CC BY
65
▲1
5щ
УДК: 615.074:615.322:582.893.4 Код специальности ВАК: 14.04.02
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ ВОЛОДУШКИ КОЗЕЛЕЦЕЛИСТНОЙ
С.А. Петухова, В.М. Мирович,
ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет»
Петухова Светлана Андреевна - e-mail: lanapetukhova@gmail.com
Дата поступления 13.03.2017
Разработана методика спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов в траве володушки козелецелистной. Максимум поглощения спиртового извлечения из травы володушки козелецелистной при добавлении 3% раствора алюминия хлорида находится при 412 нм и совпадает со стандартным образцом рутина. Расчет процентного содержания суммы флавоноидов проводили в пересчете на рутин. При 9 независимых определениях ошибка методики не превышала ±2,70%. Опыты с добавками СО рутина показали правильность методики и отсутствие систематической ошибки. Содержание суммы флавоноидов в образцах сырья составляет от 3,88 до 5,52%.
Ключевые слова: володушка козелецелистная, флавоноиды, спектрофотометрия,
количественное определение.
The technique of spectrophotometric quantitative determination of the sum of flavonoids in the grass of the Bupleurum scorzonerifolium is developed. The maximum absorption of alcohol extract from the grass of the Bupleurum scorzonerifolium with the addition of a 3% solution of aluminum chloride is at 412 nm and coincides with the standard routine sample. Calculation of the percentage content of flavonoids was carried out in terms of routine. With 9 independent determinations, the method error did not exceed ±2,70%. Experiments with additives of the standard routine showed the correctness of the technique and the absence of a systematic error. The content of the amount of flavonoids in the samples of raw materials is from 3,88 to 5,52%.
Key words: Bupleurum scorzonerifolium, flavonoids, spectrophotometry, quantification.
В медицинской практике используется трава володушки многожильчатой - НегЬа Вир1еип тиШпе^. Качество сырья определяется нормативным документом ВФС 42-580-76. Настой травы усиливает желчеотделение, очищенная сумма флавоноидов обладает Р-витаминной активностью (препарат «Буплерин»). Для стандартизации сырья предложена методика количественного определения суммы флавоноидов хромато-спектрофотометрическим методом. Содержание флаво-нолов в элюате вычисляют по калибровочному графику, построенному по рутину. Методика длительна в исполнении. Хроматографическое разделение флавоноидов проводится в течение 24 часов.
На территории Прибайкалья, в Бурятии, по каменистым склонам речных долин, на остепненных участках встречается володушка козелецелистная. Установлено, что водные извлечения из травы володушки козелеце-листной повышают секрецию желудочного сока и секрецию поджелудочной железы, улучшают состав желчи [1].
Трава володушки козелецелистной содержит флавоноиды, полисахариды, сапонины, эфирное масло, фенолкар-боновые кислоты [2, 3, 4]. В составе суммы флавоноидов преобладают гиперозид, рутин, кверцетин, кемпферол [5].
Исходя из данных по химическому составу травы володушки козелецелистной, а также сведениям о фармакологической активности, предлагается проводить стандартизацию сырья володушки козелецелистной по содержанию суммы флавоноидов.
Цель работы: разработать методику количественного определения суммы флавоноидов в траве володушки козелецелистной.
Материал и методы
Объектом исследования служили образцы сырья, собранные в период цветения в южных районах Иркутской области в 2014-2016 гг.
Спектры записывали на регистрирующем спектрофотометре «СФ-2000» (Россия), измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили на спектрофотометре <^ЕК1 SS 1207» (Финляндия) и «СФ-46» в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. В качестве стандарта использовали СО рутина (ФС 42-2508-87).
Статистическую обработку экспериментальных данных (Р=95%) проводили в соответствии с требованиями ГФ XIII «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» (ОФС. 1.1.0013.15) [6].
При изучении спектра спиртового извлечения (40% спирт этиловый) травы володушки козелецелистной установлено наличие двух максимумов при 266 и 360 нм. При добавлении 3% спиртового раствора алюминия хлорида наблюдается появление батохромного сдвига в длинноволновой области до 412 нм. Исследование дифференциальных спектров спиртового извлечения из травы володушки козелецелистной и СО рутина при добавлении 3% спиртового раствора алюминия хлорида показало их совпадение при 412 нм, что послужило основанием использовать в качестве стандартного образца рутин.
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
На выход флавоноидов из сырья оказывают влияние природа экстрагента, размер частиц сырья, соотношение сырья и экстрагента, время и кратность экстракции.
Для экстракции флавоноидов чаще всего используется спирт этиловый. Изучение влияния концентрации спирта этилового на выход флавоноидов из травы володушки козелецелистной проводили на образце сырья размером частиц 1 мм, с соотношением сырье-экстрагент 1:100, при нагревании на водяной бане в течение 60 минут. Наибольшее количество флавоноидов извлекается 40-70% спиртом этиловым (таблица 1). При увеличении концентрации спирта этилового более 70% выход флавоноидов снижается, т. к. большая часть суммы флавоноидов володушки козелецелистной представлена гликози-дами, растворимость которых понижается в этиловом спирте высокой концетрациии, предлагается для экстракции флавоноидов использовать 40% этиловый спирт.
Размер частиц сырья 1 мм обеспечивает максимальный выход флавоноидов из травы володушки козелецелистной. Увеличение размера частиц от 2 до 5 мм значительно снижает выход флавоноидов (таблица 2).
На выход флавоноидов оказывает влияние время экстракции. Максимальное количество флавоноидов извлекается при экстракции продолжительностью 60 мин, дальнейшее увеличение времени до 120 мин не приводит к увеличению выхода флавоноидов (таблица 3).
Соотношение сырья и экстрагента изучали на образцах сырья с размером частиц в 1 мм, экстрагент 40% спирт
ТАБЛИЦА 1.
Влияние концентрации спирта этилового на выход флавоноидов из травы володушки козелецелистной
этиловый. Максимальный выход флавоноидов наблюдается при соотношении сырье-экстрагент 1:100 (таблица 4). Было установлено, что использование данного соотношения является оптимальным и соответствует исчерпывающей экстракции. Исчерпывающую экстракцию проводили трехкратно (при соотношении сырье-экстра-гент 1:30). Продолжительность первой экстракции была 60 мин, последующих - по 30 мин. Шрот после исчерпывающей экстракции не давал положительные реакции на флавоноиды (проба Синода, реакция с 3% спиртовым раствором алюминия хлорида).
Также определено необходимое количество комплек-сообразователя 3% спиртового раствора алюминия
ТАБЛИЦА 2.
Влияние размера частиц сырья на выход флавоноидов из травы володушки козелецелистной
Размер частиц сырья, мм Содержание суммы флавоноидов, %
0,5 4,10±0,11
1,0 4,42±0,12
2,0 4,14±0,10
3,0 3,50±0,08
5,0 2,86±0,06
ТАБЛИЦА 3.
Влияние времени экстракции на выход флавоноидов из травы володушки козелецелистной
Время экстракции, мин (соотношение сырья и экстрагента 1:100) Содержание суммы флавоноидов, %
30 3,89±0,11
60 4,42±0,12
90 4,41±0,13
120 4,41±0,10
ТАБЛИЦА 4.
Влияние соотношения сырья и экстрагента на выход флавоноидов из травы володушки козелецелистной
Соотношение сырья и экстрагента, время экстракции 60 мин Содержание суммы флавоноидов, %
1:25 3,56±0,10
1:30 4,10±0,12
1:50 4,35±0,11
1:100 4,42±0,12
Исчерпывающая экстракция 1:30 (трехкратно) 60 мин, 30 мин, 30 мин 4,40±0,10
ТАБЛИЦА 5.
Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы флавоноидов в траве володушки козелецелистной
Концентрация спирта этилового, %
РИС.
30
40
50
60
70
80
90
96
Содержание суммы флавоноидов, %
4,32±0,12
4,42±0,11
4,41±0,13
4,41±0,10
4,42±0,09
4,31±0,11
3,88±0,09
2,56±0,06
Дифференциальные спектры в присутствии 3% спиртового раствора алюминия хлорида: 1 - спиртовое извлечение из травы володушки козелецелистной, 2 - спиртовой раствор СО рутина.
f X S S х Р,% Д х Е
8 4,41 0,16979 0,05660 95 2,31 0,13 ±2,96
ТАБЛИЦА 6.
Количественное содержание суммы флавоноидов в траве володушки козелецелистной
Показатель Номер серии
1 2 3 4 5
Суммы флавоноидов в пересчете на рутин, % 4,41+0,13 5,30+0,14 5,42+0,19 3,54+0,12 2,89+0,10
▲1
5щ
хлорида - 1 мл, комплекс становится стабильным через 40 минут и сохраняется в течение 1,5 часов.
На основании полученных данных адаптирована методика количественного определения суммы флавоноидов для анализа травы володушки козелецелистной.
Методика количественного определения. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Затем 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 40% спирта этилового. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин с момента закипания содержимого колбы. После охлаждения содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр (раствор А), отбрасывая первые 15 мл фильтрата.
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, добавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят раствор до метки 96% спиртом. Измерение оптической плотности проводят через 40 мин на спектрофотометре при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А, 1 капли 10% раствора уксусной кислоты и доведенный до 25 мл 96% спиртом этиловым.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
х = Дт0 100-25 1 100 Ю0 = Рт0-100-100 = Д,-т-1-25-100-(100-Ж) = D0•m■(100-^Г),
где D - оптическая плотность испытуемого раствора; Do - оптическая плотность раствора СО рутина; т - масса сырья, г; т0 - масса СО рутина, г; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Примечание. Приготовление раствора стандартного образца (СО) рутина: 0,05 г (точная навеска) СО рутина, высушенного до постоянной массы при температуре 130...135°С, растворяют в 85 мл 95% спирта этилового в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают и доводят объем раствора тем же спиртом до метки.
Приготовление 3% спиртового раствора алюминия хлорида: 3 г алюминия хлорида (ГОСТ 3759-75) растворяют в 50 мл 96% этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.
На основании проведённых девяти независимых определений установлено, что ошибка методики составляет ±2,70% (таблица 2).
Разработанной методикой проведено количественное определение суммы флавоноидов в пяти сериях полупромышленных партий сырья володушки козелецелист-ной. Рекомендуемая норма содержания суммы флавоно-идов в траве володушки козелецелистной не менее 2,5%.
В опытах с добавками СО рутина относительная ошибка находилась в пределах ошибки среднего результата, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки и правильности методики.
Таким образом, разработана методика спектрофотоме-трического количественного определения суммы флаво-ноидов в траве володушки козелецелистной и установлена норма содержания суммы флавоноидов не менее 2,5%.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вогралик В.Е., Кристер Э.Э., Виленчик С.В. Володушка как новое желчегонное растение. Новые лекарственные растения Сибири, их лечебные препараты и применение. 1946. Вып.2. 002-104.
Vogralik V.E., Krister Je.Je., Vilenchik S.V. Volodushka kak novoe zhelchegonnoe rastenie. Novye lekarstvennye rastenija Sibiri, ih lechebnye preparaty iprimenenie. 1946. Vyp.2. S.102-104.
2. Бирюкова Н.М., Островская А.М., Соколов В.Г., Кухарева Л.В., Игнатенко
B.А., Гиль Т.В. Исследование содержания и состава флавоноидов и фенолкар-боновых кислот растений рода Bupleurum L., культивированных в Беларуси. Вестник фармации. 2011. № 4 (54). С. 23-30.
Birjukova N.M., Ostrovskaja A.M., Sokolov V.G., Kuhareva L.V., Ignatenko V.A., Gil' T.VIssledovaniesoderzhanija isostava flavonoidovi fenolkarbonovyh kislot rastenij roda Bupleurum L., kul'tivirovannyh v Belarusi. Vestnik farmacii. 2011 № 4 (54). P. 23-30.
3. Ashour M.L., Wink M. Genus Bupleurum: a review of its phytochemistry, pharmacology and modes of action. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2010. № 63 (3). P. 305-321.
4. Altantsetseg Sh., Shatar S., Javzmaa N.. Comparative study of essential oil constituents of Bupleurum species from Mongolia. Mongolian Journal of Chemistry. 2012. № 13 (39). P 28-30.
5. Петухова С.А., Мирович В.М. Состав биологически активных веществ володушки козелецелистной (Bupleurum scorzonerifolium Willd.) травы, произрастающей в Восточной Сибири. Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. 2016. Вып. 71.
C. 57-59.
Petuhova S.A., Mirovich V.M. Sostav biologicheski aktivnyh veshhestv volodushki kozelecelistnoj (Bupleurum scorzonerifolium Willd.) travy, proizrastajushhej v Vostochnoj Sibiri. Razrabotka, issledovanie i marketing novoj farmacevticheskoj produkcii: sbornik nauchnyh trudov. 2016. Vyp. 71. S. 57-59.
6. Государственная фармакопея Российской Федерации: в 3 тт. / под ред. Г.В. Авраменко, О.Г. Потанина, Е.В. Буданова. XIII изд. М. 2015. - [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://femb.ru/feml (дата обращения: 16.01.2017).
Gosudarstvennaja farmakopeja Rossijskoj Federacii: v 3 tt. / pod red. G.V. Avramenko, O.G. Potanina, E.V. Budanova. XIII izd. M. 2015. - [Jelektronnyj resurs] - Rezhim dostupa: http://femb.ru/feml. _
ш
