CC BY
32
DOI 10.31588/2413-4201-1883-244-4-188-191
УДК 619:616-091:616.636.2
ИЗЫСКАНИЕ ОПТИМАЛЬНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНАТОКСИНОВ БАКТЕРИЙ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Спиридонов А.Г. - к.б.н., Макаев Х.Н. - д.в.н., профессор, Спиридонов Г.Н. - д.б.н., Махмутов А.Ф. - к.б.н., Хурамшина М.Т. - соискатель
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
Ключевые слова: анаэробная энтеротоксемия, Cl. perfringens, культивирование, питательные среды, анатоксины
Key words: anaerobic enterotoxemia, Cl. perfringens, cultivation, nutrient medium, toxoids
В последние годы во многих скотоводческих хозяйствах Среднего Поволжья диагностируются анаэробная энтеротоксемия молодняка крупного рогатого скота. В отдельных хозяйствах переболевает до 45 % нарождающегося молодняка, сохранность их не превышает 80 %. Заболевание обусловлено интенсивным размножением возбудителя болезни - бактерий Clostridium perfringens (Cl. perfringens) в кишечнике и всасыванием образующихся токсинов в общий кровоток. В патогенезе анаэробной энтеротоксемии имеет значение и септический компонент. Заражение молодняка происходит в основном алиментарным путем.
Анаэробную энтеротоксемию у животных вызывают спорообразующие бактерии Cl. perfringens различных типов: А, В, С, D и Е. У телят заболевание часто бывает обусловлено серотипами А, С и D [3, 4, 5]. Исследованиями, проведенными нами в 57 неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям скотоводческих хозяйствах Среднего Поволжья, анаэробная энтеротоксемия установлена в 18 (31,6 %) хозяйствах [1, 5]. У новорожденных телят заболевание протекало в острой форме, наблюдалась у них геморрагическая диарея и явления общей интоксикации. У молодняка более старшего возраста отмечалось молниеносное или подострое течение болезни, не всегда проявлялся весь комплекс клинических признаков болезни. Заболевание при молниеносном течении заканчивалось летальным исходом через 2-6 часов после появления первых
признаков болезни. Лечение не всегда бывает своевременным и эффективным. В этой связи актуальна разработка вакцины для специфической профилактики анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота.
Известно, что качество вакцины, полученной на основе анатоксинов, зависит от титра токсина в ростовой питательной среде, который в свою очередь зависит от качества питательной среды и технологии культивирования [2, 6].
Цель настоящих исследований -изыскание оптимальной питательной среды для культивирования бактерий Cl. perfringens с целью получения анатоксинов, необходимых для изготовления ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии.
Материал и методы исследований. Исследования проводили в лаборатории бактерийных инфекций ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ. В работе использовали:
- производственные штаммы Cl. perfringens: № 28 - тип А, 392 - тип С, 213 - типов Д;
- питательные среды: МПБ, Хоттин-гера, тиогликолевая, Китта-Тароцци, ГРМ-бульон, мясо-печеночно-казеиновая;
- сыворотки антитоксические Кл. перфрингенс типов А, С, Д диагностические;
- животные - кролики массой 3,03,5 кг;
- оборудования и приборы: микроскоп медико-биологический Nikon type 104 c Eclipse E 200, биореактор LabFors 5, сте-
рилизатор паровой ВК-75-01, стерилизатор воздушный автоматический ГП-320-ПЗ, бокс микробиологической безопасности БМБ-П «Ламинар-С»-1,2 (231-120), рН метр рН-150МИ, весы электронные A&D ЕК-6000^ термостат электрический сухо-воздушный ТС-1/80 СПУ, холодильник фармацевтический «ПОЗИС» ХФ-250-3.
Результаты исследований. Производственные штаммы С1. рег1гт§еп8 вначале выращивали на тиогликолевой среде, затем их пересевали на изучаемые питательные среды в количестве 5 % посевного материала к общему объему питательной среды и выдерживали при 37 оС в течение 8 часов. По истечении этого времени про-
Из данных таблицы 1 видно, что наиболее оптимальными питательными средами для культивирования бактерий С1. регйг1п§епБ и получения анатоксинов являются мясо-печеночно-казеиновая и тио-гликолевая питательные среды. Тиоглико-левая среда для изготовления вакцины не совсем подходит, так как в своем составе содержит агар-агар. Поэтому в дальнейшем для получения анатоксинов бактерий С1. реГг^епБ, необходимых для изготов-
водили отбор проб питательных сред для определения в них титров токсинов С1. регйг^епБ в реакции иммунодиффузии с использованием диагностических сывороток антитоксических Кл. перфрингенс типов А, С, Д. При этом наиболее интенсивный рост и образование токсинов С1. регГ-г1п§епБ наблюдали в мясо-печеночно-казеиновой среде с аминным коэффициентом 0,7-0,8 (Таблица 1), что послужило основанием для использования этой среды для получения анатоксинов и соматических антигенов С1. регйг^епБ при изготовлении ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоз-ной диареи телят.
ления вакцины, использовали мясо-печеночно-казеиновую среду. С этой целью производственные штаммы С1. регйг^епБ № 28, 392, 213 выращивали в анаэробных условиях биореактора на мя-со-печеночно-казеиновой среде в течение 6-9 часов, при температуре 37-38 оС. После накопления в ростовой питательной среде бактерий С1. регйг^епБ не менее 4 млрд./см3 микробных клеток, проводили инактивацию бактериальной культуры пу-
Таблица 1 - Токсинообразование бактерий С1. регГг1п§епБ на искусственных питательных
средах
Наименование Наименование питательной Время Токсичность
штамма среды культивирования, ч культуры, Б1ш/см3
С1. регйг^епБ Бульон Хоттингера 8 280±54,7
№ 28 Китта-Тароцци 8 1440±178,9
ГРМ-бульон 8 240±44,7
МПБ 8 180±22,3
Тиогликолевая 8 5760±715,5
мясо-печеночно-казеиновая 8 5120±876,3
С1. регйг^епБ Бульон Хоттингера 8 320±54,7
№ 392 Китта-Тароцци 8 1280±219,1
ГРМ-бульон 8 280±54,7
МПБ 8 200±61,2
Тиогликолевая 8 5120±876,3
мясо-печеночно-казеиновая 8 4480±876,3
С1. регйг^епБ Бульон Хоттингера 8 260±67,0
№ 213 Китта-Тароцци 8 1600±0
ГРМ-бульон 8 280±54,7
МПБ 8 240±4,7
Тиогликолевая 8 6400±0
мясо-печеночно-казеиновая 8 5760±715,5
тем добавления в нее формалина до 0,7 % конечной концентрации и выдерживания при температуре 37-38 оС в течение 10 суток. По истечение этого времени, проводили проверку культуры на качество инактивации путем посева ее на мясо-печеночно-казеиновую среду. При удовлетворительном результате, в бактериальную суспензию вносили 6 % раствор гидроокиси алюминия из расчета 100 см3 на 1 л культуры и выдерживали 3 суток при периодическом перемешивании. Затем уда-
ляли 50 % общего объема надосадочной жидкости, устанавливали рН 7,2-7,4.
Далее проверяли антигенные свойства полученного анатоксина на кроликах. Сорбированный на гидроокиси алюминия анатоксин вводили 5 кроликам подкожно двукратно с интервалом 14 дней в дозе 2 см3. Через 7 и 14 дней после введения анатоксина у них брали кровь и исследовали ее сыворотку на содержание специфических антителу к Cl. perfringens, результаты которых представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Антигенная активность анатоксинов Cl. perfringens, полученных на мясо-
печеночно-казеиновой среде (M±m, n=5)
Срок исследования после введения анатоксина Титр антител к Cl. perfringens в ИФА, log2
тип А тип С тип Д
7 дней после 1 введения 9,24±0,27 9,44±0,22 8,64±0,35
14 дней после 1 введения 10,84±0,42 11,24±0,22 11,24±0,27
7 дней после 2 введения 12,04±0,27 12,84±0,22 13,04±0,27
14 дней после 2 введения 13,84±0,22 13,24±0,27 13,64±0,35
Из таблицы 2 видно, что сорбированные на гидроокиси алюминия бактерии и анатоксины Cl. perfringens обладают высокой антигенной активностью, индуцируют у кроликов выработку специфических антител в сыворотке крови в титрах до 13,84±0,22 log2.
Заключение. Изыскана оптимальная питательная среда для получения биомассы и анатоксинов Cl. perfringens - мя-со-печеночно-казеиновая среда. Установлено, что антиген, полученный из биомассы и анатоксинов производственных штаммов Cl. perfringens № 28, 392, 213, обладает высокой антигенной активностью, индуцирует у кроликов выработку специфических антител в сыворотке крови в титрах до 13,84±0,22 log2.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Гумеров, В.Г. Эпизоотологиче-ский и серологический мониторинг смешанных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота / В.Г. Гумеров, В.В. Евстифеев, Х.Н. Макаев [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2019. - Т. 237. - С. 56-60.
2. Капустин, А.В. Питательная среда, обеспечивающая стабильное накопление токсинов при культивировании неко-
торых штаммов клостридий / А.В. Капустин, О.С. Пивоварова // Лекарственные препараты для животных (разработка, производство, эффективность и качество): Матер. междун. науч. конф., посвящ. 80-летию ВГНКИ. - М. - 2011. - С. 54-56.
3. Кириллов, Л.В. Инфекционная анаэробная энтеротоксемия животных / Л.В. Кириллов, З.Х. Межиева // Российский ветеринарный журнал. - 2007. - № 3. - С. 4-9.
4. Колесникова, Ю.Н. Этиология анаэробных инфекций у крупного рогатого скота и сравнительная характеристика выделенных штаммов клостридий / Ю.Н. Колесникова, Н.В. Пименов, А.В. Капустин // Russian Journal of Agricultural and SocioEconomic. - 2016. - 8 (56). - С. 39-48.
5. Спиридонов, А.Г. Современные подходы к специфической профилактике и лечению анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят / А.Г. Спиридонов, Д.Д. Насертдинов, Х.Н. Макаев, Г.Н. Спиридонов // Ветеринарный врач. -2015. - №.6 - С. 12-15.
6. Сусский, Е.В. Разработка модифицированной питательной среды для глубинного культивирования анаэробных микроорганизмов / Е.В. Сусский, С.Н. Ярцев, В.Е. Михеев [и др.] // Научные основы
производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК. Матер. науч.-практ. конф., посвящ. 95-летию Ар-
мавирской биофабрики. - 2016. - С. 348355.
ИЗЫСКАНИЕ ОПТИМАЛЬНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНАТОКСИНОВ БАКТЕРИЙ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Спиридонов А.Г., Макаев Х.Н., Спиридонов Г.Н., Махмутов А.Ф., Хурамшина М.Т.
Резюме
В статье приведены результаты исследований по подбору оптимальной питательной среды для выращивания бактерий Cl. perfringens. Испытаны для этих целей мясо-пептонный бульон, ГРМ-бульон среды Хоттингера, тиогликолевая, Китта-Тароцци, мясо-печеночно-казеиновая. Установлено, что наиболее оптимальной питательной средой для культивирования бактерий Cl. perfringens и получения анатоксинов является мясо-печеночно-казеиновая среда. Для получения анатоксинов производственные штаммы Cl. perfringens № 28, 392, 213 выращивали в анаэробных условиях биореактора на мясо-печеночно-казеиновой среде в течение 6-9 часов при температуре 37-38 оС. Инактивацию бактерий и их токсинов осуществляли путем добавления в культуру формалина до 0,7 % конечной концентрации и выдерживания при температуре 37-38 оС в течение 10 суток. Инактивированную биомассу бактерий Cl. perfringens и анатоксины осаждали гидроокисью алюминия. Антигенные свойства полученного препарата изучали на кроликах путем двукратного подкожного введения его в дозе 2 см3. Установили, что сорбированные на гидроокиси алюминия инактивированные бактерии Cl. perfringens и анатоксины обладают высокой антигенной активностью, индуцируют у кроликов выработку специфических антител в сыворотке крови в титрах до 13,84±0,22 log2.
FINDING THE OPTIMAL NUTRIENT ENVIRONMENT FOR OBTAINING ANATOXINS OF
BACTERIA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Spiridonov A.G., Makaev H.N., Spiridonov G.H., Makhmutov A.F., Khuramshina M.T.
Summary
The article presents the results of studies on the selection of the optimal nutrient medium for the cultivation of bacteria Cl. perfringens. Meat-peptone broth, Hottinger broth, thioglycolic medium, Kitta-Tarozzi medium, meat-liver-casein were tested for these purposes. It has been established that the meat-liver-casein medium is the most optimal nutrient medium for the cultivation of Cl. perfringens bacteria and the production of toxoids. To obtain toxoids, production strains of Cl. perfringens No. 28, 392, 213 were grown under anaerobic conditions of the bioreactor on meat-liver-casein medium for 6-9 h at a temperature of 37-38 °C. Inactivation of bacteria and their toxins was carried out by adding formalin to a culture of 0,7 % final concentration and maintaining at a temperature of 37-38 °C for 10 days. Inactivated biomass of bacteria Cl. perfringens and toxoids was precipitated with aluminum hydroxide. The antigenic properties of the obtained preparation were studied in rabbits by double subcutaneous administration of it in a dose of 2 cm3. It was established that inactivated bacteria Cl. perfringens and toxoids sorbed on aluminum hydroxide have high antigenic activity and induce the production of specific antibodies in blood serum in rabbits in titers up to 13,84 ± 0,22 log2.
