CC BY
117
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ Лабораторная диагностика ♦
УДК 619: 616.98 (.-076)
Разработка нового метода выявления генома вируса энцефаломиелита птиц на основе ПЦР-РВ с зондом Tаq-Mаn
Д.Б. Андрейчук, кандидат биологических наук (andreychuk@arriah.ru), О.С. Осипова, соискатель,
И.А. Чвала, кандидат ветеринарных наук, А.Н. Колотилов, соискатель, В.Н. Ирза, доктор ветеринарных наук,
Н.А. Перевозчикова, доктор биологических наук
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (Владимир).
Для выявления генома ВИЭП разработан метод ПЦР-РВ, совмещенный с реакцией обратной транскрипции в непрерывном формате постановки. Для детекции специфических ампликонов в реакции использован зонд типа TaqMan. Разработанный метод успешно тестирован на препаратах 9 генетически различающихся полевых изолятов вируса, выявленных на территории РФ, а также на известных вакцинных штаммах.
Ключевые слова: вирус инфекционного энцефаломиелита птиц, геном, ПЦР
Сокращения: ВИЭП — вирус инфекционного энцефаломиелита птиц, кДНК — комплементарная де-зоксирибонуклеиновая кислота, ИЭП — инфекционный энцефаломиелит птиц, н. — нуклеотид, ОТ — обратная транскрипция, ОТ-ПЦР — полимераз-но-цепная реакция с обратной транскрипцией, ПЦР-РВ — полимеразно-цепная реакция в режиме реального времени, РНК — рибонуклеиновая кислота, ЦНС — центральная нервная система, ЭИД — эффективная иммунизирующая доза
Введение
Инфекционный энцефаломиелит птиц (эпидемический тремор) характеризуется высокой заболеваемостью и смертностью молодняка, нарушением функции ЦНС, атаксией, тремором головы и шеи, парезами и параличами конечностей, дистрофией мышц. Вызывается ИЭП энтеровирусом, принадлежащим к семейству пи-корнавирусов.
Заболевание снижает экономическую прибыль в птицеводческих хозяйствах, поэтому создание специфичных, чувствительных и быстрых методов диагностики ИЭП на основе ПЦР является актуальной задачей. Лобанов В.А. с соавт. (2002) и Zhiqin Xie с соавт. (2005) предложили методы выявления генома вируса ИЭП на основе ОТ-ПЦР с детекцией результатов реакции в агарозном геле [2, 5]. Более современный формат этого метода — ПЦР-РВ для диагностики ИЭП в 2014 г. предложили Qingtian Liu с соавт. [4]: они использовали праймеры, специфичные для последовательности гена VP1. Однако чувствительность метода была оценена некорректно — с помощью десятикратных разведений препарата ДНК рекомбинантной плазмиды, содержащей кДНК-фрагмент генома ВИЭП, что полностью исключает оценку влияния на чувствительность теста стадии ОТ при работе с нативной вирусной РНК. Ранее было показано, что результат выявления и количественного определения молекул РНК значительно зависит от этапа ОТ. Так, на примере выявления генома вируса болезни блютанга с помощью ОТ-ПЦР-РВ было показано, что чувствительность одной и той
24 рвж • схж
же системы праймеров и зонда может различаться в 100.. .1000 раз при использовании фермента обратной транскрипции разных зарубежных фирм [3]. Предложенный Qingtian Liu с соавт. формат постановки ПЦР-РВ без олигонуклеотидного зонда, с одной парой праймеров и детекцией продуктов амплификации с помощью красителя SYBR Green ставит под сомнение специфичность сигнала реакции. Для подтверждения специфичности результатов после постановки ПЦР-РВ необходимо проводить анализ кривых плавления продуктов амплификации, что увеличивает длительность и затрудняет интерпретацию результатов реакции в случае появления неспецифических продуктов.
Цель исследования
Разработать, оптимизировать и протестировать метод выявления генома ВИЭП на основе ОТ-ПЦР-РВ с оли-гонуклеотидным зондом.
Материалы и методы
Исходные материалы. Для тестирования метода ОТ-ПЦР-РВ был использован препарат ВИЭП вакцинного штамма Calnek с исходным титром 5 lg ЭИД50/мл. Для оценки аналитической чувствительности ОТ-ПЦР-РВ с разными параметрами до и после оптимизации тестировали 5 последовательных десятикратных разведений РНК, выделенной из данного препарата, в свободной от нуклеаз воде (18 МОм) Для определения диагностической чувствительности метода использовали 9 полевых изолятов ВИЭП, выявленных на территории РФ: AEV02/04 (Костромская обл.), AEV01/05 (Ростовская обл.), AEV 02/05 (Ивановская обл.), AEV03/05 (Волгоградская обл.), AEV10/05 (Брянская обл.), AEV02/06 (р. Мордовия), AEV05/06 (Краснодарский край), AEV06/06 (р. Мордовия), AEV11/06 (Владимирская обл.)
Дизайн праймеров и зондов для диагностики ВИЭП. C помощью нуклеотидной базы данных EMBL и программ BioEdit 7.1 и Oligo 6.65 на З'-нетранслируемый регион генома ВИЭП была выбрана оригинальная система праймеров и флуоресцентный зонд в формате «Taq-Man» (табл. 1). Для выбора праймеров анализированы последовательности полного генома всех штаммов ВИЭП, представленных в базе данных GenBank
• № 2/2015
Разработка нового метода выявления генома вируса энцефаломиелита птиц на основе ПЦР-РВ с зондом Tаq-Mаn
(EMBL). Специфичность праймеров и зонда была оценена с помощью on-line ресурса Blast (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Выбранные праймеры и зонд синтезированы фирмой «Синтол» (Москва).
При выборе праймеров учитывалось минимальное содержание самокомплементарных регионов в последовательности праймера.
Выделение нуклеиновой кислоты. Для исследования использовали 1%-ю суспензию тканей головного мозга и поджелудочной железы в забуференном физрастворе (рН 7,4). РНК выделяли из 0,1 мл пробы с помощью набора для выделения нуклеиновой кислоты «РИБО-сорб» («Интерлабсервис», Москва), согласно инструкции изготовителя.
ОТ-ПЦР-РВ. Реакционная смесь содержала 1х буфер для Taq-ДНК-полимеразы, оптимизированное количество MgCl2, по 0,2 мМ каждого дезоксирибонуклео-зидтрифосфата, оптимизированное количество зонда, прямого и обратного праймера в эквимолярном количестве, 2,5 ед. Taq-ДНК полимеразы («СибЭнзим», Россия), 50 единиц обратной транскриптазы MMuLV («СибЭнзим», Россия), воды, не содержащей нукле-аз, — до 20 мкл и 5 мкл раствора РНК. ОТ-ПЦР-РВ ставили по следующей программе: ОТ (42 °С, 20 мин), предварительная инкубация (95 °С, 5 мин), 45 циклов с параметрами — денатурация (95 °С, 20 с), отжиг праймеров и измерение флуоресценции (от 50 до 61 °С, 40 с), элонгация (72 °С, 30 с). При постановке ПЦР-РВ с отдельной стадией ОТ, реакционная смесь ОТ включала в себя обратную транскриптазу с соответствующим 5х буфером, 0,2 мМ каждого дезоксирибонуклеозид-трифосфата и 10 пикомоль шестичленного праймера-рэндома в качестве затравки для реверсии. После реакции реверсии для ПЦР-РВ брали 5 мкл ОТ-смеси.
Оптимизация параметров ОТ-ПЦР-РВ. Для подбора условий постановки ПЦР была проведена оптимизация реакции с РНК вакцинного штамма ВИЭП «Са1-пек» и переменной концентрацией хлорида магния, праймеров, меченого зонда, а также температуры отжига праймеров в цикле ПЦР. Критериями оптимальности реакции были эффективность амплификации (визуально оценивали по углу подъема кривых амплификации в логарифмической фазе) и относительная чувствительность при разных оптимизируемых значениях (по уровню Ст). Для оптимизации концентрации ионов магния готовили 19 аликвот реакционной смеси, добавляя в одинаковую по составу смесь разное количество хлорида магния с конечной концентрацией от 1мМ до 10 мМ с шагом 0,5 мМ. Количество праймеров и зонда оптимизировали с помощью али-квот реакционной смеси без соответствующего оптимизируемого компонента, который вносили в последнюю очередь: в 6 аликвот вносили разное количество праймеров в эквимолярном соотношении — 2,5, 5, 10, 20, 30 и 40 пкмоль каждого; в 4 аликвоты вносили раз-
ное количество зондов — 2, 4, 6, 8 пкмоль. Постановку ОТ-ПЦР-РВ осуществляли одинаково для всех аликвот по вышеуказанной программе с температурой отжига 55 °С. Температуру отжига праймеров оптимизировали при выбранных параметрах реакционной смеси, с градиентом температур стадии отжига от 50 до 61 °С. Накопление продукта после прохождения ПЦР и количество неспецифических продуктов реакции в данном случае оценивали посредством электрофореза в агарозном геле (визуально, по электрофоре-грамме).
Результаты и обсуждение
Выбор праймеров и зонда. По результатам анализа последовательностей полных геномов штаммов ВИЭП «van Roеkel», «Calnek» и изолята «L2Z» были выбраны праймеры, фланкирующие З'-регион генома вируса (6863... 7041 н., длина 178 н.) и соответствующий TaqMan-зонд. Выбранная система праймеров и зонда показала высокую специфичность при оценке с помощью программы Blast: они демонстрировали в совокупности полную комплементарность только на соответствующие участки генома штаммов ВИЭП. В остальных случаях наблюдали некомплементарные области праймеров и зонда, что исключает амплификацию и накопление неспецифического положительного сигнала в ПЦР-РВ.
Отпимизация условий постановки ОТ-ПЦР-РВ. Для достижения максимальной эффективности работы системы праймеров и зонда была проведена оптимизация условий постановки ОТ-ПЦР-РВ.
ПЦР-РВ достигала максимальной эффективности и чувствительности при концентрации ионов магния 6,5.7 мМ. Реакции с субоптимальным количеством ионов магния (3.6 мМ и 8.10 мМ) демонстрировали меньшую эффективность.
Было установлено оптимальное значение температуры отжига — 57 °С, при котором наблюдали максимальную яркость свечения специфического продукта при минимальном количестве неспецифических фракций амплифицированной ДНК.
В результате оптимизации концентрации праймеров и зонда было установлено, что наилучшие показатели по чувствительности реакции достигаются с количеством праймеров 30 пмоль на реакцию и зонда — 5.6 пмоль на реакцию.
Определение аналитической чувствительности ОТ-ПЦР-РВ. ОТ-ПЦР-РВ тестировали в непрерывном и поэтапном двухстадийном (с отдельной реакцией ОТ) формате как с оптимизированными условиями, так и с неоптимальными условиями, являющимися усредненными для большинства ПЦР-систем (2,5 мМ MgCl2, 55 °С, по 10 пмоль праймеров и 5 пмоль зонда в реакционной смеси). Чувствительность реакции в двух-стадийном формате с неоптимизированными условиями проведения была эквивалентна вирусному титру 100 ЭИД50/мл (табл.2).
2. Значения Ot для каждого варианта ОТ-ПЦР-РВ и разведения матрицы
Варианты ОТ-ПЦР-РВ Разведения РНК
Не разведена 1:10 1:102 1:10s 1:104 1:105
С отдельной реакцией ОТ (не оптимизирована) 26 29,3 33,5 37,2 - -
С отдельной реакцией ОТ (оптимизирована) 24,2 28,1 31,4 35,5 - -
В непрерывном варианте постановки (оптимизирована) 16,4 19,3 22,6 25,5 29,8
1. Праймеры и зонды для амплификации кДНК участка генома ВИЭП
Наименование праймера и зонда Последовательность Положение на участке генома шт. van Reokel (н.)
AEVP-F 5'-CTTGTCAAG(T/G)ATAGG(T/G)TCATAGA-3' 6863...6885
AEVP-R 5'-IIIIIIIIIIGAATGCTATAATC-3' 7019...7041
AEVPr(R) FAM-5'-TCAAGGATAAATGAAAAATCTAAA-3'-BHQ1 7001.6978
Д.Б. Андрейчук, О.С. Осипова, И.А. Чвала, А.
.Н. Колотилов, В.Н. Ирза, Н.А. Перевозчикова
-AEV11/06
■ AEV01/05
- van Roekel
- AEV02/Q6 • AEV10/05
■ AEV06/06
- AEV05/06
- Calnek
- AEV02/05
- AEV 02/04 -AEV03/05
Рис. Дендрограмма генетического отличия изолятов и штаммов ВИЭП по фрагменту гена РНК-полимеразы (построена по алгоритму Neighbour-Joining)
Оптимизация условий постановки двухшаговой ПЦР-РВ привела к повышению эффективности реакции, однако аналитическая чувствительность осталась без изменений. Для дальнейшего улучшения показателей метода испытывали непрерывный формат ОТ-ПЦР-РВ, который позволил сократить время анализа, уменьшить риски перекрестной контаминации из-за снижения количества манипуляций с потенциально содержащими кДНК пробами. Ранее отмечалось, что чувствительность ОТ-ПЦР-РВ в одношаговом варианте постановки, как правило, выше, чем в двухшаговом варианте с отдельной реакцией ОТ [3]. При этом, активность ДНК-полимеразы при более низких значениях температуры в объединенной стадии отжига-элонгации остается на достаточно высоком уровне для эффективного синтеза коротких ДНК-ампликонов [1]. Полученные значения условий двухстадийной ПЦР-РВ были оптимальны и для непрерывного варианта постановки. По уровню Ct и количеству разведений вирусной РНК с положительным результатом реакции, непрерывная ОТ-ПЦР-РВ показывает значительно лучшие результаты (табл. 2): аналитическая чувствительность метода увеличена в 10 раз, а уровень Ct положительных результатов ниже на 8...10 циклов по сравнению с соответствующими результатами ПЦР-РВ с отдельной стадией обратной транскрипции.
Определение диагностической чувствительности оптимизированной ОТ-ПЦР-РВ в непрерывном формате постановки. Для определения диагностической чувствительности метода использовали 9 генетически отличных полевых изолятов ВИЭП, выявленных ранее на территории РФ (рис.).
Отличия этих изолятов и штаммов «Van Roekel» и «Calnek» иллюстрируются дендрограммой, построенной по последовательностям фрагментов гена РНК-по-лимеразы этих изолятов (6360.6920 н.), секвенирован-ных нами ранее. Уровень отличий достигал 18 %. Все пробы указанных изолятов были положительны при исследовании в оптимизированном непрерывном варианте ОТ-ПЦР-РВ.
Выводы
Разработана и оптимизирована ОТ-ПЦР-РВ для выявления генома ВИЭП. Оптимизированный метод обладал высокой аналитической и диагностической чувствительностью, что позволяет использовать его для выявления генома ВИЭП в патологическом материале.
Библиография
1. Андрейчук, Д.Б. Сравнительная оценка качества обратных транскриптаз разных фирм-производителей в одношаговой ОТ-ПЦР-РВ при выявлении генома РНК-содержащих вирусов / Д.Б. Андрейчук, И.А. Чвала // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. — 2014. — Т. 12. — с. 147-153.
2. Диагностика инфекционного энцефаломиелита птиц / В.Н. Ирза, В.А. Лобанов, А.В. Борисов [и др.] // Ветеринария с.-х. животных. — 2002. — № 10. — с. 39-43.
3. Lee, F. Comparison of primer sets and one-step reverse transcription polymerase chain reaction kits for the detection of bluetongue viral RNA / F. Lee, L. Yeou-Liang, T. Hsiang-Jung // J. Virol. Meth. — 2014. — V. 200. — P. 6-9.
4. Qingtian, L. Development of a SYBR Green real-time RT-PCR assay for the detection of avian encephalomyelitis virus / L. Qingtian, Y. Zengqi, H. Huafang et al. // J. Virol. Meth. — 2014. — V. 206. — p. 46-50.
5. Zhiqin, X. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction to Detect Avian Encephalomyelitis Virus / X. Zhiqin // Avian Dis. — 2005. — V.49. — P. 227-230.
SUMMARY
D.B. Andreychuk, O.S. Osipova, I.A. Chvala, A.N. Kolotilov, V.N. Irza, N.A. Perevozchikova
Federal Center for Animal Health (Vladimir).
Development of a New Method Based on Real-Time RT-PCR with Taq-Man Probe for Avian Encephalomyelitis Virus Genome Detection. The RT-PCR method combined with reverce transcription reaction in continuous format was developed for identification of an avian encephalomyelitis virus genome. For detection of specific amplicons in reaction the TaqMan probe was used. The method is successfully tested on 9 genetically different field isolates of the virus revealed in the territory of the Russian Federation and also on known vaccine strains.
Наиболее тревожные факты в условиях ухудшения общей ветеринарной эпидобстановки в стране:
1. Хронические инфекции — бруцеллез — эпидситуация продолжает ухудшаться;
2. Субклинические заболевания — лейкоз КРС — нет положительных изменений в эпидситуации;
3. Природно-очаговые/синантропные заболевания — лептоспироз — ситуация не улучшается;
4. Экзотические инфекции — африканская чума свиней — серьезное ухудшение ситуации — распространение продолжается.
По данным информационно-аналитического центра Россельхознадзора
