CC BY
130
УДК 543.544
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-6-98-101
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В БЕЛКАХ ЖИВОТНОГО И РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Гарнова Н.Ю., Головина Н.В., Доброхотов Д. А., Филиппова А. А.
ФГАОУ ВО Первый московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский университет), г. Москва, Российская Федерация
Аннотация. Бумажная хроматография относится к плоскостному хроматографическому методу, который с успехом можно использовать по своим аналитическим возможностям для идентификации многих веществ, как органической, так и неорганической природы. В бумажной хроматографии в большинстве случаев на практике реализуется распределительный механизм. Хроматографические методы широко применяются в различных отраслях промышленности и научных исследованиях для анализа смесей газообразных, жидких и твердых веществ, для препаративного выделения соединений и изучения их физико-химических свойств. В нашей работе мы решили, что на основе изученного материала по теории и практике хроматографических методов студентами, разработанная нами методика позволит студентам на собственном опыте проверить свои знания вживую. В данной работе представлена методическая разработка качественного определения аминокислот в яичном белке, а также в корнях и листьях петрушки и в плодах белой фасоли методом бумажной восходящей хроматографии. Методика разрабатывалась для использования ее в практикуме по курсу «Химия биополимеров» для студентов лечебного и педиатрического факультетов. Эту методику определения аминокислот методом бумажной хроматографии предполагается использовать при изучении раздела «Свойства природных соединений», в частности, темы «Белки». Одним из ключевых моментов данной работы является изучение методов экстракции белков из растительного сырья и проведение экстракции, а также подбор детектирующих агентов, и получение качественных гидролизатов белков.
Ключевые слова: аминокислота, белки, бумажная хроматография, элюент, адсорбент, нингидрин, треонин, серин, лизин, бутиловый спирт, коэффициент распределения, бе-
DEVELOPMENT OF METHODS FOR THE DETERMINATION OF AMINO ACIDS USING PAPER CHROMATOGRAPHY IN PROTEINS OF ANIMAL AND PLANT ORIGIN
Garnova N. Yu., Golovina N. V., Dobrokhotov D.A., Filippova A.A.
First Moscow state medical university named after I.M. Sechenov, Moscow, Russian Federation
Annotation. Paper chromatography refers to a planar chromatographic method, which can be successfully used in its analytical capabilities to identify many substances, both organic and inorganic nature. In paper chromatography, in most cases, a distribution mechanism is implemented in practice. Chromatographic methods are widely used in various industries and scientific research for the analysis of mixtures of gaseous, liquid and solid substances, for the preparative isolation of compounds and the study of their physico-chemical properties. In our work, we decided that based on the studied material on the theory and practice of chromatographic methods by students, the methodology developed by us will allow students to test their knowledge on their own experience in their own experience. In this paper, a methodical development of the qualitative determination of ami-no acids in the egg protein, as well as in the roots and leaves of parsley and in white bean fruits by paper ascending chromatog-raphy is presented. The technique was developed to use it in a workshop on the course «Chemistry of Biopolymers» for students of medical and pediatric faculties. This method of determining amino acids by paper chromatography is intended to be used in the study of the «Properties of natural compounds» section, in particular, the topic «Proteins». One of the key points of this work is the study of methods for extracting proteins from plant raw materials and carrying out extraction, as well as selecting detecting agents, and obtaining high-quality protein hydroly-sates.
Key words: amino acid, proteins, paper chromatography, eluent, adsorbent, extraction, ninhydrin, serine, butyl alcohol, partition coefficient, 2-naphthol.
та-нафтол.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Головина Н.В., Филиппова А.А., Доброхотов Д.А. Элективный курс «Химия биополимеров», как креативная форма самостоятельной работы студентов лечебного и педиатрического факультетов в медицинских вузах. Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». 2017 Т. 19 № 7 С. 148-151.
[2] Дмитревич И.Н., Пругло Г.Ф., Фёдорова О.В., Комис-саренков А.А. «Физико-химические методы анализа» (Часть III, Хроматографические методы анализа) -Санкт-Петербург, 2014г, 59с.
[3] Ибрагимов А.Н., Бикмуллин А.Г., Сатаева Д.А., Лопухов Л.В. «Хроматографические методы очистки белков» - Казань 2013г, 48с.
[4] Компанцев Д.В., Попов А.В., Привалов И.М., Степанова Э.Ф. Белковые изоляты из растительного сырья. // Современные проблемы науки и образования. 2016. №1.
[5] Шлейкин А.Г., Скворцова Н.Н., Бландов А.Н. Биохимия. Лабораторный практикум. Часть 2. Белки. Ферменты. Витамины. Учеб. пособие. - СПб.: Университет ИТМО, 2015. 106с.
[6] Головина Н.В., Доброхотов Д.А., Попков В.А. «Руководство к практическим и лабораторным занятиям по курсу «Химия биополимеров» для студентов медицинских вузов». - Москва, Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, 2015, 104с.
[7] Головина Н.В., Филиппова А.А., Макарьянц Л.Д., Пан-кова В.Д. Определение аминокислотного состава белков различного происхождения методом бумажной хроматографии. Сб. статей IV Международной научно-практической конференции. Пенза, 2018 С. 21
[8] Головина Н.В., Филиппова А.А., Доброхотов Д.А. Создание и изучение качественных характеристик и показателей растительного сбора для профилактики и лечения заболеваний пародонта. Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». 2016 Т. 18 № 1 С. 336-340
Аминокислоты (АК) — это класс органических соединений, молекулы которых содержат как аминогруппы (-ЫН2), так и карбоксильные группы (-СООН). Аминокислоты, которые не синтезируются в организме, а поступают в организм с пищей, называют незаменимыми (валин, лейцин, изолейцин, метио-нин и др.).
Заменимые аминокислоты, которые синтезируются в организме из других соединений (аланин, глицин, глутаминовая кислота, серин, пролин и др.).
Физико-химические свойства АК обусловлены наличием различных функциональных групп в их молекулах. Знание этих свойств имеет важное значение для понимания свойств белков. Особенно это касается кислотно- основных свойств аминокислот.
Белки - высокомолекулярные соединения, у которых многочисленные остатки аминокислот соединены
REFERENCES
[1] Golovina N.V., Filippova A.A., Dobrokhotov D.A. Elective course «Chemistry biopolymers», as a creative form of independent work of students of medical and pediatric faculties in medical universities. Journal of Scientific Articles «Health and education in the 21st century.» 2017 T. 19 No. 7 pp. 148-151.
[2] Dmitrevich I.N., Prugloo G.F., Fedorova O.V., Komis-sarenkov A.A. «The physico-chemical methods of analy-sis» (Part III, Chromatographic methods of analysis) - St. Petersburg, 2014, 59p.
[3] Ibragimov A.N., Bikmullin A.G., Sataeva D.A., Lopukhov L.V. «Chromatographic methods of protein purification» -Kazan 2013, 48p.
[4] Kompantsev D.V., Popov A.V., Privalov I.M., Stepanova E.F. Protein isolates from plant raw material: review of the modern state and analysis of prospects of developmen of technology of obtaining protein isolates from plant raw material // Current problems of science and education.
[5] Shleikin A.G., Skvortsova N.N., Blandov A.N. Biochemistry. Laboratory practical work. Part 2. Proteins. Enzymes. Vitamins. Textbook. allowance. - SPb.: University ITMO, 2015.106.
[6] Golovina N.V., Dobrokhotov D.A., Popkov V.A. «A guide to practical and laboratory studies on the course» Chemistry of biopolymers «for students of medical schools.» -Moscow, First Moscow State Medical University. THEM. Sechenova, 2015, 104p.
[7] Golovina N.V., Filippova A.A., Makaryants L.D., Pankova V.D. Determination of the amino acid composition of proteins of different origin by paper chromatography. Sat. articles of the IV International Scientific and Practical Conference. Penza, 2018 p. 21
[8] Golovina N.V., Filippova A.A., Dobrokhotov D.A. Creation and study of qualitative characteristics and indicators of vegetative collection for the prevention and treatment of periodontal diseases. Journal of scientific articles «Health and education in the XXI century.» 2016 T. 18 No. 1 P. 336-340
пептидными связями. Белки можно рассматривать как полимеры аминокислот, полученные в результате поликонденсации. Простые белки построены только из аминокислот (альбумины, гистоны и др.), а в состав сложных белков входит простетическая (небелковая) группа (гемоглобин, фосфопротеины, металлопротеи-ны). В растворе белка, при определенном значении рН, число ионизированных карбоксильных групп равно числу протонированных аминогрупп, и суммарный заряд макромолекулы равен нулю [1]. Хроматография — это физико-химический метод разделения смесей на компоненты. Эти компоненты распределяются между двумя фазами - неподвижной (сорбент), и подвижной (элюент), которая представляет собой поток, проникающий через неподвижный слой [2]. Первая статья «О возникновении хроматографии, как научный метод», была описана русским биологом
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 99 ~
М.С. Цветом в 1903 году. В статье излагается первое применение адсорбции (увеличение концентрации растворенного вещества) для анализа разделения пигмента зеленых растений [3].
В нашей работе мы используем метод бумажной хроматографии. Цель работы заключалась в том, чтобы методом восходящей бумажной хроматографии определить аминокислоты в животном и растительном сырье. Определение аминокислотного состава белков помогает правильно оценить их содержание, качество и роль в жизнедеятельности. Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостей, одной из которых является вода, другой — водо-насыщенный органический растворитель.
Сущность методики определения аминокислот методом бумажной хроматографии заключается в том, что каплю гидролизата белка наносят на полоску хроматографической бумаги, конец которой опускают в подходящий органический растворитель. Растворитель поднимается по хроматографической бумаге и увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты [9]. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от химического строения аминокислот и их способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителях. В качестве подвижного растворителя можно использовать, например, водо-насыщенный раствор фенола, бутиловый спирт, амиловый спирт и др. Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают хроматографиче-скую бумагу (внешне бумага остается сухой). Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за его фронтом. Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить при помощи цветной реакции с нингидрином [10]. Реакцию проводят путем опрыскивания из пульверизатора высушенной полоски бумаги 0,5% спиртовым раствором нингидрина и последующим нагреванием в сушильном шкафу. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый или оранжевый цвета (в зависимости от химической структуры аминокислоты) [5].
Основной физико-химической характеристикой хроматографического процесса является коэффициент распределения И. Фактором Rf называют отношение расстояния (в мм) от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна к расстоянию (в мм) от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (в): И=а/в [6].
Нашей задачей было определить аминокислотный состав белков различного происхождения методом бумажной восходящей хроматографии. Для исследования были взяты: яичный белок (животное сырье) и
листья, корень петрушки и плоды белой фасоли (растительное сырье).
Нами проводилось качественное определение аминокислот. Использовались следующие реактивы и оборудование: хроматографическая бумага, вода дистиллированная, бутанол, конц. уксусная кислота и конц. соляная кислота, этанол, спиртовые растворы нингидрина и 2-нафтола, хроматографические камеры, фарфоровые ступки и пестики, фарфоровые чашки, пульверизаторы.
Наносились растворы яичного белка (w=50%, w=100%) и сок листьев петрушки и водно-спиртовые экстракты корня петрушки и плодов белой фасоли, а также использовались экстрагенты: смесь фенола, уксусной кислоты и воды. Гидролизаты экстрактов (кислотный гидролиз с концентрированными соляной и уксусной кислотами) с помощью тонкого капилляра наносили на узкие полоски хроматографической бумаги на расстоянии 1,0-1,5 см от края [7]. Подготовленные полоски бумаги помещали в хроматографиче-ские камеры с растворителями (бутиловый спирт, вода), глубина погружения полоски бумаги - 2-3 мм. После поднятия растворителей на высоту 6-7 см полоски вынимали из хроматографических камер и высушивали на воздухе. Высушенные хроматограммы погружали на несколько секунд в фарфоровую чашку со спиртовым раствором нингидрина (0,5 моль/л) и 2-нафтола (0,1 моль/л). Часть хроматограмм опрыскивали из пульверизаторов. Затем рассчитывали значение коэффициента распределения, отмечалось число окрашенных зон, и выясняли, какая из них соответствует какой аминокислоте [8].
- в системе: яичный белок (100%) + бутанол + нин-гидрин были обнаружены лизин, серин, треонин, ци-стеин;
- в системе: яичный белок (100%) + бутанол + 2-нафтол были обнаружены серин, треонин, цистеин, тирозин;
- в системе: яичный белок (50%) + бутанол + нин-гидрин был обнаружен серин, цистеин;
- в системе: яичный белок (50%) + бутанол + 2-нафтол были обнаружены серин, треонин;
- в системе: петрушка (сок листьев) + уксусная кислота + дистиллированная вода + 2-нафтол был обнаружен гистидин;
- в системе: петрушка (сок листьев) + HCl (к) + дистиллированная вода + нингидрин обнаружены следы треонина;
- в системе: петрушка (экстракт корня) + HCl (к) + дистиллированная вода + нингидрин обнаружены треонин, лизин, гистидин;
- в системе: петрушка (экстракт корня) + HCl (к) + дистиллированная вода + 2-нафтол обнаружен треонин;
- в системе: петрушка (экстракт корня) + уксусная кислота + дистиллированная вода + 2-нафтол-аминокислоты не обнаружены;
- в системе: фасоль (экстракт плодов) + уксусная кислота + дистиллированная вода + 2-нафтол обнаружены глицин, следы тирозина и глутаминовой кислоты;
- в системе: фасоль (экстракт плодов) + HCl (к) + дистиллированная вода + нингидрин обнаружены аланин, глицин, тирозин;
- в системе: фасоль (экстракт плодов) + HCl (к) + дистиллированная вода + 2-нафтол обнаружены глицин, следы аланина и глутаминовой кислоты.
Относительная ошибка измерения в среднем по всем опытам составила 3,482%.
По результатам эксперимента можно сделать следующие выводы:
1. Было подтверждено, что методом бумажной хроматографии можно обнаружить аминокислоты в продуктах: животного и растительного происхождения.
2. В яичном белке были обнаружены следующие аминокислоты с помощью раствора нингидрина: се-рин, треонин, лизин, цистеин.
3. 2-нафтол в качестве детектирующего агента можно использовать, но для того, чтобы результаты получились достоверными надо подобрать для него концентрации.
4. В растительном сырье (листьях, корнях петрушки, а также плодах белой фасоли) при использовании данной методики результаты получаются не достоверными, т.к. появляются на хроматограммах не очень четкие контуры пятен, наблюдаются слегка окрашенные зоны. Видимо, это связано с процессом экстрагирования белков из сырья и получением гид-ролизатов.
5. В дальнейшем, наша задача: унифицировать методики по извлечению аминокислот из растительного сырья, с последующим их определением с помощью бумажной восходящей хроматографии.
6. В студенческом лабораторном практикуме не так много работ по хроматографии и методам экстракции, а те, которые представлены или слишком примитивны, или наоборот сложны. Данная методика представляет собой, на наш взгляд, наиболее оптимальный вариант. Ее можно использовать в качестве лабораторной работы студентов для освоения метода бумажной хроматографии и методов экстракции веществ.
