CC BY
44
УДК 615.453.4
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-3-82-87
РАЗРАБОТКА НОВОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ -
ТРИТИКАИН-АЛЬФА
Краснюк И.И. (мл), Краснюк И.И., Тарасов В. В.
ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова (Сеченовский Университет), г. Москва, Российская Федерация
THE DEVELOPMENT OF NEW PHARMACEUTICAL SUBSTANCES -
TRITICAINE-ALPHA
KrasnyukI.I. (jun), KrasnyukI.I., Tarasov V.V.
First Moscow state medical university named after I.M. Sechenov, (Sechenov University),
Moscow, Russian Federation
Аннотация. В статье описан способ получения рекомбинантного белка тритикиан-альфа, а также рассмотрены вопросы разработки субстанции тритикиан-альфа, отвечающей треоаниям ГФ XIV. Учеными Института молекулярной медицины ФГАО ВО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет) МЗ РФ был разработан способ получения усеченной формы полноразмерного тритикаина-альфа, соответствующей его каталитическому домену (т.е. без лидерного пептида и гранулин-подобного домена) с высоким выходом и уровнем протеолитической активности, содержащих последовательность из 6 His в N-терминальной области рекомбинантного белка (Патент RU 2 603 054 C2). Однако, полученный рекомбинантный белок не соответствовал показателям, изложенным в ГФ XIV. На основании проведенного исследования определен оптимальный состав вспомогательных веществ для технологии получения субстанции рекомбинантного белка- тритикаин-альфа.
Ключевые слова; тритикаин-альфа, рекомбинантный белок, криопротекторы, лиофи-лизация
Annotation. The article describes a method for producing a recombinant tritician-alpha protein, and also discusses the development of a tritician-alpha substance that meets the requirements of GP XIV. Scientists of the Institute of Molecular Medicine FSAE of the First Moscow State Medical University. THEM. Sechenov (Sechenov University) of the Ministry of Health of the Russian Federation developed a method for producing a truncated form of full-sized triticaine-alpha corresponding to its catalytic domain (i.e., without a leader peptide andgranulin-like domain) with a high yield and level of proteolytic activity containing a sequence of 6 His in N-terminal region of the recombinant protein (Patent RU 2 603 054 C2). However, the resulting recombinant protein did not meet the parameters set forth in GP XIV. In this regard, it was necessary to select the composition of cryoprotectants to obtain a stable lyophilis-ate in order to further create a new drug in the form of hard capsules, as well as the method of their administration. The quality assessment of the obtained samples of the substance with excipients was evaluated by the following indicators: appearance, ability to grind, moisture content and the formation of possible decomposition products of recombinant. Based on the study, the optimal composition of excipients was determined for the technology of obtaining the substance of the recombinant protein triticaine-al-pha.
Keywords; triticain-alpha, recombinant protein, cryoprotectants, lyophilization
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Бельмер С.В., Гасилина Т.В. Целиакия: исходы и новые подходы к диагностике / / Лечащий Врач. Москва.2012. № 8. С. 56-61
[2] Т. Kiyosaki, Т. Asakura, I. Matsumoto, et al. J Plant Physiol, 2009, 1, 166(1), 101-106.
[3] Massimiliano Carciofi, Andreas Blennow, Susanne L Jensen, Concerted suppression of all starch branching enzyme genes in barley produces amylose-only starch granules//BMCPlant biology, 2012,№ 11P.25-30.
[4] Краснюк И.И., Тарасов В.В., Козлова Ж.М., Степанова О.И., Краснюк (мл), И.И., Кугач В.В.. Выбор криопротектора для лиофилизации тритикаин-а// Вестник фармации. 2019.№ 1 (83). С. 49-53.
[5] Аршинова О.Ю., Оборотова Н.А., Санарова Е.В. Вспомогательные вещества в технологии лиофилизации лекарственных препаратов// Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2013. - №1(2). - С. 20-24
[6] Патент RU 2603054 «Способ получения белков семейства цистеиновых протеаз пшеницы (triticum aestivum) и препарат белка тритикаин-альфа, полученный этим способом»
[7] Государственная фармакопея РФ XIV изд. Т. II. - М.: ФЭМБ, 2018.
Одним из наиболее перспективных и патогенетически обоснованных направлений заместительной терапии целиакии является использовании лекарственных препаратов на основе ферментов, способных обеспечивать расщепление глютенов и продуктов их неполного гидролиза в желудочно-кишечном тракте человека до пептидов, не являющихся иммуноген-ными и токсичными [1].
Цистеиновые протеазы распространены в растениях и экспрессируются в их различных органах. Предполагается, что эти ферменты участвуют в стадии специфическом расщеплении и пост-трансляционных модификациях запасающих белков. Основным преимуществом папаин-подоб-ных цистеиновых протеиназ из семян растений на данный момент является их эн-допептидазная активность, в частности глютеназная активность - способность эффективно гидролизовать пептиды
REFERENCES
[1] Belmer S. V., Gasilina T. V. Celiac disease: outcomes and new approaches to diagnosis. Mos-cow.2012. No. 8. Pp. 56-61
[2] T. Kiyosaki, T. Asakura, I. Matsumoto, et al. J Plant Physiol, 2009, 1, 166(1), 101-106.
[3] Massimiliano Carciofi, Andreas Blennow, Susanne L Jensen, Concerted suppression of all search branching enzyme genes in barley products amyl-ose-only star granules/ / BMCPlant biology, 2012, no. 11P. 25-30.
[4] Krasniuk I. I., Tarasov V. V., Kozlova Zh. M., Ste-panova O. I., krasniuk (ml), I. I., Kugach V. V.. Choosing a cryoprotector for lyophilization of trit-icaine-a/ / Bulletin of pharmacy. 2019. No. 1 (83). Pp. 49-53.
[5] Arshinova O. Yu., Oborotova N. A., Sakharova E. V. Auxiliary substances in the technology of lyophilization of medicinal products/ / Development and registration of medicinal products. - 2013. -No. 1(2). - Pp. 20-24
[6] Patent RU 2603054 " Method for producing proteins of the wheat cysteine protease family (triti-cum aestivum) and the preparation of the protein triticain-alpha obtained by this method»
[7] 7. State Pharmacopoeia of the Russian Federation XIV ed. Vol. II. - - Moscow: FIB, 2018.
глютена (запасного белка пшеницы, состоящего из смеси мономерных глиадинов и полимерных глютенинов) или родственных запасных белков ржи и ячменя. Это свойство растительных ферментов позволяет считать их перспективными объектами при разработке лекарственных средств для борьбы с целиакией. [2,3]
Как и большинство цистеиновых пептидаз, тритикаин-альфа транслируется in vivo в виде неактивного зимогена, состоящего из сигнального (лидерного) пептида, продомена, протеиназного домена, содержащего каталитическую триаду Cys-His-Asn, и гранулин-подобного домена.
Однако биосинтез рекомбинант-ного тритикаина-альфа для исследования его протеолитических функций до сих пор не был осуществлен. Обеспечение эффективного источника получения высокоочи-щенного и активного белка является
одной из важных задач, возникающих при создании ферментных препаратов. Поэтому возникает необходимость разработки новых технологий получения таких белков и получения высокоэффективных лекарственных препаратов на их основе.
Материалы и методы. Рекомби-нантный белок тритикаин-альфа, представляет собой смесь белков, состоящую из полипептида с молекулярной массой ~ 42 кДа, содержащего в первичной структуре аминокислотную последовательность продомена тритикаина-альфа, слитную с протеиназным доменом тритика-ина-альфа, а также продукты автокаталитического протеолиза: полипептид с молекулярной массой ~ 30 кДа, содержащий в первичной структуре аминокислотную последовательность протеиназного домена тритикаина-альфа и пептиды с молекулярной массой ~11-12 кДа, представляющие отщепленные последовательности продомена тритикаина-альфа. Вспомогательные вещества: криопротек-торы - маннит/маннитол (Pearlitol®, Roquette, Франция), поливинилпирроли-дон (ПВП).
Определение подлинности проводили методом ВЭЖХ. Хроматографические условия
Колонка - Symmetry 3,9x150 мм, 300 С18, 5 мкм
Подвижная фаза: 0,1% раствор трифторук-сусной кислоты (фаза А) - ацетонитрил (фаза Б) с использованием градиентной системы элюирования со следующими параметрами: линейный градиент от 0 до 60% фазы Б и от 100 до 40% фазы А в течение 15 мин.
• Скорость потока - 1,0 мл/мин;
• Температура колонки - 25°С;
• Детектор - УФ 280 нм;
• Объем вводимой пробы - 200 мкл;
• Время хроматографирования - 15 мин.
Приготовление фазы А: В чистую стеклянную бутыль объёмом 1 л добавить 1л
деионизованной воды, 1мл трифторуксус-ной кислоты из ампулы (категория чистоты «для хроматографии») и перемешать.
Фаза Б представляет собой ацетонитрил с категорией чистоты «для хроматографии».
Приготовление испытуемого раствора субстанции: 1 мг субстанции добавляют 2 мл воды, раствор помещают в пробирку объёмом 2мл и центрифугировать на центрифуге Eppendorf при максимальной скорости 5 мин. Отбирают надосадочную жидкость и анализируют.
Методика: В петлю хроматографа вводят 200 мкл испытуемого раствора субстанции. Детектор хроматографа устанавливают на 280 нм, скорость потока 1 мл/мин. Включают градиентный режим: фаза А - 100% - 1 мин; градиент от 0% фазы Б до 60% фазы Б за 15 мин; 60 % фазы Б - 1 мин; градиент от 60% до 0% фазы Б за 1 мин. Данные анализа обсчитывают с помощью встроенной программы Breeze V 3.30 C Waters, каталожный номер 667001583. На основании этих данных рассчитывают усреднённое время удерживания Тср для каждого пика и сумму площадей пиков Sni для каждой группы пиков в каждом опыте: Sn(a-d) =сумма Sni для 1-й группы пиков и Sn(e-g) =сумма Sni для 2-й группы пиков, где i - пик (a-d в 1-й группе и e-g во 2-й группе),
Тп(ср)=сумма Tn(a-g)/m, где n - номер опыта,
m - число используемых значений времен удерживания в расчёте для каждого опыта
Субстанция признаётся подлинной при соблюдении следующих условий: • сумма площадей 1-й группы пиков Sn(a-d) (время удерживания 11,66-12,22 мин) при анализе ВЭЖХ не должна превышать 10,5%; В этой группе должны присутствовать пики с усреднённым временем удерживания: 11,709; 11,856; 11,990; 12,156.
• сумма площадей 2-й группы пиков Sn(e-g) (13,31-13,79 мин) должна находиться в диапазоне 7596%. В этой группе должны присутствовать пики с усреднённым временем удерживания: 13,338; 13,550; 13,749. Влагосодержание определяли с помощью лабораторного прибора AND MS-70 Moisture Analyzer (температура высушивания - 105° С, точность определения - 0,01% /мин).
Результаты и обсуждение. Учеными Института молекулярной медицины ФГАО ВО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет) МЗ РФ был разработан способ получения усеченной
формы полноразмерного тритикаина-альфа, соответствующей его каталитическому домену (т.е. без лидерного пептида и гранулин-подобного домена) с высоким выходом и уровнем протеолитической активности, содержащих последовательность из 6 His в N-терминальной области рекомбинантного белка (Патент RU 2 603 054 C2). Однако, полученный рекомби-нантный белок не соответствовал показателям, изложенным в ГФ XIV. В связи с этим, необходимо было ввести криопро-текторы для получения стабильного лио-филизата с целью создания нового лекарственного препарата в форме твердых капсул. В качестве криопротекторов исследовали маннитол и ПВП (таблица 1) [4, 5]
Таблица 1
Экспериментальные составы смеси тритикаина- альфа и криопротекторов
№ Состав смеси Соотношение компонентов (%)
1 Тритикаин-альфа 100
2. Тритикаин-альфа:маннитол 90 :10
3 Тритикаин-альфа:маннитол 75:25
4 Тритикаин-альфа: маннитол 50:50
5 Тритикаин-альфа: маннитол 25:75
6 Тритикаин- альфа:маннитол: ПВП 50:25:25
7 Тритикаин- альфа:маннитол: ПВП 50:30:20
8 Тритикаин- альфа:маннитол: ПВП 50:40:10
Субстанцию тритикаин- альфа получали по технологии, представленной в Патенте RU 2 603 054 C2 [6]. Рекомбинант-ный белок тритикаин-альфа, сконцентрированный на ячейке Amicon с мембраной PM-10 (Millipore) с последующим диализом против фосфатно-солевого буфера (PBS, рН 7.4, 4оС, 18 ч), аликвотировали по стеклянным флаконам, герметично закрывали. Смесь замораживали при температуре -70оС (не менее 2 ч) в морозильнике Sanyo Ultra Low MDF-U3086S (-70оС) и помещали в установку для лиофилизации (Jouan LP-3, Франция). Процесс лиофилиза-ции проводили в течение 24 ч при температуре испарителя -50оС и вакууме 0,030,04 миллибар. По окончании процесса
лиофильного высушивания, флаконы вскрывали. К сублимационно высушенному рекомбинантному белку тритика-ину-альфа (0,02 г) добавляли воду очищенную в количестве 1,5 мл. В процессе растворения белка во избежание потерь содержимое флакона с тритикаином-альфа тщательно перемешивали, переносили в сосуд, используемый для сублимационной сушки, а флакон дополнительно ополаскивали 0,5 мл воды очищенной и объединяли с первой порцией раствора белка. Затем в раствор вводили вспомогательные вещества в соотношениях, указанные в таблице 1, тщательно перемешивали до растворения последних. Сосуд укупоривали крышкой-переходником для
крепления к сублимационной сушилке. Далее смесь замораживали при температуре -70оС (не менее 2 ч) в морозильнике Sanyo Ultra Low MDF-U3086S и помещали в установку для лиофилизации (Jouan LP-3, Франция). Процесс лиофилизации проводили в течение 24 ч при температуре испарителя -50оС и вакууме 0,03-0,04 миллибар.
Оценку качества полученной субстанции с целью определения оптимального состава вспомогательных веществ оценивали по следующим показателям: внешний вид, способность к измельчению, влагосодержание и образование возможных продуктов распада рекомбинантного. Полученные результаты представлены в таблице 1 и 2.
Рисунок 1 - Влагосодержание в исследуемых образцах
Как видно их рисунка 1, влагосодержание во всех образцах не превышало 3%. Следует также отметить, что в процессе лиофилизации продуктов распада белка не обнаружено. На хроматограммах были четко выражены только две группы пиков
в области времени выхода (удерживания) 11,66-12,22 мин и 13,31-13,79 мин, которые соответствуют характерным особенностям субстанции - рекомбинантному белку тритикаин-альфа.
Таблица 2
Результаты исследований образцов ^ субстанции тритикин-альфа
№ состава Внешний вид Способность к разрушению (измельчению)
1 Лиофилизированная субстанция, волокнистая Отсутствует
2. Лиофилизированная субстанция в виде таблетки, волокнистая Незначительная
3 Лиофилизированная субстанция в виде таблетки, кристаллическая, с отдельными включениями волокон При измельчении наблюдается волокнистость материала
4 Лиофилизированная субстанция в виде таблетки, кристаллическая При измельчении материал пылит, образуя очень мелкую фракцию
5 Лиофилизированная субстанция в виде таблетки, кристаллическая При измельчении материал пылит, образуя очень мелкую фракцию
6 Лиофилизированная субстанция в виде таблетки, кристаллическая Материал хрупкий, измельчается быстро, получается однородный порошок
7 Лиофилизированная субстанция в виде таблетки, кристаллическая Материал хрупкий, плотный, измельчается с большим усилием.
8 Лиофилизированная субстанция в виде таблетки, кристаллическая Материал хрупкий, плотный, измельчается с большим усилием.
В результате исследования было выявлено, что использование маннитола (составы 2-5) приводило к образованию хрупких, волокнистых частиц, пылящих легко электризуемых смесей. Наличие признака электризуемости не обеспечивало точности извлечения смеси из флаконов после сублимационной сушки. Оптимальными характеристиками обладали смеси тритикаина-альфа в сочетании с криопротектором был введен в состав лиофилизата - ПВП (составы 6 - 8). Так,
при содержании ПВП в смесях ниже 25% -увеличивало волокнистость сублимированного продукта, он не разрушался при надавливании.
Таким образом, на основании проведенных исследований состав 6 (трити-каин-альфа: маннитол: ПВП в соотношении (50:25:25) или (2:1:1)) является наиболее оптимальным для технологии получения субстанции рекомбинантного белка-тритикаин-альфа.
