CC BY
33
УДК 615.453.4
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-3-88-93
ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ КАПСУЛ С РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКОМ
ТРИТИКАИНОМ -АЛЬФА
Тарасов В. В., Краснюк И.И., Козлова Ж. М.
ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет),
г. Москва, Российская Федерация
THE RATIONALE FOR THE CHOICE OF EXCIPIENTS FOR CREATING CAPSULES WITH THE RECOMBINANT PROTEIN
TRITICAINE-ALPHA
Tarasov V.V., KrasnyukI.I., KozlovaZh.M.
First Moscow state medical university named after I.M. Sechenov, (Sechenov University),
Moscow, Russian Federation
Аннотация. В данной работе научно-обоснован выбор вспомогательных веществ для дальнейшей разработки новой лекарственной формы - твердых капсул с рекомбинантным белком трити-каин-альфа. Проведены результаты сравнительной характеристики основных технологических показателей, таких как насыпная плотность до и после уплотнения, сыпучесть, угол естественного откоса, индекс Карра, коэффициент Хаустнера субстанции рекомбинантного белка тритикаин-альфа и вспомогательных веществ (микрокристаллическая целлюлоза Vivapur® 102, кроскар-меллоза натрия (Solutab® A), крахмал кукурузный; прежелатинизированный крахмал (Ликатаб C-LM); силикатированная микрокристаллическая целлюлоза (Prosolv® SMCC); бета-циклодекстрин (Клептоза)). На основании полученных данных определены вспомогательные вещества, имеющие близкие по значениям технологические показатели. Ключевые слова; рекомбинантные белки, три-тикаин-альфа, вспомогательные вещества, технологические характеристики, капсулы. Annotation. In this work, the choice of excipients for the further development of a new dosage form - hard capsules with the recombinant protein triticaine-alpha, is scientifically substantiated. The comparative characteristics of the main technological indicators, such as bulk density before and after compaction, flowability, angle of repose, Carr index, Houstner coefficient of the substance of the recombinant protein triticain-alpha and excipients (micro-crystalline cellulose Vivapur® 102, croscarmellose sodium (Solutab® A) ), corn starch; pregelatinized starch (Licatab C-LM); silicate microcrystalline cellulose (Prosolv® SMCC); beta-cyclodextrin (Kleptose)). Based on the data obtained, excipients with similar technological parameters are determined. Keywords; recombinant proteins, triticain-alpha, excipients, technological characteristics, capsules.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК [1] Патент RU 2603054 «Способ получения белков семейства цистеиновых протеаз пшеницы (triticum aestivum) и препарат белка тритикаин-альфа, полученный этим способом» [2] Патент RU 2674763 «Способ получения лекарственного средства для лечения REFERENCES [1] Patent RU 2603054 "A method for producing proteins of the cysteine protease family of wheat (triticum aestivum) and a protein preparation of triti-cain-alpha obtained by this method" [2] Patent RU 2674763 "A method of obtaining a medicinal product for the treatment of celiac disease and a medicinal product taught in this way
целиакии и лекарственное средство, поученное эти способом»
[3] Фармацевтическая разработка: концепция и практические рекомендации. Научно-практическое руководство для фармацевтической отрасли. -М. Издательство Перо, 2015. 472 с
[4] Краснюк И.И., Тарасов В.В., Козлова Ж.М., Степанова О.И., Краснюк (мл), И.И., Кугач В.В. Изучение технологических и физико-химических свойства тритикаин-альфа.// Вестник фармации. 2019.№ 1 (83). С. 53-57.
[5] Государственная фармакопея РФ XIV изд. Т. II. - М.: ФЭМБ, 2018.
[6] Handbook of Pharmaceutical Excipience. Sixth edition// Published by the Pharmaceutical Press An imprint of RPS Publishing- Typeset by Data Standards Ltd, Frome, Somerset Printed in Italy by L.E.G.O., London SE1 7JN, UK.
[3] Pharmaceutical development: concept and practical recommendations. Scientific and practical guidance for the pharmaceutical industry. -M. Perot Publishing House, 2015.472 s
[4] Krasnyuk I.I., Tarasov V.V., Kozlova Zh.M., Ste-panova O.I., Krasnyuk (ml), II, Kugach V.V. The study of technological and physico-chemical properties of triticaine-alpha. / / Bulletin of pharmacy. 2019.No 1 (83). S. 53-57.
[5] State Pharmacopoeia of the Russian Federation XIV ed. T. II. - M.: FEMB, 2018.
[6] Handbook of Pharmaceutical Excipience. Sixth edition // Published by the Pharmaceutical Press An imprint of RPS Publishing - Typeset by Data Standards Ltd, Frome, Somerset Printed in Italy by L.E. G. O., London SEI 7JN, UK.
Тритикаины (triticain-альфа, -p, -y) -высококонсервативные папаин-подобные цистеиновые эндопротеазы пшеницы. Ци-стеиновые протеазы распространены в растениях и экспрессируются в их различных органах. Предполагается, что эти ферменты участвуют в стадии специфическом расщеплении и пост-трансляционных модификациях запасающих белков. Среди па-паин-подобных цистеиновых протеаз растений наиболее широко изучены ферменты риса и ячменя - оризаины (oryzain-альфа, -р, -у) и эндопептидазы ЕРВ (barley cysteine proteinase B-1, -2), однако проте-азы пшеницы начали изучать относительно недавно [1].
В рамках получения субстанции тритикаин -альфа была выбрана протеаза пшеницы Triticum aestivum - тритикаин-альфа, так как пшеница играет существенную роль как источник питания в России, а значит, наиболее подходит для разработки отечественных лекарственных препаратов для лечения целиакии. Было доказано, что тритикаин-альфа проявляет глютеназную и коллагеназную активности при 37°C в диапазоне рН 3,5-6,5. Колла-геназная активность тритикаина-альфа делает его потенциальным терапевтическим агентом в лечении ран и ожогов, а
глютеназная активность фермента указывает на большой потенциал тритикаина-альфа для разработки фармацевтических препаратов, эффективных при лечении непереносимости глютена, в частности, целиакии. Данный факт является основанием к разработке нового инновационного лекарственного препарата для лечения и профилактики обострений заболевания путем ферментативной заместительной терапии на основе применения в качестве действующего вещества рекомби-нантного белка тритикаина-альфа.
Разработка новой лекарственной формы - капсул с рекомбинантным белком ттитикан-альфа требует выполнения следующих задач: изучения физико-химических и технологических свойств действующего вещества, научно-обоснованного использования вспомогательных веществ; использования современных фармацевтических технологий Получение лекарственной формы с необходимыми физико-химическими, структурно-механическими, биофармацевтическими свойствами, способствующих достижению требуемых фармакокинетических и фармако-динамических показателей, определенных уровней качества готовых лекарственных
средств является основной целью введения вспомогательных веществ [2].
Целью данной работы является обоснование выбора вспомогательных веществ для дальнейшей разработки новой лекарственной формы - твердых капсул с тритикаином-альфа.
Материалы и методы. Тритикаин-альфа -лиофилизированный порошок (трити-каин-альфа : маннитол : поливинилпирро-лидон (ПВП) в процентном соотношении 2 : 1 : 1) [3].
В качестве вспомогательных веществ использовали: микрокристаллическая целлюлоза Vivapur® 102 (USP, BP, Ph.Eur); кроскармеллоза натрия (Solutab® A, USP/NF, Ph.Eur); крахмал кукурузный (USP/NF, Ph.Eur); прежелатинизированный крахмал -Ликатаб C- LM (USP, BP, JP, Ph.Eur); силикатированная микрокристаллическая целлюлоза (Prosolv® SMCC) (USP/NF, Ph.Eur); бета-циклодекстрин (Клептоза) (USP/NF, Ph.Eur).
Оценку качества образцов проводили в соответствии с требованиями ГФ XIV по физико-химическим и технологическим показателям: степень сыпучести (ОФС 1.4.2.0016.15, прибор Erweka GTL. Германия); насыпной объем (ОФС 1.4.2.0016.15, тестер ERWEKA SVM 1, Германия). Влагосодержание определяли с помощью лабораторного прибора AND MS-70 Moisture Analyzer (температура высушивания - 105° С, точность определения -0,01% /мин).
Определение белка проводили спектро-фотометрический методом с раствором бицинхониновой кислоты (ВСА).
Раствор А - Раствор бицинхониновой кислоты (BCA) (готовый раствор, Каталожный номер B9643, Sigma-Aldrich, США (или в составе Набора для определения белка «Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit», Каталожные номера BCA1 и B9643, Sigma Aldrich, США)). Раствор Б - 4 % раствор меди (II) сульфата пентагидрата (готовый раствор, каталожный номер C2284, Sigma-Aldrich, США (или в составе Набора
для определения белка «Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit», каталожный номер BCA1 и B9643, Sigma-Aldrich, США)). Буфер В -PBS (1 таблетку фосфатного буфера (PBS, Каталожный номер P4417, Sigma-Aldrich, США) растворяют в 200 мл воды).
Стандартный раствор белка - готовый раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) с концентрацией белка 1 мг/мл (каталожный номер P0914, SigmaAldrich, США). Калибровочные растворы белка в концентрации (0,2; 0,4; 0,6: 0,8; 1,0) с буферным раствором (Буфер В -PBS (Каталожный номер № №P4417, раствор в 200 мл воды) в дальнейшем модифицируют реагентами для получения окрашенных веществ.
Приготовление модифицированного раствора для окрашивания калибровочных растворов белка (раствор Г). Смешивают 6 мл раствора А и 120 мкл раствора Б в пластиковой пробирке с крышкой. Для окрашивание калибровочных растворов белка смешивают 30 мкл каждого раствора белка с 600 мкл раствора Г, смесь выдерживают 30 мин при 37 0С и проводят измерения оптической плотности на спектрофотометре. при длине волны 562±2 нм. На основании полученных данных строят калибровочный график зависимости концентрации белка (мг/мл) от поглощения при длине волны 562±2 нм.
Измерение содержания белка в капсулах тритикаин-альфа. Смесь содержимого пяти капсул тритикаин-альфа растворяют в 250 мл буфера В и центрифугируют со скоростью 10000 об/мин. В каждую из 4 пробирок помещают по 30 мкл полученного белкового раствора, добавляют по 600 мкл раствора Г. Растворы выдерживают в течение 30 мин в термостате при 370С, измеряют поглощение при 562±2 нм. Определение содержания белка тритика-ина-а в капсулах проводят по калибровочному графику
Результаты и обсуждение. Фармацевтическую субстанцию тритикаина-альфа получали в соответствии с патентом
RU 2603054 [3]. Рекомбинантный белок тритикаин-альфа помещали в сосуд с крышкой-переходником для крепления к сублимационной сушилке. Замораживали до температуры -70оС в морозильнике Sanyo Ultra Low MDF-U3086S (-70оС) и выдерживали в течение 2 часов. Процесс лио-филизации проводили в течение 24 ч при температуре испарителя -50оС и вакууме 0,03-0,04 миллибар. По завершении лио-фильной сушки флаконы вскрывали.
Технологические характеристики субстанции лиофилизата тритикаин -альфа (тритикаин-альфа : маннитол : ПВП в соотношении 2 : 1 : 1) следующие: сыпучесть 10,9±0,2 г/с; насыпная плотность до уплотнения - 435,80±0,10 кг/м3, насыпная плотность после уплотнения - 531,04±0,02 кг/м3, угол естественного откоса составил 36,6±0,30 , пористость - 74,59+0,75 %, коэффициент Хаустнера - 1,31±0,078, индекс Карра - 17,9. Потеря в массе при высушивании или вода составила не более 1,0%
[4].
Таблица 1
Технологические характеристики субстанции тритикаин-альфа и вспомогательных веществ
На этапе фармацевтической разработки готовой лекарственной формы необходимо подобрать вспомогательные вещества, образующие сыпучую, хорошо дозируемую смесь, не расслаивающуюся в процессе смешения и дозирования. Следует отметить, что при выборе вспомогательных веществ необходимо учитывать индивидуальные технологические характеристики компонентов, предполагаемых к введению в состав содержимого капсулы в качестве той или иной технологической группы. С целью выбора вспомогательных веществ для получения массы капсулиро-ваниия изучили влияние их на технологические характеристики тритикаина-альфа., а именно: насыпная плотность до и после уплотнения, сыпучесть, угол естественного откоса, индекс Карра, коэффициент Хаустнера. Вспомогательные вещества и полученные результаты подставлены в таблице 1.
Наполнитель Насыпная плотность до уплотнения, кг/м3 Насыпная плотность поле уплотнения, кг/м3 Сыпучесть, г/с Угол естественного откоса, град Индекс Карра Коэффициент Ха-уснера
(Тритикаин-а, Маннитол, ПВП) 435,80± 13,10 531,04±13,02 10,09± 1,82 36,6±2,73 17,9 1,21
Кроскармелоза натрия 401,5±12,15 538,03± 13,09 7,34± 1,92 47,9±2,65 19,3 1,34
Клептоза 392,60± 12,89 429,6±13,08 16,03± 1,82 36,9±2,75 11,4 1,09
Крахмал кукурузный 636,0±12,03 869,4±12,97 11,2±1,92 42,7±2,82 18,9 1,36
Ликатаб С 583,4±13,05 662,3±13,52 14,7±1,92 32,5±2,73 11,9 1,14
Prosolv SMCC 90 394,80± 13,10 451,2±13,02 16,06± 2,02 32,6±2,83 12,63 1,14
МКЦ 102 603,4±13,05 692,1±13,52 14,3±2,02 30,3±2,73 12,86 1,15
Как видно из таблицы 1, наиболее близкими к технологическим показателям субстанции тритикаина-альфа оказались клептоза, Ликатаб С, Prosolv SMCC 90, МКЦ-102. Крахмал кукурузный незначительно уступает по технологическим показателям, что может привести к ухудшению сыпучести рекомбинантного белка.
Кроскармелоза натрия не обладает необходимыми технологическими свойствами, поэтому не будет использована в дальнейшем.
Субстанция тритикаин -альфа представляет собой лиофилизат рекомбинант-ного белка и имеет волокнистую структуру, поэтому необходимо изучить
совместимость со вспомогательными вещества. Исследование совместимости проводилось согласно ICHQ 10. Для исследования стабильности были собраны смеси вспомогательных веществ (плацебо) и тритикаина-альфа (тритикаин -альфа: маннитол: ПВП в соотношении 2:1:1) со всеми вспомогательными веществами, взятыми в максимальных соотношении (1:6), исходя из массы содержимого капсулы размером «0». Пробные образца
Таблица 2
Результаты совместимости вспомогательных веществ с тритикаином-альфа при
температуре 2°С ^^ п=5)
плацебо и модельных смесей были помещены на 4 недели в климатический шкаф в условиях, рекомендованных ГФ XIV издания (4 °С и 8 °С., влажности 60± 5%). Оценку проводили по следующим показателям: внешний вид, влажность, возможные продукты разложения, количественное содержание белка в смеси. Полученные результаты представлены в таблицах. 2 и 3
№ п/п Смесь/ соотношение компонентов Показатели
Внешний вид Влажность Содержание белка Продукты разложения белка
1. Тритикаин-альфа/ МКЦ-102 (1:6) Однородная волокнистая масса от белого до серовато-белого цвета порошок 2,76±0,162 20,8± 1,98 Отсутствуют
2. Тритикаин-альфа/ клеп-тоза (1:6) Однородная волокнистая масса от белого до серовато-белого цвета порошок 2,81±0,152 20,7± 1,88 Отсутствуют
3. Тритикаин-альфа/ Ликатаб С (1:6) Однородная волокнистая масса от белого до серовато-белого цвета порошок 2,74±0,168 20,8±1,93 Отсутствуют
4. Тритикаин-альфа/ Рг^о^ smcc 90 (1:6) Однородная волокнистая масса от белого до серовато-белого цвета порошок 2,82±0,144 20,7± 1,91 Отсутствуют
Таблица 3
Результаты совместимости вспомогательных веществ тритикаином-альфа при
температуре 8 ^ ^^ п=5)
№ п/п Смесь/ соотношение компонентов Показатели
Внешний вид Влажность Содержание белка Продукты разложения белка
1. Тритикаин-альфа/ МКЦ-102 (1:6) Однородная волокнистая масса от белого до серовато-белого цвета порошок 2,81±0,162 20,6± 1,93 Отсутствуют
2. Тритикаин-альфа/ клептоза (1:6) Однородная волокнистая масса от белого до серовато-белого цвета порошок 2,76±0,152 20,7± 1,89 Отсутствуют
3. Тритикаин-альфа/ Ликатаб С (1:6) Однородная волокнистая масса от белого до серовато-белого цвета порошок 2,84±0,168 20,8± 1,83 Отсутствуют
4. Тритикаин-альфа/ Prosolv smcc 90 (1:6) Однородная волокнистая масса от белого до серовато-белого цвета порошок 2,82±0,144 20,4± 1,91 Отсутствуют
Наблюдения за указанными смесями подтвердили совместимость тритикаин-альфа со вспомогательными веществами, взятыми в рекомендуемых концентрациях. Ни в одной смеси не наблюдается изменение физических характеристик и накопление продуктов распада белка, способных негативно влиять на качество и эффективность лекарственного препарата.
Основываясь на результатах проведенных исследований, можно сделать вывод, что вспомогательные вещества (МКЦ 102, Prosolv smcc 90, Ликатаб С, клептоза) совместимы с рекомбинантны белком тритикаин-альфа и могут быть рекомендованы для разработки оптимального состава капсул с тритикаином-альфа.
