ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРИТИКАИНА-ɑ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЦЕЛИАКИИ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»



УДК 615.453.4- 615.453.2

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-1-55-61

ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРИТИКАИНА-а ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЦЕЛИАКИИ

Краснюк И.И., Тарасов В. В., Свистунов А.А.

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова (Сеченовский Университет), г. Москва, Российская Федерация

STUDY OF SPECIFIC PHARMACOLOGICAL ACTIVITY OF TRITICAIN-а IN THE TREATMENT OF CELIAKIA

Krasnyuk I.I., Tarasov V.V., Svistunov A.A.

First Moscow state medical university named after I.M. Sechenov, (Sechenov University),

Moscow, Russian Federation

Аннотация. Данная работа посвящена определению специфической активности, нового лекарственного препарата для лечения целиакии на оригинальной модельной системе in vitro на основе дифференцированных энтероцитоподобных клеток перевиваемой колоноректальной карциномы человека линии Сасо-2, воспроизводящая основные патогенетически значимые элементы целиакии. Эффективность лечебного действия тритика-ина-а оценивалась по его способности нейтрализовать токсические эффекты глютена и его ферментных гидролизатов на культивируемые клетки Сасо-2. Также исследовали способность тритикаина-а расщеплять in vitro основные токсичные компоненты глютена (в частности, глиа-диновые пептиды), инициирующие воспалительные реакции на глютену пациентов с целиакией. Ключевые слова: целиакия, тритикаин-а, специфическая фармакологическая активность, реком-бинантный белок, глютен. Annotation. This work is devoted to the determination of specific activity, a new drug for the treatment of celiac disease on the original in vitro model system based on differentiated enterocyte-like cells of transplantable human colorectal carcinoma of the Caco-2 line, reproducing the main pathogenetically significant elements of celiac disease. The effectiveness of the therapeutic effect of triti-cain-a was evaluated by its ability to neutralize the toxic effects of gluten and its enzymatic hydrolysates on cultured Caco-2 cells. The ability of triticaine-a to cleave in vitro the major toxic components of gluten (in particular, gliadin peptides) that trigger inflammatory reactions to gluten in patients with celiac disease was also investigated. Keywords: celiac disease, triticain-a, specific pharmacological activity, recombinant protein, gluten.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК [1] Януль А. Н., Слезник П. Б., Шелетун В.Г. Целиакия - заболевание «хамелеон» // Военная медицина, Москва - 2014. - №1 -С.132-136. [2] Бельмер С.В., Гасилина Т.В. Целиакия: исходы и новые подходы к диагностике // Лечащий Врач. Москва - 2012. - № 8 - С. 56-61. [3] Green PH., Jabri B. Celiac disease // Lancet -2003 - 362 - P.383-391. REFERENCES [1] Yanul A.N., Sleznik P. B., Sheletun V.G. Celiac disease - the disease "chameleon" // Military medicine, Moscow - 2014. - No. 1 - S.132-136. [2] Belmer S.V., Gasilina T.V. Celiac disease: outcomes and new approaches to diagnosis // Attending Physician. Moscow - 2012. - No. 8 - S. 56-61. [3] Green PH., Jabri B. Celiac disease // Lancet - 2003 - 362 - P.383-391. [4] The practical guidance of the World Organization of Gastroenterologists (VOG-OMGE) Celiac disease

—--—

~ 55 ~

[4] Практическое руководство Всемирной организации гастроэнтерологов (ВОГ-OMGE) Целиакия //Целиакия (перевод с англ). -2005 - 150 с.

[5] Adornetto G., Volpe G., De Stefano A. et al. An ELIME assay for the rapid diagnosis of coeliac disease // Anal Bioanal Chem. 2012, May; 403 (4):Р. 1191-1194.

[6] Civit L., Fragoso A., Holters S. et al. Electrochemical genosensor array for the simultaneous detection of multiple highrisk human papillomavirus sequences in clinical samples // Anal Chim Acta. 2012, Feb 17; 715:. Epub 2011, Dec 16. Р.93-98.

[7] Бельмер С. В. Эпидемиология целиакии: факты и выводы. //Лечащий врач, 2013, №1, С. 56-59.

[8] Zimmermann C., S. Rudloff, G. Lochnit, S. Arampatzi, W. Maison, and K.-P. Zimmer, Epithelial Transport of Immunogenic and Toxic Gliadin Peptides In Vitro, / / PLoS One, vol. 9, no. 11, p. e113932, 2014.

// Celiac disease (translated from English). -2005 - 150 s.

[5] Adornetto G., Volpe G., De Stefano A. et al. An ELIME assay for the rapid diagnosis of coeliac disease // Anal Bioanal Chem. 2012, May; 403 (4): R. 1191-1194.

[6] Civit L., Fragoso A., Holters S. et al. Electrochemical genosensor array for the simultaneous detection of multiple highrisk human papillomavirus sequences in clinical samples / / Anal Chim Acta.

2012, Feb 17; 715 :. Epub 2011, Dec 16. P.93-98.

[7] Belmer S. V. Epidemiology of celiac disease: facts and conclusions. // The attending physician,

2013, No. 1, S. 56-59.

[8] Zimmermann C., S. Rudloff, G. Lochnit, S. Arampatzi, W. Maison, and K.-P. Zimmer, Epithelial Transport of Immunogenic and Toxic Gliadin Peptides In Vitro, // PLoS One, vol. 9, no. 11, p. e113932, 2014.

Введение Целиакия (болезнь Ги - Гер-тера - Гейбнера, или инфантилизм кишечный, или глютеновая энтеропатия) - мультифак-торное заболевание, сопровождающееся поражением ворсинок тонкого кишечника в результате их взаимодействия с некоторыми белками, содержащимися в продуктах питания [1-3]. У пациентов, страдающих целиа-кией, повреждается слизистая оболочка кишечника и нарушается всасывание (наблюдается атрофия кишечника) [4, 5]. В результате нарушений и снижения всасываемости в кишечнике, возникает дефицит витаминов, минералов и питательных веществ.К числу вторичных обменных расстройств относятся: нарушение всасывания белка, витамина D и кальция, что приводит к развитию остеопо-роза и формированию рахитных деформаций костной системы [6, 7].

Лечение целиакии проводят с помощью назначения безглютеновой диеты. При отсутствии ремиссии могут быть дополнительно использованы анаболические гормоны, ферментные препараты, антибиотики (после их отмены лечение. В последние годы в литературе, в том числе среди патентов,

появилось описание отдельных разработок в области исследования средств и методов для лечения целиакии, но, несмотря на активную разработку таких препаратов, ни один препарат для лечения целиакии пока не разрешен к применению ни в одной стране мира. В связи с этим нами был разработан лекарственный препарат для перорального применения на основе рекомбинантного белка Тритикаин-а.

Цель исследования. Изучение специфической фармакологической активности ФС рекомбинантного белка тритикаина-а in vitro.

Материалы и методы - Исследуемый препарат. Фармацевтическая субстанция -рекомбинантный белок тритикаин-а.

Культура клеток. В качестве тестовой системы in vitro для воспроизведения основных патогенетически значимых элементов целиакии, была выбрана культура иммортализо-ванных клеток кишечника человека линии Сасо-2 в виде монослоя дифференцированных энтероцитоподобных клеток, так как в сравнении с клетками иных иммортализованных линий они наиболее полно воспроизводят фенотип нормальных эпителиоцитов тонкого кишечника человека [8]. Дифференцированные

—--—

~ 56 ~

клетки линии Сасо-2 приобретают апикально-базолатеральную полярность, на апикальной части формируется щеточная каемка из микроворсинок, формируется упорядоченный белковый комплекс плотных контактов, экпрессируются наиболее важные, с точки зрения межклеточного и внутриклеточного транспорта веществ, ферменты. Таким образом, дифференцированные клетки Сасо-2 приобретают морфологию, характерную для нормальных энтероцитов человека и могут воспроизводить основные функции всасывающего эпителия.

Получение монослоя дифференцированных клеток Сасо-2

Культивирование клеток Caco-2 с целью наращивания клеточной массы проводили в культуральных флаконах (Corning) 25 см2. В качестве питательной среды использовали среду EnteroSTIM и питательную добавку MITO+Serum Extender (Fisher Scientific-BD Bioscience- Corning) с добавлением 0,1% пени-циллин/стрепомицина. Культивирование проводили в стандартных условиях в СО2-ин-кубаторе (при температуре 37 ± 1 °C, влажности 90 ±10%, содержании 5.0 ± 1,0 % С02).

Смену питательной среды производили каждые 48 часов. По достижению клетками 80% конфлюентности, диссоциировали монослой 0,25% раствором Трипсин-ЭДТА, и увеличивали клеточную массу до достижения необходимого количества клеток.

Для активации спонтанной дифферен-цировки клетки Сасо-2 переносили на мембранные вставки типа Transwell (Corning, США), представляющие собой ячейки с полупроницаемой полиэфирной мембраной диаметром 0,3 cм2 и размером пор 0,4 мкм. (рисунок 1).

Клетки Сасо-2 в количестве 100 тыс. в 100 мкл питательной среды помещали в апикальную часть мембранной вставки. Добавляли 100 мкл питательной среды в апикальную часть и 500 мкл питательной среды в ба-золатеральную часть мембранной вставки. Производили смену культуральной среды каждые 48 часов. Клетки культивировали на мембранных вставках в течение 7 дня в стандартных условиях, после чего проводили анализ структурно-функционального статуса монослоя

Transwell insert

Upper compartment

Microporous membrane Lower compartment

Рис. 1. Мембранные вставки типа Transwell Измерение уровня трансэпителиального сопротивления монослоя (TEER)

Для измерения трансэпителиального сопротивления был использован прибор EVOM2 (Epithelial Voltohmmeter). Электрод помещали в апикальный отсек мембранной вставки и измеряли базовый уровень TEER в мембранной вставке, свободной от клеток, а также уровень TEER в мембранной вставке с клетками. Полученные значения TEER переводили в Ом*см2 по формуле:

[измеренное значение] х 0,3 где 0,3 - площадь поверхности мембранной вставки (монослоя), см2

Оценка специфической активности исследуемой субстанции

Токсическое воздействие компонентов глютена на кишечный эпителий in vitro моделировали посредством использования пептидной смеси после реакции гидролиза глютена

~ 57 ~

при 37°С в течение 4 ч ферментами пепсином и трипсином в массовом соотношении глю-тен:пепсин:трипсин - 50:1:1 (положительный контроль). Ингибирование токсического действия пепсин-трипсинового гидролизата глю-тена на монослой проверяли с помощью данного гидролизата глютена, проинкубированного с тестируемыми образцами ФС (эксперимент, т.е. пепсин-трипсин-тритикаинового гидролизата глютена в соотношении 50:1:1:1). Клетки Сасо-2 в количестве 100000/лунку культивировали на мембранных вставках Transwell (Corning, США) в 24-луночных планшетах (Corning, США) в соответствии с описанной выше методикой и, после достижения дифференцированного монослоя, обрабатывали контрольным и экспериментальным гид-ролизатами глютена с конечной концентрацией 1000 мкг/мл.

По истечении срока инкубации эффекты от воздействия контрольного и

510

сч

<

340

сп

170

экспериментального гидролизатов оценивали количественно с помощью измерения уровня трансэпителиального сопротивления TEER, рассчитываемый по формуле:

sample — ^control) * 0,3

где R sample, Rcontrol - измеренные значения сопротивления (Ом) образцов (положительный контроль и эксперимент) и отрицательного контроля (интактный монослой), соответственно.

Показателем специфической фармакологической активности фармацевтической субстанции рекомбинантного белка тритика-ина-а является увеличение TEER при воздействии на клетки гидролизованных пептидов глютена, обработанного опытными образцами ФС тритикаина-а.

Результаты и обсуждение. Результаты исследования специфической фармакологической активности опытных образцов ФС рекомбинантного белка тритикаина-а in vitro представлены на рис. 2.

Mock GPT GTPT

Рис. 2. Измеряемый параметр TEER (уровень трансэпителиального сопротивления) при воздействии на модельные клетки линии Сасо-2 (Mock - интактные клетки Сасо-2) токсичного пепсин-трипсинового гидролизата глютена, GPT) и обработанного тритикаином гидролизата (пепсин-трипсин-тритикаинового гидролизата глютена, GTPT).

Как видно из рис. 2, воздействие на модельные клетки Сасо-2 пепсин-трипсинового гидролизата глютена ^РТ), наиболее вероятно содержащего токсичные пептиды, привело к снижению уровня трансэпителиального сопротивления монослоя (по сравнению с интактными клетками - Моек). Однако подобный процесс не происходит при воздействии на Сасо-2 предварительно обработанного тритикаином гидролизата.

Активность ФС рекомбинантного белка тритикаина-а оценивали в различных физиологически и фармакологически значимых условиях. Для этого пшеничный глютен

инкубировали с тритикаином-а в массовом соотношении 20:1 в течение 5 мин в кислой, нейтральной и слабощелочной среде при различных температурах. Содержание полученных продуктов гидролиза глютена, анализировали с помощью SDS-PAGE или с помощью аналитической ВЭЖХ (Рис.3). Было обнаружено, что тритикаин-а эффективно катализирует деградацию клейковины при рН 3,6, 5,6 или 6,5 и при температурах от 4 до 45° С (Рис.ЗА). Полное переваривание наблюдалось при кислом рН при 45°С, хотя при 37°С реакция была почти такой же эффективной. ВЭЖХ-мо-ниторинг продуктов протеолиза тритикаина-

—--—

~ 58 ~

а подтвердил значительное накопление нескольких пептидных продуктов (Рис.ЗВ).

kDa TTC Git 45

-t'-'C 15"C 25°C 37°C 45°G

-i

t I

рНв.5

pH S.Ë

pH 31

e.Ofl 9.00 10.00 11.00 -12.00 13.ÚO 1^.00 15.00 1S.OO

Рисунок 3. (А) SDS-PAGE пшеничного глютена ^К), инкубированного с тритикаином-а (ТСс) в массовом соотношении 20: 1 в течение 5 мин при указанных температурах и значениях рН. Позиции стандартов молекулярной массы (kDа) показаны в левой колонке. (В) Хроматограмма ВЭЖХ, подтверждающая накопление нескольких продуктов пептида после инкубации пшеничного глютена с тритикаин-а в массовом соотношении 20: 1 при

37°С, рН 3,4 в течение 5 мин.

Более точное исследование активности тритикаина-а при 37°C показало его значительную ферментативную активность в широком диапазоне рН от 3,0 до 6,5 (Рис.4). Следует подчеркнуть, что тритикаин-а проявляет

kDa rte Oit 2.Ô 3.4 3$

выраженную активность глютеназы при 37° С, т.е. в физиологических условиях человека, и, следовательно, может использоваться для ферментативного применения у человека.

РН

4.0 4,В

5.0 5.6 60 6.5 7 0

45

31

21-\

Рис. 4. SDS-PAGE пшеничного глютена ^К), инкубированного с тритикаином-а (Т:с) в весовом соотношении 20:1 в течение 5 мин при 37° С при указанных значениях рН. Позиции стандартов молекулярной массы (kDa) показаны в левой колонке.

Патогенез целиакии включает воспалительные реакции на продукты пищеварения

экзогенного глютена. Основным токсичным продуктом в этом отношении является 33-

—--—

~ 59 ~

мерный Pro/Gln-обогащенный пептид а-глиа-дина.. Более того, еще четыре различных токсичных пептида, полученных из а-глиадина и у-глиадина, были идентифицированы в некоторых исследованиях (Wieser and Koehler, 2008, 2012). Чтобы проверить способность тритикаина-а детоксифицировать пептиды глютена, были установлены сайты расщепления в белковых компонентах клейковины, таких как а-глиадин, у-глиадин, ш-глиадин и глютенин (Рис. 5).

С этой целью пептиды, полученные из катализируемого тритикаином-а расщепления

пшеничного глютена, анализировали с помощью тандемной масс-спектрометрии MALDI TOF/TOF чтобы отличить первичные сайты расщепления и участки полного протеолиза. Общие фракции протеолитических пептидов клейковины подвергали анализу МС, после чего выбирали основные пептидные сигналы и регистрировали их спектры фрагментации с использованием MS/MS. Полученные комбинированные спектры (MS+MS/MS) были проанализированы путем поиска соответствующих пептидов среди растительных белков.

А

ct-gliadin y-gliadin

Р F РРО . .QPirg« FLQPR. ,2PFÍC

PFPPO. ■QfYPÜ PHQPC, QCFPQ

FPQPC. LPiPa PHfPC. .QQFPQ

FPQÍ*2 ■ .LPVPQ PQQPQ- ■QQFLQ

PFPPQ. . QSYPQ QPQQP, YPQGP

QQEV'i . OQOPF QOlilO. . IbK?L

QPFPS . . QQPYL IRFbF, .QLIQG

ObPYP, . CH^iPi" QOPFC QQPQR

PYLQ-; - . . QPF-PQ HQTFh: ■HQPQ«

PFPSQ, ■QCYLÜ QQPQO. QFLQP

PYPOP. .UPPRP

QPQLP. . YPQFQ

YLQLQ . PFPQP

QPYIJQ . LQfFP

ot-gliadtn

o-glisdin

PPTTT.KPFPO QPQCP. ["PLP.P QPQOQ-LSQQP

PLPQQ.PQQPF

glutenin

LVLPO . ÍJCJI ?F QQCbV. LPQQQ I PGLE . RPSQO PSTJDjQ . -QfLNPO QLVLE1. QQQI P

HKTFLILALL AIÍATTATTJ

£1

121

lai

241

'oPYPQPQiiFP

QQQOQQQQQQ

PEQ5RCQA1H

QNPQAQGSVQ

P"M"Ijí¿EÍQ^>

1 liQQ 1 LQQQL HVVHAIILHg PffiLPCFEEI

y-gliadin

1 KKTLLILTIL AHAITI MM

61 HQPcfeoFPC? QQ FLQP

12 1 FOFQOPÍ3QSF PQQQPSLIQQ

IS 1 QQCCQQLACT PQGLQCAAIH

241 EVI RS LVLRT LPMKCNVÍVE

VEVPVPOLOL FPQPt^L

IPCEDVVLOO

■QHHH HQQQQQ

RNLALETLPA

I4QA DPSGQVC FPQQPQQ

QHPS QOÜ.POE ptjPFRPl^PY HNIAHGSSQV QOQQQFLStJV

MCNVYI PPYC

KPQQQPFLQF

^fPQOPQQFF

SLQQÜLh'PCK SWHSTTHQQ

PDCSTIHAPF

HFLUjaCKPV EQQQÍJIQI LR ASIVAGISGO

\ *

OTPlVgEQSF PCOQOPPFPQ PaPQ'pQYECF QQ^TSQCQQQ LQESTÍQLVQ QLCCOQLWCI 5FOOFOOQYP SGQG3FQPSQ

TTAPV-GIPGT N

HQPF^JQFQX XK PQF^QT ETLÍ

PQTQQPQQPF PQSKQFQQPF

S LV3ELW3 II LPPSDCQVMF.

P LPQLVQGQG HQ PQQPAQ V

33-mer CS initiating oi-gäiadin peptide

i 4 4 4 4 4¡

Li LiPF(F-J PC LPV : PC FC" P F

Рисунок 5. (А) Сайты расщепления тритикаином-а компонентов белка глютена, выявленные путем анализа протеолитических пептидов, полученных из глютена, с использованием тандемной масс-спектрометрии MALDI TOF/TOF.

Звездочка указывает, что в последовательности субстрата было идентифицировано более одного сайта расщепления этого типа. (В) Первичная структура а-глиадина ^ 147883566) и у-глиадина (^ 209971907). Три-тикаин-а, как определено MALDI-TOF, в сочетании с тандемным масс-спектрометрическим анализом после кратковременного (5 мин)

или долгосрочного (> 15 мин) протеин протеин глютена обозначены пунктирными или сплошными стрелками соответственно. «X» обозначает у-глиадиновые аминокислоты R50, Т51, 152, Н56 и Н60 в варианте у-глиадина # gi 209971907 соответствуют Q50, 151, F52, Q56 и Р60 в варианте у-глиадина # gi 209971877 (46-60). Подчеркнуты

—--—

~ 60 ~

последовательности пептидов, полученных из глютена, которые являются токсичными для пациентов с целиакией (Wieser and Koehler, 2008, 2012; Shan et al., 2002). (C) Первичная структура 33-мерного пептида, инициирующего пептид, полученный из а-глиадина (Shan et al., 2002). Определенные после кратковременного (5 мин) или долгосрочного (> 15 мин) протеолиза глютена определяют участки расщепления тритикаин-а, обозначенные пунктирными или сплошными стрелками соответственно.

Было обнаружено, что кратковременное переваривание приводит к образованию ряда фрагментов, полученных из клейковины, из которых два пептида соответствуют у-глиа-дину, пять пептидов соответствуют полученным из глютенина и низкомолекулярного глютенина, тогда как один пептид можно отнести к а-глиадину. Более продолжительный гидролиз глютена приводит к накоплению более 30 пептидов, обнаруживаемых с помощью масс-спектрометрии, среди которых достоверно идентифицированы 13 пептидов MS /

MS, включая 2 фрагмента ш-глиадина, 3 фрагмента у-глиадина и 8 фрагментов а-глиадина.

В совокупности эти данные показывают, что все основные белковые компоненты клейковины, а именно а-глиадин, у-глиадин, ш-глиадин, и глютенин, восприимчивы к про-теолитическому расщеплению тритикаином-а. Таким образом, полученные результаты показывают, что тритикаин-а является перспективным компонентом для медицинского применения, целью которого является полное усвоение глютена и, следовательно, его деток-сикация, как новая стратегия ферментативной терапии для лечения целиакии.

Вывод. Данное исследование продемонстрировало потенциально высокую активность рекомбинантного белка тритикаина-а при лечении пациентов, страдающих целиа-кией. Результаты проведенного эксперимента подтверждают необходимость дальнейших исследований и служат отправной точкой для решения актуальной проблемы фармакотерапии данного распространенного заболевания.

—--—

~ 61 ~