РАЗРАБОТКА НОВОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ C. TETANI Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Ветеринарный врач. 2024. № 1. С. 74 - 79 The Veterinarian. 2024; (1): 74 - 79

Научная статья УДК 57.053.134

DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_1_74

РАЗРАБОТКА НОВОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ C. TETANI

Алевтина Борисовна Бридня1, ala.a1976@mail.ru

Андрей Владимирович Капустин 3, доктор биологических наук, kapustin_andrei@mail.ru Сергей Александрович Шеметюк2, кандидат биологических наук, ssa@biok.ru Алексей Владимирович Мищенко3, доктор ветеринарных наук, studebaker@yandex.ru Анна Борисовна Юровчик1, кандидат биологических наук, ann-yurovchik@yandex.ru Алексей Иванович Албулов4, доктор биологических наук, info@bioprogress.ru

1ФКП «Курская биофабрика - фирма Биок», Курск, Российская Федерация.

2ФГБОУ ВО «Курский государственный аграрный университет», Курск, Российская Федерация. 3ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии наук», Москва, Российская Федерация. 4ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности», Московская область, Российская Федерация.

Автор, ответственный за переписку: Алевтина Борисовна Бридня

Аннотация. В статье изложен краткий теоретический материал об особенностях выращивания C. tetani, а также освещены основные факторы и их влияние на накопление токсина. Сформулирована цель, и обоснована необходимость исследования, по итогу которого представлены результаты усовершенствования состава питательной среды для создания оптимальных условий культивирования C. tetani и обеспечения накопления бактериальной массы возбудителя в определенные сроки. В опыте были опробированы три разных рецепта питательных сред для культивирования C. tetani: среда с удвоенным количеством кислотного гидролизата казеина, среда с одинарным количеством кислотного гид-ролизата казеина и среда на основе белкового гидролизата из мышечной ткани пушных зверей производства ФГБНУ ВНИТИБП. В качестве сравнительного анализа осуществлялись посевы производственного штамма C. tetani Kolle-8. Культивирование производили на питательной среде в биобутылях при температуре 350С. Определение активности накопленного токсина проводили на белых мышах ежедневно в течение 10 дней. Все полученные результаты сведены в таблицу, а основные результаты влияния корректировки водородного показателя (рН) на токсинообразование представлены в виде графиков. Установлено, что в результате использования новой рецептуры питательной среды на основе белкового гидролизата из мышечной ткани пушных зверей, а также при ежедневном контроле рН и, при необходимости, его корректировке (каждые двое суток) при помощи 15% NaHCO3 до показателя 6,96, наблюдали умеренный рост бактерий, увеличение пено- и газообразования, помутнение среды и параллельно увеличение титра токсина при контроле на мышах на 9-10 сутки до 1:5000 - 1:10000 (Dlm/мл).

Ключевые слова: клостридии, столбняк, штамм Kolle-8 C. tetani, токсин, токсинообразование, вакцина, культивирование, питательная среда

Для цитирования: Бридня А.Б., Капустин А.В., Шеметюк С.А., Мищенко А.В., Юровчик А.Б., Албулов А.И. Разработка новой питательной среды для культивирования C. tetani // Ветеринарный врач. 2024. № 1. С. 74 - 79. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_1_74

DEVELOPMENT OF A NEW NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION OF

C. TETANI

Alevtina B. Bridnya1, ala.a1976@mail.ru;

Andrey V. Kapustin 3, doctor of biological sciences, kapustin_andrei@mail.ru Sergey A. Shemetyuk2, candidate of biological sciences, ssa@biok.ru Alexey V. Mishchenko3, doctor of veterinary sciences, studebaker@yandex.ru

Anna Borisovna Yurovchik1, candidate of biological sciences, ann-yurovchik@yandex.ru Alexey Ivanovich Albulov4, doctor of biological sciences, info@bioprogress.ru

1FKP "Kursk Biofactory - firm Biok", Kursk, Russian Federation 2Kursk State Agrarian University, Kursk, Russian Federation

3All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Y. R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation

4All-Russian Scientific Research and Technological Institute of Biological Industry, Moscow region, Russian Federation

Corresponding author: Alevtina B. Bridnya

Abstract. The article presents a brief theoretical material about the peculiarities of C. tetani cultivation, and the main factors which influence on the toxin accumulation. The formulated purpose and the research necessity the results of improving the composition of the nutrient medium to create the optimal conditions for the C. tetani cultivation and to ensure the accumulation of the bacterial mass of the pathogen in short time. During the experiment, there were three different recipes of nutrient media for the C. tetani cultivation tested: medium with twice the amount of acidic casein hydrolysate, medium with a single amount of acidic casein hydrolysate and medium based on protein hydrolysate from the muscle tissue of fur-bearing animals produced by VNITIBP. As a comparative analysis, the crops strain C. tetani Kolle-8 production were carried out. The cultivation produced on nutrient medium in bio-bottles wiht 350C temperature. Accumulated toxin activity was daily determined on white mice for 10 days. All the obtained results are summarized in the table, and the main results of the effect of the adjustment of the hydrogen index (pH) on toxin formation are presented in the form of graphs. It has been found that there was a moderate bacterial growth, an increased foam and a gus formation and a medium turbidity based on the protein hydrolysate as the result of nutrient medium usage. More over the pH level must be adjusted with 15% NaHCO3 up to 6.96. The mice titer increasimg will be pointed for the 9th - 10th days.

Keywords: clostridium, tetanus, strain Kolle-8 C. tetani, toxin, toxin formation, vaccine, cultivation, nutrient medium

Введение. Инфекционные заболевания сельскохозяйственных животных, вызванные бактериями рода Clostridium семейства Bacillaceae, несмотря на сильно различающиеся клинически признаки, имеют ряд особенностей, позволяющиеобъединить их под названием клостридиозы. Clostridiumspp. -крупные полиморфные грамположительные палочки; некоторые виды подвижные (перитрихи), во внешней среде образуют сферические или овальные споры, расположенные терминально (C. tetani) или субтерминально (возбудители анаэробной энтеротоксемии, эмкара и др.). По величине споры иногда намного превосходят толщину клетки. Большинство штаммов растет в анаэробных условиях с образованием высокоактивных экзотоксинов. Многие виды клостридий являются постоянными обитателями кишечника животных и человека, с испражнениями которых выделяются во внешнюю среду; в виде спор длительно (годами) сохраняются в окружающей среде [5]. Одним клинически значимым видом клостридий, наносящим вред поголовью сельскохозяйственных животных - является возбудитель столбняка - Clostridium tetani [2]. Clostridium t. является комменсалом кишечника жвачных животных, но проникновение бактерии через поврежденные ткани в организм животного может приводить к серьезным и, нередко, фатальным последствиям. Возбудитель столбняка - прямая подвижная палочка длиной 2,4 - 12 мкм и шириной 0,3 - 0,6 мкм [3]. Перитрих, образует устойчивые споры шаровидной формы, располагающиеся на конце и придающие микробу вид барабанной палочки; не образует капсулы; грамположительные; строгий анаэроб [1]. С. Tetani продуцирует кислородолабильный гемолизин (тетанолизин), но наиболее важным продуктом микроорганизма является нейротоксин (тетано-спазмин). Большинство штаммов продуцирует токсин, обнаруживаемый при культивировании в бульоне через несколько дней. По токсигенности штаммы могут значительно различаться, некоторые чрезвычайно токсикогенны [4]. Вызываемая C. tetani остро протекающая токсикоинфекция, обычно заканчивается летальным исходом. Учитывая спорадические случаи возникновения столбняка, производитель ориентирован на удовлетворение потребностей потребителя в производстве профилактических препаратов - вакцин. Основным компонентом вакцин является анатоксин.

Для производства анатоксина C. tetani используется питательная среда на основе кислотного гид-ролизата казеина. При этом наблюдается слабый рост культуры и относительно низкая выработка токсина. Возникают затруднения при фильтрации инактивированной культуры столбняка из-за высокой вязкости среды ввиду наличия в питательной среде большого количества белка (в рецепт входит ауто-лизат отрубей, добавляемый в качестве источника витаминов группы В). Контроль роста культуры

также затруднен из-за темно-коричневого цвета и непрозрачности среды. Кроме того, недостатком применяемой питательной среды является нестабильность водородного показателя, значение которого снижается с 7,8 (перед стерилизацией) до 5,8-6,2 (после стерилизации). Столбнячной культуре для роста необходима слабощелочная питательная среда. При низком водородном показателе (5,8-6,2) рост культуры замедляется и визуально (помутнение среды, появление газо- и пенообразования) наблюдается лишь через 48 ч вместо 18-24 ч. Также биохимические процессы, протекающие в микробной клетке, способствуют выделению кислых продуктов обмена веществ в питательную среду, в результате происходит дополнительное снижение водородного показателя, что также ингибирует рост культуры. Как следствие, снижаются ростообеспечивающие свойства среды, что негативно сказывается на накоплении токсина. Накопление токсина начинается через 56±8 часов роста, титр токсина составляет 1:100±50 Б1ш/мл и держится в этих пределах вплоть до пяти суток. К 4-5 суткам наблюдаются признаки «остановки роста клостридий» - среда становится прозрачной, исчезают газо- и пенообразова-ние. Основываясь на вышеперечисленном, целью нашей работы явилось усовершенствование (разработка нового рецепта) состава питательной среды для культивирования C. tetani. Приоритетной задачей разработки явилось получение новой питательной среды, компоненты которой обеспечивали бы всеми необходимыми питательными веществами и факторами роста клостридиозную культуру и накопление токсинаС tetani с максимально высоким титром. Также необходимо стабилизировать водородный показатель среды после стерилизации паром (желаемый показатель в пределах от 6,9 до 7,4).

Материалы и методы. Для производства токсина использовался производственный штамм C. tetani Ко11е-8. В качестве сравнительного анализа осуществлялись посевы на трех разных питательных средах. Рост С. tetani наблюдали в течение до 6-10 дней. Рецепт питательной среды для выращивания возбудителя столбняка, удовлетворяющий всем вышеперечисленным требованиям, разработан с применением белкового гидролизата из мышечной ткани норок, производства ФГБНУ ВНИТИБП. Гидро-лизат имеет высокое содержание аминного азота и водородный показатель от 6,3 до 6,8. Питательная среда на основе гидролизата из мышечной ткани норок изготавливалась по разработанному на ФКП «Курская биофабрика» рецепту (рецепт № 3), с рН готовой среды в пределах 7,0-7,4 (после стерилизации). В качестве сравнения были приготовлены: питательная среда по рецепту № 1 -среда с удвоенным количеством кислотного гидролизата казеина; по рецепту № 2 - среда с одинарным количеством кислотного гидролизата казеина. Культивирование осуществлялось в биобутылях вместимостью 3 дм3, объем питательной среды 2,25 дм3, температура культивирования 35 0С. Определение активности токсина осуществлялось на основании ОФС.1.7.2.0032.15 Определение содержания анатоксинов в реакции антитоксинсвязывания [9, 10, 13].

Материалом для исследований послужили: питательная среда ММПБ в пробирках и флаконах, питательная среда в колбах стеклянных по 2,5 л, 15% раствор гидрокарбоната натрия, мыши белые весом 16±2 г, питательные среды для контроля стерильности (агарСабуро, МПА, МПБ).

Результаты исследований и их обсуждение. Все три питательные среды имели следующие показатели: общий азот - 450±470 мг%; аминный азот - 130±225 мг%; пептон - 3,0±0,5 мг%. Перед внесением С. tetani в среду добавляли 0,5% глюкозы, дрожжевой экстракт, витамины группы В.

Проведенные опыты по сравнению влияния состава питательных сред на токсинообразование C. tetani представлены в таблице 1.

После проведенного опыта по использованию 3-х разных рецептов питательных сред было установлено, что:

- при использовании среды, приготовленной по рецепту №1 (насыщенного коричневого цвета с оттенком черного) наблюдали признаки визуального роста в первые три дня культивирования, после чего спустя 20-48 часов фиксировали падение водородного показателя (закисление) среды и постепенное угасание признаков роста бактерии к 5-му дню. Титр токсина на мышах снижался и к концу опыта составил 1:500. При ежедневном контроле рН и его корректировки (каждые двое суток) при помощи 15% NaHCO3 до показателя 6,8 максимальный титр токсина составил 1:1000 (Б1ш/мл);

- при использовании среды, приготовленной по рецепту №2 (насыщенного коричневого цвета) наблюдали признаки визуального роста впервые двое суток культивирования, после чего спустя 20-48 часов фиксировали падение водородного показателя (закисление) среды и постепенное угасание признаков роста бактерии к 6-му дню. Титр токсина на мышах был зафиксирован как 1: 1000 (Б1ш/мл). При ежедневном контроле рН и его корректировки (каждые двое суток) при помощи 15% NaHCO3 до показателя 6,8, наблюдали стремительный рост бактерий, увеличение пено- и газообразования, помутнение среды и параллельно увеличение титра токсина при контроле на мышах до 1:1000 (Б1ш/мл);

- при использовании среды, приготовленной по рецепту №3 (коричневого цвета) наблюдали признаки визуального роста в первые сутки культивирования (18-24часа), после чего спустя 72 часа фиксировали падение водородного показателя (закисление) среды и постепенное угасание признаков роста бактерии к 4-му дню. Титр токсина на мышах был зафиксирован как 1:1000 (Б1ш/мл) (отсутствие падения и нарастания одновременно). При ежедневном контроле рН и его корректировки (каждые двое суток) при помощи 15% №НС03 допоказателя 6,96, наблюдали умеренный рост бактерий, увеличение пено- и газообразования, помутнение среды и параллельно увеличение титра токсина при контроле на мышах на 9-10 сутки до 1:5000 - 1:10000 (Б1ш/мл)).

Таблица 1 - Сравнительный анализ влияния состава питательных сред на токсинообразование С Tetani

Наименование Рецептура Примечание

показателя Рецепт 1 Рецепт 2 Рецепт 3

Цвет Цвет насыщен- Цвет насыщен- Цвет коричневый, Оценка цвета

Прозрачность ный коричне- ный коричневый среда прозрачная среды после стери-

Среды вый с оттенком с оттенком чер- лизации автоклави-

черного. ного. Наблюде- рованием

Наблюдение ро- ние роста в пер-

ста в первые вые сутки затруд-

сутки затрудни- нительно

тельно

Появление ви- 1,5-3 сут 1,5-2 сут 18-24 ч Оценка визуально

димых призна-

ков роста(пе-

нообразова-

ние, газообра-

зование, по-

мутнение)

Максимальное 6-10 7-10 7-10 После прекращения

количество су- видимых признаков

ток роста роста вносили фор-

малин

Контроль ток- 2 сут - 1:50 2 сут - 1:50 2 сут - 1:100 Титр токсина оце-

синообразова- 3 сут - 1: 100 3 сут -1: 100 3 сут- 1: 500 нивали в рН на мы-

ния на мышах 4 сут -1: 500 4сут - 1: 100 4 сут -1: 1000 шах

Титр экзоток- 5 сут -1: 500 5 сут - 1: 500 5 суток -1: 1000

сина 6 суток - 1:1000 6 сут - 1:500 6 суток - 1:1000

ф^/мл) и далее до 10 7 суток - 1:1000 7 суток - 1:5000

суток - 1:1000 и далее до 10 су- и далее до 10 суток

ток - 1:1000 - 1:5000

Контроль ток- 1-2 сут - 1:50 1-2 сут 1:50 1-2 сутки 1:100 После ежедневного

синообразова- 3 дня роста - 3 дня роста - 3 дня роста - 1: 500 отбора проб наблю-

ния на мышах 1: 100 1: 100 4 дня роста - 1: дается снижение

до корректи- 4 дня роста - 4 дня роста - 1000 роста бактерий и

ровки рН - 1: 500 1: 100 5 дня роста - 1: падение титра до

опыт 5 дня роста - 5 дня роста - 1000 1:500 (без коррек-

^^/мл) 1: 500 1: 1000 6 день роста - тировки рН)

6 день роста - 6 день роста - 1:1000

1:1000 1:1000 7 дней роста -

и далее до 10 7 дней роста - 1:1000

суток роста - 1:1000 и далее по 10 день

1:500 и далее по роста - 1:1000

10 день роста -

1:1000

Контроль ток- 1-2 сут - 1:50 1-2 сут 1:50 1-2 сутки 1:100 После ежедневного

синообразова- 3 дня роста - 3 дня роста - 3 дня роста - 1: 500 отбора проб наблю-

ния на мышах 1: 100 1: 100 4 дня роста - 1: даются признаки

после коррек- 4 дня роста - 4 дня роста - 1000 активизации роста

тировки рН - 1: 500 1: 100 5 дня роста - 1: уже через 20-48 ча-

опыт 2 5 дня роста - 5 дня роста - 1000 сов (для корректи-

ф^/мл) 1: 500 1: 1000 6 день роста - ровки рН приме-

6 день роста - 6 день роста - 1:1000 нялся 15% рас-

1:1000 1:1000 7 дней роста - твор гидрокарбо-

и далее до 10 7 дней роста - 1:5000 ната натрия)

суток роста - 1:1000 и далее по 10 день

1:1000 и далее по роста - 1:5000

10 день роста - с 9 дня 1:10000

1:5000

Рисунок 1 - Токсинообразование до корректировки рН

Рисунок 2 - Токсинообразование после корректировки рН

ев X Я и

Ы £

н Н

10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

Контроль токсинообразования на мышах после корректировки рН

Рецепт 1 Рецепт 2 Рецерт 3

1-2 3 сутки 4 сутки 5 сутки 6 сутки 7 сутки 8 сутки 9-10 сутки сутки

Корректировке рН питательная среда по рецепту № 1 поддается трудно (от 5,2 до 6,67), при этом титр токсина не нарастает, максимальное его значение достигается к 10 дню роста. После корректировки значение водородного показателя (рН) быстро снижается через 24 -30 часов.

Корректировке рН питательная среда по рецепту № 2 поддается легко (от 5,41 до 6,89), при этом нарастание титра токсина наблюдалось с 7 дня роста. После корректировки значение водородного по-казателя(рН) быстро снижается через 24 -30 часов.

Корректировке рН питательная среда по рецепту № 3 поддается легко (от 5,2 до 6,969), при этом нарастание титра токсина наблюдалось с 7 дня роста. К 10 дню цвет среды приобретал интенсивный оттенок рыжего.

Заключение. Полученные результаты доказывают, что питательная среда №3 является наиболее оптимальной для культивирования бактерий C. tetani, и обеспечивает накопление бактериальной массы возбудителя, о чем свидетельствует высокий уровень образования токсина (до 15 тыс. Б1ш/мл), в отличие от сред №1 и №2. Установлено, что корректировка уровня водородного показателя (рН)

питательной среды благоприятно влияет на рост и токсинообразование, так как в представленных исследованиях во всех трех предложенных рецептах питательных сред увеличивалось образование токсина.

Список источников

1. Дорош, М. В. Болезни лошадей: справочное пособие по наиболее часто встречающимся заразным и незаразным заболеваниям лошадей. Москва: Вече, 2007. - 247с.

2. Капустин А.В. Разработка метода контроля иммуногенной активности ассоциированной вакцины против клостридиозов крупного рогатого скота / Лаишевцев А.И., Скляров О.Д., Абросимова Н.С. // Russian Journal of Agricultural and SocioEconomic Sciences. - 2017. - № 3 (63). - С. 170-175.

3. Капустин А.В.Питательная среда, обеспечивающая стабильное накопление токсинов при культивировании некоторых штаммов клостридий. // в книге: Лекарственные препараты для животных (разработка, производство, эффективность и качество) - Тезисы докладов международной научной конференции, посвященной 80-летию организации ВГНКИ. - 2011. - С. 54-56.

4. Скляров О Д. Изучение иммуногенной активности столбнячного компонента в составе ассоциированной вакцины против клостридиозов крупного рогатого скота Скляров О.Д., Шемельков Е.В., Лаишевцев А.И., Гулюкин А.М., Капустин А.В. // Ветеринария Кубани - 2016.- № 4. - С. 15-17.

5. Фармокопея 0ФС.1.7.2.0032.15 Определение содержания анатоксинов в реакции антитоксин связывания.

6. ФС.3.3.1.0044.15 Сыворотка противостолбнячная лошадиная.

7. http://student.vetdoctor.ru

8. http://elib.usma.ru/bitstream/usma/960/1/UMK_2013_003.pdf

References

1. Dorosh, M. V. Diseases of horses: a reference guide to the most common infectious and non-infectious diseases of horses. Moscow: Veche, 2007. - 247s.

2. Kapustin A.V. Development of a method for monitoring the immunogenic activity of an associated vaccine against bovine clostridiosis / Laishevtsev A.I., Sklyarov O.D., Abrosimova N.S. // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. - 2017. - № 3 (63). - Pp. 170-175

3. Kapustin A.V. Nutrient medium providing stable accumulation of toxins during cultivation of some strains of clostridium. // in the book: Medicinal products for animals (development, production, efficiency and quality) - Abstracts of reports of the international scientific conference dedicated to the 80th anniversary of the organization of the VGNKI. - 2011. - pp. 54-56.

4. Sklyarov O.D. Study of the immunogenic activity of the tetanus component in the associated vaccine against bovine clostridiosisSklyarov O.D., Shemelkov E.V., Laishevtsev A.I., Gulyukin A.M., Kapustin A.V. // Veterinary medicine of Kuban - 2016.- No. 4. - pp. 15-17.

5. Pharmokopeya OFS.1.7.2.0032.15 Determination of the content of anatoxins in the antitoxin binding reaction.

6. FS.3.3.1.0044.15 Horse tetanus serum.

7. http://student.vetdoctor.ru

8. http://elib.usma.ru/bitstream/usma/960/1/UMK_2013_003.pdf

Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.

Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication. The authors declare that there is no conflict of interest.

Принята к публикации / accepted for publication 27.11.2023;

© Бридня А.Б., Капустин А.В., Шеметюк С.А., Мищенко А.В., Юровчик А.Б., Албулов А.И. 2024