CC BY
26PHARMACEUTICAL SCIENCES | ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ НАУКИ
РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА АКТИВНЫХ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В СОСТАВЕ КРЕМА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГИНЕКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Дроздова А.А.
Национальная медицинская академия последипломного образования
имени П. Л. Шупика, Украина, Киев
DEVELOPMENT OF APPROACHES FOR QUALITY CONTROL OF ACTIVE AND PROCESSING AIDS IN COMPOSITION OF THE CREAM FOR PROPHYLAXIS AND TREATMENT OF GYNECOLOGICAL DISEASES Drozdova A.O., Shupyk National Medical Academy of Postgraduate Education
АННОТАЦИЯ
Розработаны методики качественного и количественного определения активных (екстракт тысячелистника, екстракт календулы, клотримазол) и вспомогательных веществ в составе крема для профилактики и лечения гинекологических заболеваний.
При проведении исследований нами использовался метод жидкостной хроматографии (для определения клотримазола), метод абсорбционной хроматографии (для определения суммы флаваноидов по рутину), метод газовой хроматографии (для определения пропиленгликоля).
Установлены специфические нормы определяемых веществ: клотримазол (9,5 - 10,5 мг/г), сумма флаваноидов в перерасчете на рутин должна быть не менее 1,2 мкг на 1 г препарата, пропиленгликоль - 135,0 мг/г до 165,0 мг/г.
Значения рН раствора крема находится в рамках от 4,0 до 6,0.
ABSTRACT
Methods of qualitative and quantitation measurement of active (milfoil extract, marigold extract, clotrimazole) and processing aids in composition of the cream for prophylaxis and treatment of gynecological diseaseshave been developed.
The following methods were used: liquid chromatography (for identification of clotrimazole), absorption chromatography (for indication of quantity of flavonoids using rutin), gas chromatography (for identification of propylene-glycol).
Peculiar rates of solutes have been determined: clotrimazole (9,5 - 10,5 mg/g), total amount of flavonoids recalculated to rutin has to be not less 1,2 mcg per 1 gr of treatment, propylene-glycol - 135,0 mg/g - 165,0 mg/g.
ValuesofpHinsolutionofcreamarefollowing 4,0 - 6,0.
Ключевые слова: Клотримазол, сумма флаваноидов, пропиленгликоль, крем, гинекология.
Keywords: Clotrimazole, amount of flavonoids, propylene-glycol, cream, gynecology.
Постановка проблемы
Фармацевтична розробка нових лекарственных средств (ЛС) для гинекологии предусматривает выбор лекарственной формы (ЛФ), которая имеет существенное значение, т. к. препарат воздействует на процессы в организме не только с помощью активних фармацевтических ингридиентов (АФИ), но и помощью совокупности своих свойств [1, 2, 5]. Неадекватно выбранная ЛФ может стать причиной не только сниженной эффективности АФИ, но и полного ее отсутствия или негативного влияния на психологическое состояние больного. Все это побуждает врача и провiзора розширять ассортимент ЛС [4, 8].
Лекарственные средства для гинекологии имеют свою специфику, а именно: должны обладать хорошо проникающей способностью, иметь адгезионную способность к вагинальным тканям, обеспечивать точность дозирования и стабильность концентрации препарата, не проявлять побочного действия, не раздражать слизистою оболочку влагалища, не оказывать влияния на влагалищную микрофлору, не проникать в кровь, сохранять физико-химические параме-три на протяжении всего срока хранения, быть удобними в использовании, транспортировке и при хранении [3].
Применение мягких лекарственных форм (МЛФ) в гинекологической практике имеет определенные особенности, связанные со сложным рельефом слизистой оболочки влагалища и ее постоянной увлажненностью. Значительная часть гинекологических ЛС выпускаются преимущественно в форме суппозиториев, которую до недавнего времени считали универсальной формой и назначали практически всем женщинам. Но применение суппозиториев вызывает определенный дискомфорт у женщин, поэтому перспективной лекарственной формой является крем.
Широкое использование их в медицинской практике обусловлено возможностью комбинации несмешиваемых жидкостей, регулировкой биологической доступности субстанций, устранением раздражающего действия на слизистую оболочку отдельных веществ.
Крем проявляет терапевтическое действие сразу после введения, со-храняет эффект в течение длительного периода времени, обладает выраженными любрикантнимы свойствами, поэтому наиболее часто рекомендуется и при недостаточной секреции влагалища.
Учитывая все положительные характеристики кремов для вагинального применения можно сделать вывод, что со-
здание новых ЛС в форме крема является актуальным, поскольку увеличит обеспечение населения доступными гинекологическими средствами и повысит его информирование для осуществления выбора метода профилактики и лечения воспалительных заболеваний, это является необходимым шагом для сохранения здоровья женщин.
Поэтому целесообразным является разработка оптимального состава и технологии гинекологического ЛС с противовоспалительной, антимикробной и противогрибковой активностью.
Цель статьи
Целью работы стала разработка методик качественного и количественного определения суммы фенольных соединений (экстракт тысячелистника, экстракт календулы), кло-тримазола и пропиленгликоля (ПГ) в составе крема для профилактики и лечения гинекологических заболеваний.
Изложение основного материала
Для идентификации фенольных соединений 3 мл испытуемого раствора (а), приготовленного для испытания «Количественное определение [6, 7]. Сумма флавоноидов», помещают в пробирку, добавляют 0,1 мл раствора железа (III) хлорида Р1 и перемешивают; появляется зеленовато-коричневое окрашивание.
Количественное определение. Сумма флавоноидов.
Испытуемый раствор (а). Около 2,0 г (точная навеска) препарата помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл спирта (70 % об/об) Р при нагревании на водяной бане при температуре (50-60) °С, охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят при помощи 15 мл спирта (70 % об/об) Р в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора тем самым растворителем до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 5 мл фильтрата.
Испытуемый раствор (Ь). 5,0 мл испытуемого раствора (а) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 0,1 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, 5,0 мл 3 % раствора алюминия хлорида, доводят объем раствора спиртом (70 % об/об) Р до метки и перемешивают.
Компенсационный раствор (Ь). 5 мл испытуемого раствора (а) поме-щают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 0,1 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, доводят объем раствора спиртом (70 % об/об) Р до метки и перемешивают.
Раствор сравнения (с). 25,0 мг стандартного образца (СО) рутина, предварительно высушенного при температуре (130 - 135) °С до постоянной массы, помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 40 мл 96 % спирта Р, доводят объем раствора тем самым растворителем до метки и перемешивают.
Раствор сравнения 1,0 мл раствора сравнения (с) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 0,1 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, 5,0 мл 3 % раствора алюминия хлорида, доводят объем раствора спиртом (70 % об/об) Р до метки и перемешивают.
Компенсационный раствор 1 мл испытуемого раствора (а) поме-щают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 0,1 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, доводят объем раствора спиртом (70 % об/об) Р до метки и перемешивают.
Через 30 мин измеряют оптическую плотность испытуемого раствора (Ь) и раствора сравнения на спектрофото-
метре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве компенсационного раствора компенсационный раствор (Ь) и компенсационный раствор соответственно [6, 7].
Содержание суммы флавоноидов (Х1) в 1 г препарата, в перерасчете на рутин, в мг, вычисляют по формуле 1:
Ai * mo * 50 * 25 *
Ai * m0 *
1 * Р
mi
* 100
500
(1)
где: Aj - оптическая плотность исследуемого раствора (b);
A0 - оптическая плотность раствора сравнения (d);
mj - масса навески препарата, г;
m0 - масса навески СЗ рутина, мг;
Р - содержание рутина в СЗ рутина, %.
Идентификацию клотримазола проводили методом жидкостной хроматографии при выполнении методики «Количественное определение клотримазола».
Методика количественного определения клотримазола. Количественное определение проводили проводят методом жидкостной хроматографии.
Исследуемый раствор. Около 2,00 г (точная навеска) препарата помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 40 мл метанола Р, закрывают пробкой и выдерживают при перемешивании на магнитной мешалке на протяжении 15 мин. Количественно переносят при помощи 20 мл метанола Р в мерную колбу на 100 мл, добавляют 25 мл фосфатного буферного раствора рН 6,8, доводят объем раствора метанолом Р до метки и перемешивают.
Часть полученного раствора центрифугируют при температуре 5 °С с частотой вращения 8000 об/мин на протяжении 15 мин.
Раствор сравнения. 20,0 мг стандартного образца клотримазола помещают в мерную колбу на 100 мл, растворяют в 60 мл метанола Р, добавляют 25 мл фосфатного буферного раствора рН 6,8, доводят объем раствора метанолом Р до метки и перемешивают.
Хроматографирование проводят на жидкостному хроматографе с УФ-детектором, получая необходимое количество хроматограмм для каждого из растворов. Условия хромато-графирования:
- колонка (колонка «Nova Pack» производства фирмы «Waters», США) из нержавеющей стали, размером (3,9 х 300) мм, заполненная силикагелем октадецилсилильным для хроматографии Р с размером частичек 4 мкм;
- подвижная фаза: метанол Р - фосфатный буферный раствор рН 6,8 (3:1), дегазированный любым удобным способом;
- скорость подвижной фазы 0,7 мл/хв;
- детектирование при длине волны 215 нм;
- температура колонки 25 °С.
Хроматографируют по 20 мкл исследуемпого раствора и раствора сравнения. Приготовление фосфатного буферного раствора (рН 6,8): 4,35 г дикалия гидрофосфата Р помещают в склянку вместимостью 1000 мл, растворяют в 900 мл воды Р, доводят рН раствора до 6,8 ± 0,05 (£Ф /ДФУ, 2.2.3) кислотой фосфорной Р. Полученный раствор количественно переносят при помощи 50 мл воды Р в мерную колбу вме-
Р
A0 * m1 * 50 *25 * 5
A0 *
*
стимостью на 1000 мл, доводят объем раствора тем самым растворителем до метки i перемешивают. Растворы готовят непостредственно перед использованием.
Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются такие условия:
- эффективность хроматографичнской колонки, расчи-танная по пику клотримазола из хроматограмм раствора сравнения, должна быть не меньше 1500 теоретических тарелок;
- относительное стандартное отклонение, расчитанная по тку клотримазола из хроматограмм раствора сравнения, не должна превышать 2,0 %.
Содержание клотримазола (Х2) в 1 г препарата, в мг, расчитывают по формуле 2:
S1 * m0 * Р *100
Si * mo * р
* 100
* 100
(2)
где Sj - среднее значение площади пика клотримазолу, расчитанное из хроматограмм исследуемого раствора;
S0 - среднее значение площади пика клотримазолу, расчи-танное из хроматограмм раствора сравнения;
mj - масса навески препарата, г;
m0 - масса навески стандартного образца клотримазола,
мг;
Р - содержание клотримазола в стандартном образце кло-тримазола, %
Пропиленгликоль. Определение проводят методом газовой хроматографии (ЕФ/ГФУ, 2.2.28), используя этиленгли-коль Р в качестве внутреннего стандарта.
Раствор внутреннего стандарта. 7,5 г етиленгликоля Р помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 40 мл воды Р, доводят объем раствора тем самым растворителем до метки и перемешивают.
Испытуемый раствор. Около 0,50 г (точная навеска) препарата помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, добавляют 60 мл воды Р, перемешивают на магнитной мешалке до получения однородной смеси, количественно переносят с помощью 30 мл воды Р в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 1,0 мл раствора внутреннего стандарта, доводят объем раствора водой Р до метки и перемешивают.
Полученный раствор центрифугируют при температуре (5-7) °С с ча-стотой вращения 8000 об/мин в течение 15 мин; если центрифуга без охла-ждения, полученный раствор предварительно охлаждают в холодильном шкафу, после чего центрифугируют с частотой вращения 8000 об/мин в течение 15 мин.
Раствор сравнения. 7,50 г (точная навеска) пропиленгли-коля (CAS № 57-55-6, содержание С3Н8О2 не менее 99,0%) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл воды Р, доводят объем раствора тем самым растворителем до метки и перемешивают.
1,0 мл полученного раствора и 1,0 мл раствора внутреннего стандарта помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой Р до метки и перемешивают.
По 1 мкл испытуемого раствора и раствора сравнения попеременно хроматографируют на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором, получая необходимое количество хроматограмм для каждого раствора, при таких условиях:
- колонка кварцевая размером 25 м х 0,53 мм, покрыта 1 мкм слоем неподвижной фазы состава: высокополярного полиэтиленгликоля или аналогичная, для которой выполняются требования теста «Проверка пригодности хроматогра-фической системы»*;
- температура колонки: 90 °С - 1 мин, повышение до 220 °С со скоростью 10 град/мин, выдержки при 220 °С на протяжении 15 мин;
- температура испарителя и детектора: 220 °С i 250 °С, в соответствии;
- газ-носитель: гелий для хроматографии Р или азот для хроматографии Р;
- скорость газа-носителя 30 мл/мин;
- скорость газа-носителя через колонку 10 мл/мин.
При хроматографирования при указанных условиях по-
следователь-ность выхода пиков следующая: пропиленгли-коль, этиленгликоль.
Хроматографическая система считается пригодной, если:
- эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пикам пропиленгликоля с хроматограмм раствора сравнения, должно быть не менее 10000 теоретических тарелок;
- коэффициент разделения пиков пропиленгликоля и эти-ленгликоля на хроматограммах раствора сравнения должно быть не менее 2,0;
- относительное стандартное отклонение, рассчитанное для отношений площадей пика пропиленгликоля к площадям пика этиленгликоля с хроматограмм раствора сравнения, должно быть не более 2,0 %.
Содержание пропиленгликоля (Х3) в 1 г препарата, в ми-лиграмах, вычисляют по формуле (3):
6 В1 * m0 * 100 В1 * m0
Во * т1 * 100 Во * т1
* 100 * 100 (3)
де: В1 - среднее значение отношений площадей пика про-пиленгликоля к площадям пика этиленгликоля, рассчитанное с хроматограмм испытуемого раствора;
В0 - среднее значение отношений площадей пика пропи-ленгликоля к площадям пика этиленгликоля, рассчитанное с хроматограмм раствора сравнения;
т1- масса навески препараты, в граммах;
т0 - масса навески пропиленгликоля, в миллиграммах.
Результаты исследований приведены в таблице
2
S0 * m1 * 100
S0 * m1
Таблица
Количественное содержание клотримазола, суммы флаваноидов и ПГ в препарате
Вещество Содержание, мг/г Выявлено
мг/г метрологические характеристики
Клотримазол 10,00 10,27 10,19 10,08 Сер.10,18 Х = 149,27 S(X) = 0,09 S .X = 0,06 е = ± 1,50% Х ± S X = 10,18± 1,50
Сумма флаваноидов Не меньше 1,2 мг на 1 г в перепасчете на рутин 1,36 1,38 1,35 сер. 1,36 Х = 1,36 S(X) = 0,0153 S X = 0,0088 е = ± 1,79% Х ± S X = 1,36± 0,0088
ПГ 150,0 148.0 149,7 150.1 сер. 149,27 Х = 149,27 S(X) = 1,11 S X = 0,64 е = ± 1,12% Х ± S X = 149,27± 1,12
Примечание: п = 3; Р = 95 %.
Исследования показали, что время удерживания пиков клотримазола в исследуемом растворе и растворе сравнения совпадают с точностью ± 2 %. Предложенные условия хроматографического исследования методами жидкостной хроматографии обеспечивают достаточные селективность и эффективность разделения компонентов препарата, что позволяет проводить его количественное определение (табл.).
Установлено, что содержание клотримазола в лекарственном препарате находится в допустимых пределах (9,5 - 10,5 мг/г), а метрологические характеристиеи методики позволяют рекомендовать ее для использования в контроле качества данного препарата.
Методом абсорбционной хроматографии разработана методика количественного определения суммы флавано-идов в составе лекарственного средства. Установлено, что сумма флаваноидов в перерасчете на рутин должна быть не менее 1,2 мкг на 1 г препарата (табл.). Для качественного определения суммы флавоноидов в 1 г препарата добавляют 2 - 3 капли раствором железа (III) хлорида. Появляется зеленовато-коричневое окрашивание.
Для количественного определения ПГ использован метод газовой хроматографии. Установлено, что количество ПГ в 1 г препарата составляет от 135,0 мг до 165,0 мг (при норме 150,0 мг ± 10 %).
Исследование рН обработанного ЛС установило, что значение рН находится в пределах от 4,0 до 6,0.
Выводы и предложения
Разработаны методики качественного и количественного определения активных фармацевтических ингредиентов и вспомогательных веществ (клотримазол, сумма фенольных соединений, ПГ) в составе крема.
Установленные допустимые пределы определенных веществ в препарате, в частности клотримазол (9,5 - 10,5 мг /
г), сумма флаваноидов в перерасчете на рутин должна быть не мене 1,2 мкг на 1 г препарата, ПГ - 135,0 мг / г до 165,0 мг / г.
Значение рН раствора крема находится в пределах от 4,0 до 6,0.
Литература
1. Лисяная Т.А. Определение чувствительности условно патогенной микрофлоры влагалища, высеваемой у женщин с кольпитом к различным антимикробным препаратам. -2010.
2. Braz J In vitro activities of antifungal agents alone and in combination against fluconazolesusceptible and resistant strains of Candida dubliniensis. // Infect Dis. - 2012. - JanFeb; 16(1): 78-81.
3. Карапетян Т.Э., Насхлеташвили И.В., Тютюнник В.Л. Вульвоваги-нальный кандидоз: современный взгляд на проблему // Рус. мед. журн. - 2011. - № 1. - С. 64-67.
4. Серов В.Н. Проблема вульвовагинального кандидоза в гинекологической практике. Русский медицинский журнал. 2014; 22(6): 418-22.
5. Facchin F., Barbara G., Saita E., Mosconi P., Roberto A., Fedele L., Vercellini P. Impact of endometriosis on quality of life and mental health: pelvic pain makes the difference. J. Psychosom. Obstet. Gynaecol. 2015; 36(4): 135-41.
6. Державна фармакопея Украни / Державне шдприем-ство „Науково-експертний фармакопейний центр". - 1-е вид. - Х. : Р1РЕГ, 2011. - Доповнення 4. - 540 с.
7. European Pharmacopoeia: Suplament, 2008, Strasburg Council of Europe- 6rd ed. 2008, 3905.
8. Фармацевтическая технология екстемпоральных лекарственных средств: учебник под ред. В.В. Гладышева. -Днепропетровск: ЧМП «Эко-номика», 2014. - 374 с.
