основе ААВ позволяет проводить анализ биораспределения и эффективности трансдукции ААВ векторов в организме. Предложенный подход является перспективным для подбора оптимальных ААВ векторов для конкретных органов и тканей при разработке генотерапевтических препаратов.
Ключевые слова: аденоассоциированный вирус; ААВ; синтетический вектор; библиотека синтетических векторов; ААВ-библиотека; баркодирование; ДНК-баркод; РНК-баркод; серотипы ААВ; секвенирование нового поколения; биоинформатический анализ; биораспределение; эффективность трансдукции in vivo; тропизм; генная терапия
Для цитирования: Максимов Д.О., Наумова Д.А., Астахова Е.А., Артемьев В.В., Бирюков С.А., Абрамов И.С., Навойкова А.А., Рудев Н.В., Феоктистова С.Г., Глазова О.В., Митяева О.Н., Волчков П.Ю. Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo методом секвенирования нового поколения. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2024;24(2):215-228. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-2-215-228
Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 23-64-00002). Потенциальный конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
In vivo evaluation of tropism and biodistribution of synthetic and natural adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing
Denis O. Maksimov12,4, Daria A. Naumova1, Ekaterina A. Astakhova1,
Valentin V. Artemev1, Stanislav A. Biryukov1, Ivan S. Abramov1,3,4,
Anna A. Navoikova1, Nikolai V. Rudev14, Sofia G. Feoktistova14, Olga V. Glazova14,
Olga N. Mityaeva1244 H, Pavel Yu. Volchkov12 3 4
1 Moscow Institute of Physics and Technology, 9 Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141700, Russian Federation
2 Lomonosov Moscow State University, 1/3 Leninskie Gory, Moscow 119991, Russian Federation
3 AS. Loginov Moscow Clinical Research Center, 1 Novogireevskaya St., Moscow 111123, Russian Federation
4 Federal Research Center for Innovator and Emerging Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 8 Baltiyskaya St., Moscow 125315, Russian Federation
Olga N. Mityaeva; mitiaeva.on@mipt.ru
ABSTRACT INTRODUCTION. The creation of synthetic adeno-associated virus (AAV) vectors during gene therapy development is a labour-intensive and expensive process. The optimal solution to minimise the time and costs associated with gene therapy development lies in the improvement of methods aimed at assessing AAV vector biodistribution and transduction efficiency in vivo.
AIM. This study aimed to develop a new bioinformatics-based assessment method for synthetic AAV vector libraries to analyse AAV vector biodistribution and transduction efficiency in vivo. MATERIALS AND METHODS. The production of synthetic AAV vectors involved assigning AAV serotype-specific barcodes (12-nucleotide tags flanked at the 5' end with a sequence encoding the green fluorescent reporter protein). Plasmids carrying unique barcodes were propagated in competent Escherichia coli XL10-Gold cells and used to create two AAV libraries: L1 with a viral genome count of 1010 and L2 with a viral genome count of 1011. AAV production involved HEK293T cell transfection. L1 and L2 library vectors were administered to C57Bl/6N mice by intravenous injection. DNA and RNA were isolated from transduced organs for analysis by next-generation sequencing. The obtained data on DNA and RNA barcode quantities in different murine organs were analysed to assess the biodistribution and transduction efficiency of synthetic AAVs. Barcodes were identified by aligning them to the expected sequences and counted. The resulting values were normalised to the quantity of barcodes in the original library.
RESULTS. Seven viral constructs based on different AAV serotypes were created as part of two AAV libraries. Six of the AAV serotypes were synthetic (sAAVl, sAAV2, sAAV3, sAAV4, sAAV5, and sAAV6). Sequencing of murine organ samples revealed significant quantities of DNA barcodes from both AAV libraries in all organs except the brain. For the L1 library, RNA barcodes were detected at a sufficient level in 4 organs, including the skeletal muscles, the heart, the liver, and the adrenal glands. For the L2 library, in addition to the listed organs, sufficient RNA-barcode levels were observed in the gonads and the kidneys. According to transduction efficiency analysis based on RNA barcode levels adjusted for DNA barcodes, sAAV5 was considered the most promising variant for gene therapy of liver-related diseases, whereas sAAV2 and sAAV6 were recognised as holding the most promise for adrenal diseases. CONCLUSIONS. The developed bioinformatics-based assessment method for synthetic AAV vector libraries can analyse AAV vector biodistribution and transduction efficiency in the body. The presented approach has the potential for selecting optimal AAV vectors for specific organs and tissues in further gene therapy development.
Keywords: adeno-associated virus; AAV; synthetic vector; synthetic vector library; AAV library; barcoding;
DNA barcode; RNA barcode; AAV serotypes; next-generation sequencing; NGS; bioinformatics analysis; biodistribution; transduction efficiency in vivo; tropism; gene therapy
For citation: Maksimov D.O., Naumova D.A., Astakhova E.A., Artemev V.V., Biryukov S.A., Abramov I.S.,
Navoikova A.A., Rudev N.V., Feoktistova S.G., Glazova O.V., Mityaeva O.N., Volchkov P.Yu. In vivo evaluation of tropism and biodistribution of synthetic and natural adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2024;24(2):215-228. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-2-215-228
Funding. The study was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 23-64-00002). Disclosure. The authors declare no conflict of interest.
ВВЕДЕНИЕ
Векторы на основе аденоассоциирован-ных вирусов (ААВ) являются перспективным инструментом для генной терапии благодаря способности эффективно доставлять генетический материал в клетки-мишени и низкой им-муногенности [1]. Разные серотипы ААВ имеют различные показатели эффективности транс-дукции и биораспределения в органах и тканях [2-4]. Наиболее перспективны для генной терапии те серотипы ААВ, которые селективно трансдуцируют целевые органы-мишени, не затрагивая остальные ткани [5]. Разработка синтетических векторов на основе серотипов ААВ актуальна для достижения оптимальных показателей биораспределения и трансдукции, а также для снижения риска нежелательных
токсических эффектов, в частности иммунных реакций [6-9].
Внесение изменений в гены, кодирующие белки капсида ААВ, при создании синтетических векторов влияет на сродство капсида к рецепторам клеток и, следовательно, на параметры биораспределения вируса в организме [10-12]. В связи с этим при создании синтетических ААВ необходимо проводить их тестирование для изучения показателей биораспределения в тканях и эффективности трансдукции. Для исследования этих показателей наиболее информативными являются методы с использованием животных моделей: биоимиджинг в живом организме; определение сигнала от репортера в извлеченных органах и тканях; количественное определение вирусных частиц (например, с помощью
Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo...
количественной ПЦР) [13]. Реализация этих подходов подразумевает необходимость тестирования на животных каждого синтетического вектора на основе ААВ по отдельности, что является ресурсо- и трудозатратным процессом и препятствует ускоренной разработке векторов для генной терапии [14, 15].
Для решения описанной проблемы авторами данной работы предлагается создание высокопроизводительной скрининговой системы на основе ААВ-библиотек, состоящих из нескольких серотипов ААВ, что позволит быстро отбирать варианты ААВ с интересующими характеристиками биораспределения и трансдукции.
В настоящее время существует несколько систем молекулярного баркодирования ААВ-библиотек [16]. В работе K. Adachi с соавт. [17] впервые показано применение технологии бар-кодирования ДНК с последующим использованием метода секвенирования нового поколения (next-generation sequencing, NGS) в отношении ААВ. Полученные результаты позволили построить функциональную карту капсида ААВ, которая выявила аминокислотные замены, влияющие на функциональную активность капсида. Подход, направленный на анализ биораспределения ААВ в организме с использованием технологии баркодирования ААВ-библиотек, был впервые предложен сотрудниками лаборатории С. Золотухина (Университет Флориды, США) [18]. Анализ биораспределения ААВ в тканях после инъекции проводится по оценке ДНК, а анализ тропизма - способности экспрессировать трансген в тканях, регистрируется по оценке уровня РНК [19].
Несмотря на значительный прогресс в области разработки методов для массовой харак-теризации вариантов капсидов ААВ с помощью
NGS-секвенирования [16-18], биоинформати-ческие подходы для анализа данных молекулярного баркодирования в тканях организма остаются несовершенными. В данной работе применялась обобщенная линейная регрессия, что позволило учесть тот факт, что для различных повторов неизбежно получается разное покрытие, а значит и разная достоверность. Это учитывается моделью при оценке среднего. Кроме того, важным новым аспектом данного исследования являлась оценка эффективности трансдукции (тропизм с учетом биораспределения), так как эта оценка имеет важное значение для подбора стратегии проведения генотерапии. Так, например, если вариант вируса обладает высокой эффективностью трансдукции, но из-за особенностей профиля биораспределения в малой степени попадает в целевую ткань, то в этом случае локальная инъекция препарата вируса может быть более предпочтительной.
Цель работы - разработка методики биоин-форматической оценки библиотек синтетических векторов на основе ААВ для анализа биораспределения и эффективности трансдукции ААВ in vivo.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Дизайн эксперимента
Схема дизайна эксперимента представлена на рисунке 1.
Баркодирование ААВ-библиотек
Для изучения свойств векторов на основе различных серотипов ААВ проводили добавление специальной метки (баркода), специфичной для каждого исследуемого серотипа ААВ (табл. 1). Баркод представлял собой 12-нуклео-тидную последовательность, фланкированную с 5'-конца кодирующей последовательностью
Плазмидная библиотека Plasmid library
BARCODE I PolyA
Пакующие плазмиды Packaging plasmids
Баркодированная ААВ-библиотека Barcoded AAV library
Инъекция мышей и сбор тканей Mice injection and tissue collection
Анализ представленности баркодов в каждой ткани с помощью NGS Analysis of barcode representation in each tissue using NGS
Биораспределение (ДНК-баркоды) Тропизм (РНК-баркоды)
Biodistribution (DNA barcodes) Tropism (RNA barcodes)
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 1. Дизайн эксперимента. ААВ - аденоассоциированный вирус, NGS - секвенирование нового поколения. Fig. 1. Experiment design. AAV, adeno-associated virus; NGS, next-generation sequencing.
Таблица 1. Серотипы аденоассоциированных вирусных векторов (ААВ) и использованные для них баркоды Table 1. Serotypes of adeno-associated virus (AAV) vectors and the corresponding barcodes
ААВ-библиотека AAV library Серотип ААВ AAV serotype Последовательность ДНК баркода (5'-3') DNA barcode sequence (5—3')
L1, L2 sAAB1/sAAV1 TTT GTA GTC GAC
L1, L2 sAAB2/sAAV2 TCA CCT CAA GAC
L1, L2 sAAB3/sAAV3 GTG AGA TAA TGT
L1, L2 sAAB4/sAAV4 ATC ATA AAA GTT
L1 sAAB5/sAAV5 CAT GAT AAT ATG
L1, L2 sAAB6/sAAV6 TCG ACC TCC CCG
L1 AAB2/AAV2 GCA ATT GTG ATG
Таблица составлена авторами / The table is prepared by the authors
репортерного белка (улучшенный зеленый флуоресцентный белок, enhanced green fluorescent protein, EGFP) и с 3'-конца сигналом полиадени-лирования мРНК (poLy(A) signal) (рис. 2).
Для баркодирования плазмид предварительно амплифицировали репортерный ген (eGFP) с использованием 05® High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, США) согласно рекомендациям производителя с помощью пула праймеров, из которых обратные праймеры дополнительно несли различные последовательности бар-кода. Амплифицированные фрагменты клонировали по методу Гибсона с использованием NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB, США) согласно рекомендациям производителя. Полученными плазмидами, содержащими репортерный ген с баркодом, трансформировали компетентные клетки Escherichia coli XL10-Gold (Aligent) и рассевали их на чашки Петри с агари-зованной селективной средой LB (Диаэм, Россия) с антибиотиком. Далее проводили скрининг колоний для подтверждения правильности целевой вставки, после чего наращивали клеточную массу в жидкой питательной среде LB (Диаэм, Россия), выделяли плазмидную ДНК и проводили рестрикционный анализ. Плазмиды, соответствующие требуемой рестрикционной карте, секве-нировали (при участии ЗАО «Евроген», Россия).
Всего было собрано 30 конструкций. Плазмиды с уникальными баркодами использовались для сборки ААВ-библиотек: ААВ-библиотека L1 - с количеством вирусных геномов (вг) 1010; библиотека L2 с количеством вг - 1011.
Сборка ААВ векторов
Для продукции ААВ проводили трансфек-цию клеток НЕК293Т в присутствии PEI 25K (Polysciences, Индия) тремя плазмидами, несущими следующие гены: 1 - целевой ген eGFP; 2 - гены rep и cap ААВ (Cell Biolabs, США); 3 -гены-помощники ААВ (гены аденовируса E4, E2, VA) (Cell Biolabs, США) в соотношении 1:1:1 [20].
Подготовка и проверка плазмид выполнялась по стандартным протоколам культивирования и трансформации E. coli. После трансфекции и инкубации клетки лизировали в щелочном буфере в присутствии бензоназы (ГенТерра, Россия). Очистку клеточного лизата проводили в градиенте йодоксанола (60, 40, 25, 15%) (Sigma-Aldrich, США) с последующим ультрацентрифугированием на центрифуге Optima XPN-80 Ultracentrifuge (Beckman Coulter, США) в течение 90 мин при температуре 10 °С и 360000 g, с последующей стерилизацией фильтрованием.
Для подсчета количества выделенного ААВ (вг/мкл) использовали количественную
Pr F
poiy(A)
Pr R + 12n barcode
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 2. Общая схема баркодирования плазмид. ITR - инвертированные терминальные повторы; CMV - промотор цитомега-ловируса; EGFP - улучшенный зеленый флуоресцентный белок; barcode - баркод; poly(A) - сигнал полиаденилирования; Pr F - прямой праймер; Pr R + 12n barcode - обратный праймер с последовательностью баркода.
Fig. 2. General plasmid barcoding scheme. ITR, inverted terminal repeats; CMV, cytomegalovirus promoter; poly(A), polyadenylation signal; Pr F, forward primer; Pr R + 12n barcode, reverse primer and barcode sequence.
Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo...
полимеразную цепную реакцию (qPCR) со специфическими к инвертированным терминальным повторам праймерами (fwd ITR primer, 5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; rev ITR primer, 5'-CGGCCTCAGTGAGCGA) с красителем Sybr Green (ЗАО «Евроген», Россия). В качестве стандартов использовали серию разведений лианеризо-ванной плазмиды с трансгеном, упакованной в капсид ААВ. Перед началом реакции образец обрабатывали ДНКазой (NEB, США) и подвергали последующему термическому воздействию для разрушения капсидов (95 °С, 10 мин).
Исследование с экспериментальными животными
Исследование проводили на мышах-самцах линии C57BL/6N в возрасте 7 нед. (животные предоставлены НПП «Питомник лабораторных животных» Филиала ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН). Протокол исследования с использованием лабораторных животных был одобрен локальным Биоэтическим комитетом Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (№ 62-д-з от 16.05.2023). Все эксперименты проводили в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях1.
Было сформировано 3 группы животных, в каждой из которых было по 4 мыши: контрольная группа и две экспериментальные. Животным из контрольной группы водили инъекционно PBS, а животным из экспериментальных групп проводили инъекции ААВ-библиотек (L1 и L2).
Подготовка препарата ААВ и инъекции производились в асептических условиях. Препарат разводили в PBS, конечный объем для инъекции составлял 50 мкл. Готовили растворы ААВ для введения мышам в дозах: векторы ААВ-библиотеки L1 - концентрация 1010 вг/животное, ААВ-библиотеки L2 - концентрация 1011 вг/животное. Инъекция проводилась в хвостовую вену со скоростью 1 мл/мин.
Через месяц после инъекций животных подвергали эвтаназии методом дислокации шейных позвонков. Проводили отбор следующих органов: гонады, легкие, головной мозг, скелетная мускулатура, надпочечники, печень, почки, селезенка, сердце, сетчатка глаза, тимус. После извлечения органы помещались в пробирки типа «Эппендорф» объемом 2 мл для последующего анализа.
Подготовка библиотек ДНК и кДНК
ДНК и РНК из органов мышей выделяли с помощью набора для параллельного выделения нуклеиновых кислот HiPure DNA/RNA kit (Magen, Китай). Концентрацию нуклеиновых кислот и наличие примесей оценивали с использованием спектрофотометра NanoDrop™ 2000c (Thermo, США). В качестве опытных образцов для анализа использовали образцы нуклеиновых кислот, выделенных из органов: 88 образцов РНК, 88 образцов ДНК. В качестве контрольных образцов использовали: образцы ААВ-библиотек L1 и L2, которые не вводили животным; отрицательный контроль - 4 образца ДНК и 4 образца РНК, выделенные из органов животных, которым вводили PBS без ААВ; отрицательные контроли всех стадий пробоподготовки - обратная транскрипция (ОТ), 1 стадия ПЦР, 2 стадия ПЦР.
Для получения кДНК использовали набор HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) для синтеза кДНК и удаления геномной ДНК (Vazyme, Китай). Для реакции использовали 1 мкг РНК каждого образца; проводили постановку 1 раунда ПЦР. Праймеры были сконструированы таким образом, чтобы З'-концы были комплементарны фланкирующей баркод области GFP, а 5'-концы несли последовательности универсальных адаптеров, аналогичных последовательностям набора Nextera XT DNA Library Prep Kit (ILLumina, США).
ПЦР проводили с помощью 05® High-FideLity PCR Kit (NEB, США) согласно инструкции производителя. Количество циклов амплификации составляло 20 и было определено в рамках контрольных экспериментов с помощью постановки ПЦР в реальном времени - 200 нг геномной ДНК, выделенной из разных органов, в присутствии флуоресцентного красителя EvaGreen (Biotium, США). Для образцов всех органов показатель количества циклов амплификации (Cq) не превышал 20.
Секвенирование
Секвенирование полученных библиотек проводили с использованием платформы MiSeq (ILLumina, США) с помощью набора реагентов MiSeq Reagent Kit v2 (З00 cycLes).
Биоинформатический анализ результатов секвенирования
Парные чтения, полученные после секвенирования в формате fastq, были картированы на референс с помощью программы
1 Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used
for scientific purposes. https://eur-lex.europa.eu/eli/dir/2010/63/oj
minimap2 v.2.26-r1175 [21]. Референс содержал последовательность исходной плазмиды, кодирующей последовательность EGFP и регулятор-ных элементов (EGFP, ITR), в котором последовательность баркода длиной 12 нуклеотидов кодировалась с помощью 12 символов N (табл. 1). Полученные bam-файлы были отсортированы и индексированы с помощью программы SamtooLs v.1.172, а затем анализировались с использованием программного обеспечения Jupyter Notebook (python v.3.10.11, библиотеки pysam v.0.21.0, biopython v.1.81 [22]). Сначала выделялись участки чтений, картированные на баркод, затем проводилось попарное выравнивание каждого из этих участков (с длиной больше 5 нуклеотидов) с каждой из референсных последовательностей баркодов с помощью класса PairwiseALigner (параметры scoring = «bLastn», mode = «global») из модуля ALign пакета Biopython3. Чтобы отсечь возможные баркоды низкого качества, было сгенерировано 100 случайных баркодов и осуществлялось выравнивание с каждым из этих вариантов. В случае если участок чтения имел скор выравнивания (числовая оценка, отражающая степень сходства между двумя последовательностями) на баркод вируса выше, чем на случайный, то вариант вируса считался детектированным. Для каждой библиотеки (ДНК исходной ААВ-библиотеки; ДНК или РНК, выделенные из ткани или органа мыши) оценивалось количество каждого из вариантов вируса, при этом в случае, когда левое и правое прочтение детектировали отличающиеся баркоды (таких оказалось всего 3 пары чтений для всех библиотек), пара исключалась из рассмотрения.
Оценка относительного количества баркодов в ААВ-библиотеке
Оценка относительного количества производилась независимо для каждого органа или ткани с учетом распределения вирусов (баркодов) исходной ААВ-библиотеки. Анализ проводился в RStudio (R v.4.3.1)4 c помощью пакетов stats v.4.3.1 и ggpLot2 v.3.4.2. Оценка числа детектированных баркодов проводилась с помощью обобщенной линейной модели (функция gLm, famiLy = «poisson») по формуле (1):
B - V + L + Ln(N ь) + Ln(N, /N, б ) - 1, (1)
4 ткан^ 4 Lвирус Lоoщ/ ' 4 '
где, B - число детектированных баркодов конкретного варианта вируса (число ДНК-баркодов
при оценке биораспределения; число РНК-баркодов при оценке тропизма); V - категориальная переменная, которая отражает эффективность варианта вируса в ткани или органе (усредненную по двум ААВ-библиотекам); L -поправка на ААВ-библиотеку - 1010 вг, L2 - 1011 вг); N - общее количество барко-
п ткань г
дов, детектированных в образце ткани; ^ и - количество баркодов варианта вируса и общее количество баркодов, соответственно, в исходной ААВ-библиотеке.
Эффективность трансдукции - способность вируса проникать в клетки и приводить к экспрессии трансгена - величина, представляющая собой тропизм с коррекцией на биораспределение, а в логарифмическом масштабе - разность между вирусной нагрузкой на ткань и показателем эффективности трансдукции вирусом этой ткани. Для лучшей оценки эффективности трансдукции, позволяющей определить стандартную ошибку как в отдельных дата поинтах, так и среднюю, применялась следующая формула (2):
B » V + RNAy + L + Ln^J +
Ln(NLвирус/NLобш) 1
(2)
Lвирус Lо6щ'
где B - число детектированных баркодов конкретного варианта вируса (ДНК-баркоды и РНК-баркоды варианта вируса в ткани); V и RNAy - категориальные переменные, отражающие биораспределение и эффективность трансдукции, соответственно, серотипа вируса в ткани/органе (усредненную по двум библиотекам). Переменная RNA имеет ненулевое значение, только когда B - РНК-баркоды (для ДНК-баркодов всех вирусов переменная имеет одно значение - «DNA»). Параметры L, N , N.
' Г г ' ткань' Lвирус
и NL()6l4 те же, что и в предыдущей модели.
При сравнении вирусов между собой проводилась оценка отдельно для каждой библиотеки и мыши (без параметра L в формуле, с оценкой параметра V на соответствующем подмножестве данных). Стандартные ошибки оценки параметров определяли с помощью функции «summary» в RStudio (R v.4.3.1)5. При графической визуализации значения биораспределения (рис. 5, 6) или тропизма (рис. 7, 8) менее минус 5 были обрезаны до этой точки, а стандартная ошибка установлена как 0. В каждом графике (диаграмма «ящик с усами») (рис. 3-10) использовали следующие элементы:центральная линия - медиана; границы «ящика» - верхний и нижний квартили;
2 https://www.htsLib.o rg /
3 https://biopython.org/
4 https://posit.co/downLoad/rstudio-desktop/
5 Там же.
Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo...
черные линии («усы») - 1,5-интерквартильный размах; вертикальные красные линии - стандартная ошибка среднего; черные точки - статистические выбросы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сборка баркодированных ААВ-библиотек
Секвенирование показало, что 15 из 30 отправленных на секвенирование плазмид, кодирующих EGFP, содержали подтвержденные 12-нуклеотидные баркоды. Среди этих 15 образцов плазмид не было обнаружено повторения баркода. Далее из этих подтвержденных секве-нированием образцов были отобраны 7 плазмид с баркодами, которые в дальнейшем использовались для сборки различных серотипов ААВ векторов (табл. 1).
Указанные серотипы использовались для составления двух ААВ-библиотек (1_1 и 1_2): 1_1 вклю -чала в себя 7 серотипов ААВ, 1_2 - 5 серотипов (табл. 1). Для составления обеих библиотек использовались различные серотипы векторов в равном соотношении. Для инъекционного введения мышам использовали количество вирусных геномов, равное в случае ААВ-библиотеки 1_1 - 1010 вг на животное, для 1_2 - 1011 вг на животное.
Контроль качества ААВ-библиотек для секвенирования
Перед пробоподготовкой проводилась спектрофотометрическая оценка качества ДНК и РНК по показателю соотношений длин волн. Значения поглощения (А) 260/280 и 260/230 нм соответствовали приемлемым для ампликоновой пробоподготовки образцов высокопроизводительного секвенирования (1,8-2,0 и 2,0-2,2 соответственно). Финальный контроль размера ААВ-библиотек проводили с помощью капиллярного электрофреза (био-аналайзера) ОБер 100 (ВЮрйс, Китай). Размер ААВ-библиотек соответствовал ожидаемым для продукта второго раунда амплификации (продукт 1 раунда + размер индекс-адаптерных последовательностей) с учетом погрешности измерения. В результате оптимизированной про-боподготовки удалось избавиться от коротких димеров праймеров и адаптеров (~150 по), критически влияющих на расчет реакции секвенирования и дальнейший анализ данных.
Анализ биораспределения и тропизма
В связи с тем что активность используемого в данной работе CMV промотора (рис. 2) варьирует в различных тканях организма, подход, предложенный авторами, заключался в сравне-
нии биораспределения и тропизма различных серотипов ААВ в пределах отдельной ткани.
В настоящей работе термин «биораспределение» используется для описания способности вируса достигать ткани и оценивается по количеству ДНК. Достижение вирусом ткани не означает его проникновение в клетки, так как вирусы могут находиться на поверхности клеток. Термин «тропизм» в данной работе используется для описания способности вируса заражать ткань (достигать клетки, проникать в ядро и приводить к экспрессии трансгена) и оценивается по количеству РНК. Термин «эффективность трансдукции» обозначает способность вируса, достигнув ткани, заразить ее, и оценивается по количеству РНК с поправкой на количество ДНК вируса в ткани.
В рамках данного подхода количественное сравнение биораспределения и тропизма используемых серотипов ААВ между различными тканями/органами представлялось невозможным.
Для исследования биораспределения оценивалось количество вирусных ДНК-баркодов в целевых тканях и органах мышей (как описано в разделе «Материалы и методы»). По результатам анализа секвенирования удалось обнаружить ДНК-баркоды каждой из ААВ-библиотек в каждом из проанализированных образцов органов/тканей (рис. 3). Полученный результат свидетельствует о том, что количество вирусной ДНК в каждом образце оказалось достаточным для проведения амплификации и дальнейшего секвенирования ампликонов.
Следует отметить, что количество ДНК-баркодов в образцах мозга мышей было достаточное для анализа, однако оно было меньше (статистически значимо) относительно среднего числа ДНК-баркодов, обнаруженных в других органах (р=0,002, двусторонний тест Вилкоксона). Вероятно, обнаруженные в образцах мозга ДНК-баркоды являются остаточной ДНК, локализованной на стенках сосудов головного мозга мышей. Таким образом, протестированные в данной работе серотипы ААВ не способны преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).
Для исследования тропизма проводилась оценка количества вирусных РНК-баркодов в целевых тканях и органах мышей (рис. 4). Был установлен порог минимального количества детектированных баркодов, равный 10 (красная пунктирная линия на рис. 4), и в рассмотрение включались только те ткани, для которых нижний квартиль числа детектированных баркодов был выше 1. Таким образом, для ААВ-библиотеки 1_1, содержащей меньшее количество ААВ (1010 вг), удалось детектировать
3,0-
ï с
2,5-
§ Q
2,0
- S 1,5-
1,0-
ААВ-библиотека AAV library
L1
■ L2
Мышь (номер в группе) Mouse (number in group)
• Ml
• M2
• M3
• M4
Гон Легк Мозг Мышц Надп Печ Поч Gon Lu Brn Mus AG Liv Kid Орган Organ
Сел Серд Сетч Тим Spl Hrt Ret Thms
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 3. Биораспределение аденоассоциированного вируса (ААВ) в образцах органов и тканей мышей по количеству ДНК-баркодов после инъекционного введения ААВ-библиотек L1 или L2. По оси Х указаны органы/ткани: Гон - гонады, Легк - легкие, Мозг - головной мозг, Мышц - скелетная мускулатура, Надп - надпочечники, Печ - печень, Поч - почка, Сел - селезенка, Серд - сердце, Сетч - сетчатка глаза, Тим - тимус. По оси Y указан десятичный логарифм количества ДНК-баркодов каждой из ААВ-библиотек в каждом из проанализированных образцов органов/тканей. В легенде указаны ААВ-библиотеки и порядковый номер мыши в группе (для каждой экспериментальной группы n=4). Черными линиями показан 1,5-интерквартильный размах.
Fig. 3. Adeno-associated virus (AAV) biodistribution in mouse organs and tissues by the quantity of DNA barcodes after injection of AAV Libraries L1 or L2. The X-axis indicates organs/tissues: Gon, gonads; Lu, Lungs; Brn, brain; Mus, skeletal muscles; AG, adrenal glands; Liv, Liver; Kid, kidney; SpL, spleen; Hrt, heart; Ret, retina; Thms, thymus. The Y-axis indicates the decimal Logarithm of the quantity of DNA barcodes from each AAV Library in each of the organ/tissue sampLes anaLysed. The Legend indicates the AAV Library and the sequentiaL number of the mouse in the group (for each experimentaL group, n=4). BLack Lines show the 1.5-interquartiLe range.
РНК-баркоды на достаточном уровне только в случае четырех тканей: скелетная мускулатура, сердце, печень и надпочечники. Для ААВ-библиотеки L2, содержащей 1011 вг, как и ожидалось, эффективная трансдукция по детектируемому количеству РНК-баркодов (у всех мышей группы) зарегистрирована в большем количестве органов/ тканей - дополнительно к вышеуказанным, в почках и гонадах (рис. 4).
Показано практически полное отсутствие экспрессии вирусной РНК в образцах головного мозга и селезенки мышей при использовании обеих ААВ-библиотек. В случае головного мозга отсутствие экспрессии связано, по-видимому, с неспособностью используемых ААВ преодолевать ГЭБ; в случае селезенки возможно влияние других факторов, так как проникновение ААВ в селезенку было подтверждено высоким содержанием ДНК-баркодов в органе.
Анализ биораспределения и тропизма в печени и надпочечниках
Результаты анализа биораспределения показывают высокую согласованность результатов как внутри, так и между ААВ-библиоте-ками (рис. 5, 6), что позволяет определить се-
ротипы ААВ, способные наиболее эффективно достигать печени и надпочечников ^ААВ5 и sААВ2 соответственно).
Результаты анализа тропизма продемонстрировали высокую согласованность для большей части серотипов ААВ (рис. 7, 8). Следует отметить, что для серотипа sAAВ2 в надпочечниках и печени имеется значительное расхождение результатов между библиотеками L1 и L2, что, возможно, объясняется небольшим количеством повторов.
Оценка тропизма имеет большое прикладное значение для выбора серотипа ААВ, позволяющего добиться наибольшей экспрессии трансгена в ткани-мишени. Так, среди протестированных серотипов ААВ наиболее перспективным для генной терапии заболеваний, связанных с печенью (например, гемофилии А, В и С), является sAAВ5 (рис. 7), а для заболеваний, связанных с надпочечниками (например, для врожденной дисфункции коры надпочечников) - sAAВ2 и sAAВ6 (рис. 8).
Анализ эффективности трансдукции в печени и надпочечниках
Численные значения, полученные в результате оценки биораспределения и тропизма,
Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo...
3,0-
2,0-
ü
§
ос +
1,0-.-
o
I
f
л
0,0
V
If
ААВ-библиотека AAV library
$ L1
m L2
Мышь (номер в группе) Mouse (number in group)
• Ml
• M2
• M3
• M4
Гон Легк Мозг Мышц Надп Печ Поч Сел Серд Сетч Тим Gon Lu Brn Mus AG Liv Kid Spl Hrt Ret Thms Орган Organ
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 4. Тропизм вариантов аденоассоциированного вируса (ААВ) к органам и тканям мышей после инъекционного введения ААВ-библиотек L1 или L2. По оси Х указаны органы/ткани: Гон - гонады, Легк - легкие, Мозг - головной мозг, Мышц - скелетная мускулатура, Надп - надпочечники, Печ - печень, Поч - почка, Сел - селезенка, Серд - сердце, Сетч - сетчатка глаза, Тим - тимус. По оси Y указан десятичный логарифм количества РНК-баркодов каждой из ААВ-библиотек в каждом из проанализированных образцов органов/тканей. В легенде указаны ААВ-библиотеки и порядковый номер мыши в группе (для каждой экспериментальной группы n=4). Черными линиями показан 1,5-интерквартильный размах. Красная пунктирная линия соответствует 9 детектированным баркодам - условная отсечка минимального количества баркодов, допускающая сравнение между серотипами вируса.
Fig. 4. Tropism of adeno-associated virus (AAV) variants to mouse organs and tissues after injection of AAV Libraries L1 or L2. The X-axis indicates organs/tissues: Gon, gonads; Lu, Lungs; Brn, brain; Mus, skeletal muscles; AG, adrenal glands; Liv, Liver; Kid, kidney; SpL, spleen; Hrt, heart; Ret, retina; Thms, thymus. The Y-axis indicates the decimal Logarithm of the quantity of RNA barcodes from each AAV Library in each of the organ/tissue sampLes anaLysed. The Legend indicates the AAV Library and the sequentiaL number of the mouse in the group (for each experimentaL group, n=4). BLack Lines show the 1.5-interquartiLe range. The red dotted Line corresponds to 9 detected barcodes and represents a cutoff for the minimum quantity of barcodes that aLLows for comparison between virus serotypes.
представлены в логарифмическом масштабе, поэтому положительные значения указывают на повышенную эффективность трансдукции относительно ожидаемой, а отрицательные -на пониженную.
На рисунке 9 (опубликован на сайте журнала6) можно видеть, что серотип sAAВ3 обладает пониженной эффективностью трансдукции в печени относительно ожидаемой. Не удалось выявить варианты ААВ, обладающие достоверно повышенной эффективностью трансдукцией печени. Так, несмотря на положительные медианные значения эффективности трансдукции у sААВ1, наблюдались большие разбросы между образцами, полученными от разных животных. Вариант sAAВ6 обладал повышенной относительно ожидаемой в 100 раз эффективностью трансдукции в надпочечниках (рис. 10, опубликован на сайте журнала7), что делает его одним из наиболее эффективных для этого органа, несмотря на низкое количество ДНК (рис. 6). Представленные результаты указывают
на принципиальную важность проведения исследований по характеризации ААВ-библиотек не только на уровне ДНК, но и на уровне матричной РНК.
Результаты оценки биораспределения и эффективности трансдукции in vivo при использовании ААВ векторов
Разработанная методика оценки биораспределения, тропизма и эффективности трансдукции ААВ-библиотек позволяет эффективно выявлять серотипы ААВ, наиболее перспективные для терапии конкретного органа или ткани. Однако получаемые численные значения, характеризующие эти параметры, могут быть сравнены друг с другом только в рамках конкретного органа или ткани, но не между ними. Это является ограничением данной работы. В связи с этим в дальнейших исследованиях планируется оценивать абсолютные количества вирусной ДНК и РНК с помощью количественной ПЦР с нормализацией на единицу
6 https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-2-215-228-suppl
7 Там же.
sAAB5
sAAV5
sAAB3
sAAV3
sAAB6
В А А т С ai ir a sAAV6 sAAB4
ниа vVA ro В sAAV4 AAB2 AAV2
sAAB2
sAAV2
sAAB1
sAAV1
2 I и Г
-» 1 »
——
-4
fe •- --4 -|Mp 1 ь—
ААВ-библиотека AAV library
ffl L1
В L2
Мышь (номер в группе) Mouse (number in group)
-•- Ml M2 -•- M3 -•- M4
-4 -2 0
Lg [1 + Количество ДНК-баркодов] Log10 [1 + DNA barcode quantity]
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 5. Количество детектированных ДНК-баркодов в образцах печени после инъекционного введения мышам библиотек аденоассоциированного вируса (ААВ) L1 или L2. Вертикальные красные линии отражают стандартную ошибку среднего для каждого из серотипов ААВ. В легенде указаны ААВ-библиотеки и порядковый номер мыши в группе (для каждой экспериментальной группы n=4). Серотипы вирусов по оси Y упорядочены по убыванию вирусной нагрузки.
Fig. 5. Quantity of detected DNA barcodes in liver samples after injection of adeno-associated virus (AAV) libraries L1 or L2 into mice. Vertical red lines represent the standard error of the mean for each AAV serotype. The legend indicates the AAV library and the sequential number of the mouse in the group (for each experimental group, n=4). The Y-axis lists virus serotypes in descending order by viral load.
< с А ai
аи V
С
го
В
sAAB2 sAAV2
sAAB3 sAAV3
sAAB5 sAAV5
sAAB4 sAAV4
AAB2 AAV2
sAAB6 sAAV6
sAAB1 sAAV1
- А J г.
Ч
Г 4Г rHi
1 -1 1 >" •аа- Ц
ААВ-библиотека AAV library
L1 L2
Мышь (номер в группе) Mouse (number in group)
M1 M2 -е- M3 M4
-4 -2 0
Lg [1 + Количество ДНК-баркодов] Log10 [1 + DNA barcode quantity]
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 6. Количество детектированных ДНК-баркодов в образцах надпочечников после инъекционного введения мышам библиотек аденоассоциированного вируса (ААВ) L1 или L2. Вертикальные красные линии отражают стандартную ошибку среднего для каждого из серотипов ААВ. В легенде указаны ААВ-библиотеки и порядковый номер мыши в группе (для каждой экспериментальной группы n=4). Серотипы вирусов по оси Y упорядочены по убыванию вирусной нагрузки.
Fig. 6. Quantity of detected DNA barcodes in adrenal samples after injection of adeno-associated virus (AAV) libraries L1 or L2 into mice. Vertical red lines represent the standard error of the mean for each AAV serotype. The legend indicates the AAV library and the sequential number of the mouse in the group (for each experimental group, n=4). The Y-axis lists virus serotypes in descending order by viral load.
генома клетки и экспрессию генов домашнего хозяйства (например, GAPDH) соответственно. Однако различные ткани обладают разными уровнями экспрессии GAPDH, что может
привести к систематической ошибке. Несмотря на наличие различных подходов к характери-зации ААВ, описанных в литературе [16-19], эта проблема остается нерешенной.
Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo...
"5
< с
< -S
ср го СП
4
-А-в*
-•-
-
1 1 1 г - «—
ААВ-библиотека AAV library ffl" L1
• L2
Мышь (номер в группе) Mouse (number in group)
-•- Ml M2 -•- M3 -•- M4
sAAB5 sAAV5
sAAB3 sAAV3
sAAB6 sAAV6
sAAB4 sAAV4
AAB2 AAV2
sAAB2 sAAV2
sAABl sAAV1
-4 -2 0
Lg [1 + Количество РНК-баркодов] Log10 [1 + RNA barcode quantity]
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 7. Количество детектированных РНК-баркодов в образцах печени после инъекционного введения мышам библиотек аденоассоциированного вируса (ААВ) L1 или L2. Вертикальные красные полосы отражают стандартную ошибку среднего для каждого из серотипов ААВ. В легенде указаны ААВ-библиотеки и порядковый номер мыши в группе (для каждой экспериментальной группы n=4). Серотипы вирусов по оси Yупорядочены как на рис. 5.
Fig. 7. Quantity of detected RNA barcodes in Liver sampLes after injection of adeno-associated virus (AAV) Libraries L1 or L2 into mice. VerticaL red Lines represent the standard error of the mean for each AAV serotype. The Legend indicates the AAV Library and the sequentiaL number of the mouse in the group (for each experimentaL group, n=4). Virus serotypes on the Y-axis are ordered as in Fig. 5.
В
А А
аи V ср го
sAAB2 sAAV2
sAAB3 sAAV3
sAAB5 sAAV5
sAAB4 sAAV4
AAB2 AAV2
sAAB6 sAAV6
sAAB1 sAAV1
зьв —»
Ш я-
т- ф-JL
-чц # •
щ h»-
¿Г
. 4
t
ААВ-библиотека AAV library
ffl" L1
• L2
Мышь (номер в группе) Mouse (number in group)
M1 -•- M2 -•- M3 M4
-4 -2 0
Lg [1 + Количество РНК-баркодов] Log10 [1 + RNA barcode quantity]
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 8. Количество детектированных РНК-баркодов в образцах надпочечников после инъекционного введения мышам библиотек аденоассоциированного вируса (ААВ) L1 или L2. Вертикальные красные полосы отражают стандартную ошибку среднего для каждого из серотипов ААВ. В легенде указаны ААВ-библиотеки и порядковый номер мыши в группе (для каждой экспериментальной группы n=4). Серотипы вирусов по оси Yупорядочены как на рис. 6.
Fig. 8. Quantity of detected RNA barcodes in adrenaL sampLes after injection of adeno-associated virus (AAV) Libraries L1 or L2 into mice. VerticaL red Lines represent the standard error of the mean for each AAV serotype. The Legend indicates the AAV Library and the sequentiaL number of the mouse in the group (for each experimentaL group, n=4). Virus serotypes on the Y-axis are ordered as in Fig. 6.
На рисунках 11 и 12 (опубликованы на сайте журнала8) представлены обобщенные данные по биораспределению и тропизму вариантов
ААВ в исследованных органах и тканях. При интерпретации графиков необходимо иметь в виду, что они построены на основе сравнения
Там же.
вариантов вирусов в каждом органе/ткани независимо. Графики не отражают абсолютных значений, поэтому прямое сравнение значений по отдельным органам между собой невозможно. Из представленных данных видно, что некоторые серотипы ААВ обладают широким биораспределением и тропизмом (например, sAAB5, рис. 119), в то время как другие обладают относительной специфичностью, например sAAB2 более эффективен для трансдукции в надпочечниках (рис. 1110). В целом серотипы с широким биораспределением демонстрируют и широкий тропизм.
ВЫВОДЫ
1. Разработан метод биоинформатической оценки библиотек синтетических векторов на основе аденоассоциированного вируса различных серотипов для исследования биораспределения и эффективности трансдукции in vivo.
Литература/References
1. Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-78.
https://doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9
2. Srivastava A. In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors. Curr Opin Virol. 2016;21:75-80. https://doi.org/10.1016/jxoviro.2016.08.003
3. Paneda A, Vanrell L, Mauleon I, Crettaz JS, Berraondo P, Timmermans EJ, et al. Effect of adeno-associated virus serotype and genomic structure on liver transduction and biodistribution in mice of both genders. Hum Gene Ther. 2009;20(8):908-17. https://doi.org/10.1089/hum.2009.031
4. Hauck B, Xiao W. Characterization of tissue tropism determinants of adeno-associated virus type 1. J Virol. 2003;77(4):2768-74.
https://doi.org/10.1128/jvi.77A2768-2774.2003
5. Han J, Zhu L, Zhang J, Guo L, Sun X, Huang C, et al. Rational engineering of adeno-associated virus capsid enhances human hepatocyte tropism and reduces immunogenicity. Cell Prolif. 2022;55(12):e13339. https://doi.org/10.1111/cpr.13339
6. Li C, Samulski RJ. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 2020;21(4):255-72. https://doi.org/10.1038/s41576-019-0205-4
7. Rode L, Bär C, Groß S, Rossi A, Meumann N, Viereck J, et al. AAV capsid engineering identified two novel variants with improved in vivo tropism for cardiomyocytes. Mol Ther. 2022;30(12):3601-18.
https://doi.org /10.1016/j.ymthe.2022.07.003
8. Ghauri MS, Ou L. AAV engineering for improving tropism to the central nervous system. Biology (Basel). 2023;12(2):186. https://doi.org/10.3390/biology12020186
9. Drouyer M, Chu TH, Labit E, Haase F, Navarro RG, Nazareth D, et al. Novel AAV variants with improved tropism for human Schwann cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2024;32(2):101234.
https://doi.org /10.1016/j.omtm.2024.101234
10. Gigout L, Rebollo P, Clement N, Warrington KH, Muzyczka N, Linden RM, et al. Altering AAV tropism with mosaic viral capsids. Mol Ther. 2005;11(6):856-65.
https://doi.org /10.1016/j.ymthe.2005.03.005
11. Wu Z, Asokan A, Grieger JC, Govindasamy L, Agbandje-McKenna M, Samulski RJ. Single amino acid changes
Предложенный метод характеризуется высокой производительностью, экономичностью и возможностью быстрого отбора векторов с желаемыми характеристиками для проведения генной терапии, что позволит ускорить и оптимизировать разработку генотерапевтических препаратов.
2. Показана согласованность результатов как внутри, так и между библиотеками синтетических векторов, что имеет большое значение с точки зрения верификации методики. Однако требуется проведение дальнейших исследований на большем массиве данных.
3. Выявлены серотипы аденоассоциирован-ного вируса с наиболее оптимальными характеристиками биораспределения и эффективности трансдукции in vivo. Так, при анализе эффективности трансдукции показано, что наиболее перспективным для генной терапии заболеваний печени является sAAВ5, а для заболеваний надпочечников - sAAВ2 и sAAВ6.
can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 2006;80(22):11393-7. https://doi.org/10.1128/jvi.01288-06
12. Asokan A, Conway JC, Phillips JL, Li C, Hegge J, Sinnott R, et al. Reengineering a receptor footprint of adeno-associ-ated virus enables selective and systemic gene transfer to muscle. Nat Biotechnol. 2010;28(1):79-82. https://doi.org/10.1038/nbt.1599
13. Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(18):11854-9. https://doi.org/10.1073/pnas.182412299
14. Gao G, Vandenberghe LH, Alvira MR, Lu Y, Calcedo R, Zhou X, et al. Clades of adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J Virol. 2004;78(12):6381-8. https://doi.org/10.1128/jvi.78.12.6381-6388.2004
15. Zinn E, Pacouret S, Khaychuk V, Turunen HT, Carvalho LS, Andres-Mateos E, et al. In silico reconstruction of the viral evolutionary lineage yields a potent gene therapy vector. Cell Rep. 2015;12(6):1056-8. https://doi.org/10.1016/jxelrep.2015.07.019
16. Szumska J, Grimm D. Boosters for adeno-associated virus (AAV) vector (r)evolution. Cytotherapy. 2023;25(3):254-60. https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2022.07.005
17. Adachi K, Enoki T, Kawano Y, Veraz M, Nakai H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun. 2014;5:3075.
https://doi.org/10.1038/ncomms4075
18. Marsic D, Govindasamy L, Currlin S, Markusic DM, Tseng YS, Herzog RW, et al. Vector design Tour de Force: integrating combinatorial and rational approaches to derive novel ad-eno-associated virus variants. Mol Ther. 2014;22(11):1900-9. https://doi.org/10.1038/mt.2014.139
19. Weinmann J, Weis S, Sippel J, Tulalamba W, Remes A, El An-dari J, et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nat Commun. 2020;11(1):5432. https://doi.org/10.1038/s41467-020-19230-w
20. Grimm D, Lee JS, Wang L, Desai T, Akache B, Storm TA, et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-asso-
9 https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-2-200-213-suppL
10 Там же.
Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo...
ciated viruses. J Virol. 2008;82(12):5887-911. https://doi.org/10.1128/jvi.00254-08 21. Li H. Minimap2: Pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 2018;34(18):3094-3100. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty191
22. Cock PJA, Antao T, Chang JT, Chapman BA, Cox CJ, Dalke A, et al. Biopython: Freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics. Bioinformatics. 2009;25(11):1422-3. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp163
Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Д.О. Максимов - концепция работы, обработка экспериментальных результатов, подготовка иллюстративного материала; Д.А. Наумова - анализ и систематизация источников литературы, формулировка выводов; Е.А. Астахова - анализ источников литературы, участие в формулировке выводов; В.В. Артемьев - анализ источников литературы, сборка баркодирован-ных конструкций; С.А. Бирюков - сборка векторов на основе аденоассоциированного вируса; И.С. Абрамов - проведение секвенирования; A.A. Навойкова -подготовка плазмид, отработка методов; Н.В. Рудев - проведение исследований с лабораторными животными; С.Г. Феоктистова - сборка баркодиро-ванных конструкций, подготовка рукописи; О.В. Глазова - организация и проведение экспериментов с животными, забор биоматериала, выделение и анализ нуклеиновых кислот; О.Н. Митяева - планирование экспериментов; утверждение окончательной версии рукописи для публикации; П.Ю. Волчков - утверждение окончательной версии рукописи для публикации. Соответствие принципам этики. Экспериментальные исследования с животными проводились в соответствии с Директивой 2010/63/Eu. Протокол исследования был одобрен локальным Биоэтическим комитетом Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (№ 62-д-з от 16.05.2023).
Authors' contributions. AH the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. D.O. Maksimov conceptualised the study, processed the experimental results, and prepared the illustrative material. D.A. Naumova analysed and collated literature and formulated the conclusions. E.A. Astakhova analysed literature and formulated the conclusions. V.V. Artemev analysed literature and assembled the barcoded constructs. S.A. Biryukov assembled the AAV vectors. I.S. Abramov performed sequencing. A.A. Navoikova prepared the plasmids and refined the methods. N.V. Rudev conducted the experiments with laboratory animals. S.G. Feoktistova assembled the barcoded constructs and prepared the manuscript. O.V. Glazova organised and conducted the experiments with laboratory animals, collected biomaterial specimens, isolated and analysed nucleic acids. O.N. Mityaeva planned the experiments, approved the final version of the manuscript for publication. P.Yu. Volchkov approved the final version of the manuscript for publication.
Ethics approval. The animals were housed and used for experimental procedures in compliance with Directive 2010/63/EU and the recommendations of the Local Bio-ethics Committee, Lomonosov Moscow State University (Ethics Approval 62-d-z of 16.05.2023).
Об авторах / Authors
Максимов Денис Олегович / Denis O. Maksimov
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2937-6082 Наумова Дарья Алексеевна / Daria A. Naumova ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1242-2046 Астахова Екатерина Андреевна / Ekaterina A. Astakhova ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4737-5892 Артемьев Валентин Владимирович / Valentin V. Artemev ORCID: https://orcid.org/0009-0001-1774-6656
Бирюков Станислав Анатольевич, д-р физ.-мат. наук / Stanislav A. Biryukov, Dr. Sci. (Phys. and Math.)
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5662-3651
Абрамов Иван Сергеевич / Ivan S. Abramov
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6954-1564
Навойкова Анна Александровна / Anna A. Navoikova
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0224-1396
Рудев Николай Валерьевич / Nikolai V. Rudev
ORCID: https://orcid.org/0009-0000-2379-0218
Феоктистова Софья Гумаровна / Sofia G. Feoktistova
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7608-439X
Глазова Ольга Владимировна / Olga V. Glazova
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7199-1866
Митяева Ольга Николаевна, канд. биол. наук / Olga N. Mityaeva, Cand. Sci. (Biol.) ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9252-1601
Волчков Павел Юрьевич, канд. биол. наук / Pavel Yu. Volchkov, Cand. Sci. (Biol.) ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9794-6297
Поступила 15.04.2024 Received 15 April 2024
После доработки 11.06.2024 Revised 11 June 2024
Принята к публикации 21.06.2024 Accepted 21 June 2024
