CC BY
134
200
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ
Серия Медицина. Фармация. 2015. № 22 (219). Выпуск 32
УДК 615.074:543.544
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИАНОКОБАЛАМИНА В ГЛАЗНЫХ
КАПЛЯХ МЕТОДОМ ТСХ
QUANTITATIVE DETERMINATION OF CYANOCOBALAMIN IN EYE DROPS TLC
А.А. Зинченко2, Е.Т. Жилякова1, Т.Л. Андрющенко2, М.Ю. Новикова1,
О.О. Новиков1,Н.Н. Попов1, Е.Ю. Тимошенко1 A.A. Zinchenko2, E.T. Zhilyakova1, T.L. Andryushchenko2, M.Yu. Novikova1,
O.O. Novikov1, N.N. Popov1, E.Yu. Timoshenko1
1)Белгородский государственный национальный исследовательский университет Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д.85 2>Украинский научный Фармакопейный центр качества лекарственных средств Украина, 61085, г. Харьков, ул. Астрономическая, д.33
1Belgorod National Research University Russia 308015, Belgorod, Pobedy St., 85 2)Ukrainian Scientific Center Pharmacopoeia Drug Quality Ukraine,61085, Kharkov, Astronomicheskaya St., 33
E-mail: [email protected]
Ключевые слова: тонкослойная хроматография, цианокобаламин, таурин, 2-аминоэтанол.
Key words: TLC, cyanocobalamin, taurine, 2-aminoethanol.
Аннотация. Разработана хроматографическая методика сочетающая количественное определение цианокоба-ламина - одного из действующих веществ препарата «Цитарин, глазные капли» и примеси другого действующего вещества - таурина. Определение проводят методом тонкослойной хроматографии, с использованием тонкослойных пластинок «Сорбфил ПТСХ-П-А», автоматического аппликатора и сканера. Сканирование хроматограмм проводят при длине волны 550 нм, используя собственное поглощение цианокобаламина.
Resume. Developed chromatographic method combines quantitative determination of cyanocobalamin - one of the active ingredients of the drug "Tsitarin, eye drops" and other impurities of the active substance - Taurine. Determination is carried out by thin layer chromatography, using a thin-layer plates "Sorbfil PTLC-P-A" automatic applicator and scanner. Scanning chromatograms was carried out at a wavelength of 550 nm, using the intrinsic absorption of cyanocobalamin.
Введение
Для количественного определения цианокобаламина в медицинских препаратах, включая и глазные капли, используют такие аналитические методы как высокоэффективную жидкостную хроматографию [Pei Chen et al., 2010; 2. Trang et al., 2013], спектрофотометрию или биологические методы анализа [Государственная Фармакопея СССР IX изд, вып. 2, 1989]. Наиболее часто применяют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии который отличается высокой селективностью, а в тех случаях когда в составе препарата отсутствуют другие компоненты, поглощающие в видимом диапазоне - применяют спектрофотометрию, используя собственное поглощение цианакобаламина. При наличии в составе препарата других веществ, поглощающих в видимом диапазоне, альтернативным методом количественного определение цианокобаламина может быть метод ТСХ. Этот метод может быть применен и при одновременном определении цианокобаламина и других веществ, которые могут присутствовать в препарате, например сопутствующих примесей других действующих веществ препарата [Ponder et al., 2004]. В качестве примера можно привести препарат «Цитарин, глазные капли» в состав которого входит цианокобаламин (0.25 мг/мл) и таурин (40 мг/мл), технологической примесью и продуктом распада которого является 2-аминоэтанол.
Цель
Цель работы - разработка методики количественного определения цианокобаламина одновременно с определением сопутствующей примеси таурина - 2-аминоэтанола в препарате цитарин. Помимо количественного определения цианокобаламина и 2-аминоэтанола методика позволяет проводить идентификацию еще одного действующего вещества - таурина.
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ
Серия Медицина. Фармация. 2015. № 22 (219). Выпуск 32
201
Материалы и оборудование
Для разработки методики количественного определения цианокобаламина использовали готовые пластинки производства TLC Silica gel 60, производства фирмы “Merck“, Германия и «Сорбфил ПТСХ-П-А», производства ЗАО “Сорбполимер“, Российская Федерация и оборудование производства фирмы “Camag“, Швейцария, в комплекте состоящий из аппликатора модели “Linomat 5”, укомплектованный шприцом вместимостью 100 мкл, хроматографической камерой модели ADC 2, сканером модели “TLC Scanner3”, и визуализатором. Управление комплектом и расчет осуществляется программным обеспечением “WinCats”. Навески исследуемых стандартных образцов (СО) 2 -аминоэтанола и цианокобаламина взвешивали на весах модели AUW220D Shimadzu, Япония с неопределенности взвешивания 33 мкг.
При проведении предварительных экспериментов был выбран состав подвижной фазы, при котором наблюдается полное разделение хроматографических зон 2-аминоэтанола и таурина и циа-нокобаламина. Поскольку цианокобаламин имеет максимум поглощения в видимом диапазоне, а 2-аминоэтанол и таурин практически прозрачны в УФ - ВИД диапазоне в методике предусмотрено последовательное проведение регистрации сначала цианокобаламина, а затем проявление 2-аминоэтанола и таурина раствором нингидрина с последующей регистрацией их хроматографических зон в видимом диапазоне.
Методика
Приготовление испытуемого раствора 1. В качестве испытуемого раствора используют сам препарат.
Приготовление испытуемого раствора 2. 1.0 мл испытуемого раствора 1 помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Приготовление раствора сравнения цианокобаламина. 25 мг (точная навеска) ГСО (СО) цианокобаламина, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 80 мл воды и перемешивают до полного растворения, объём раствора доводят до метки водой и перемешивают (исходный раствор). 0.25 мг/мл
Приготовление раствора сравнения 2-аминоэтанола. 20 мг 2-аминоэтанола (ТУ 6-09-24486 или аналогичного качества) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 40 мл 0.1 М растворе кислоты хлористоводородной, доводят объём раствора этим же растворителем до метки и перемешивают (исходный раствор).
5.0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объём раствора 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной и перемешивают.
Приготовление раствора сравнения таурина. 20 мг стандартного образца таурина помещают в мерную колбу вместимостью 5 мл, растворяют в 3 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Приготовление раствора для проверки пригодности хроматографической системы. 400 мг таурина и 2.5 мг СО цианокобаламина помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, прибавляют 1.0 мл исходного раствора 2-аминоэтанола, 5 мл воды, перемешивают до полного растворения веществ, доводят объем раствора до метки водой и перемешивают.
Проведение измерений: на хроматографическую пластинку размером 10x20 см на линию старта расположенной на расстоянии 15 мм от края пластинки аппликатором наносят полосками длинной 4 мм испытуемый раствор 1, испытуемый раствор 2, раствор сравнения цианокобаламина, раствор сравнения таурина и раствор сравнения 2-аминоэтанола. Растворы сравнения цианокобала-мина, 2-аминоэтанола и испытуемый раствор 1 наносят по 5 полосок каждого, раствор сравнения таурина и испытуемый раствор 2 наносят по 1 полоске. Количество параллельных хроматограмм испытуемого раствора и раствора сравнения цианокобаламина может быть и менее 5, при этом можно нанести и раствор для проверке пригодности хроматографической системы. В данном конкретном примере раствор для проверки пригодности хроматографической системы наносили на отдельную пластинку той же серии и хроматографировали одновременно, в той же камере.
Затем пластину помещают в камеру со смесью спирт этиловый 96 % - хлороформ - аммиака раствор концентрированный (6:2: 1.5) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет 8 см от линии старта, пластинку вынимают и высушивают в токе воздуха в течение 5 мин, до полного отсутствия запаха растворителей. Хроматограммы всех растворов представлены на рисунке 1.
Затем хроматограммы испытуемого раствора и раствора сравнения цианокобаламина сканируют в следующих условиях:
- размер зоны сканирования 6 х 0,1 мм;
- скорость сканирования - 20 мм/сек;
- длина волны регистрации - 550 нм.
202
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ
Серия Медицина. Фармация. 2015. № 22 (219). Выпуск 32
Рис. 1. Хроматограммы испытуемого раствора 1 (2, 5, 10, 13 и 16), раствора сравнения цианокобаламина (1, 4, 9, 12 и 15), раствора сравнения 2-аминоэтанола (3, 6, 11, 14 и 17), испытуемого раствора 2 (7) и раствора сравнения таурина (8) до проявления раствором нингидрином Fig. 1. Hromatogramma of the examinee of solution 1 (2, 5, 10, 13 and 16), solution of comparison of cyanoco-balamine (1, 4, 9, 12 and 15), solution of comparison of a 2-aminoetanol (3, 6, 11, 14 and 17), the examinee of solution 2 (7) and solution of comparison of taurine (8) before manifestation by solution the ningidriny
По данным сканирования хроматограмм раствора сравнения цианокобаламина и испытуемого раствора определяют интегральные значения площадей пиков цианокобаламина. Хроматограммы испытуемого раствора и раствора сравнения цианокобаламина, полученные при сканировании пластинки представлены на рисунке 2.
Рис. 2. Сканированные хроматограммы испытуемого раствора 1 (2, 5, 10, 13 и 16), раствора сравнения ци-анокобаламина (1, 4, 9, 12 и 15), раствора сравнения 2-аминоэтанола (3, 6, 11, 14 и 17), испытуемого раствора 2 (6) и раствора сравнения таурина (7) до проявления раствором нингидрином Fig. 2. The scanned hromatogramma of the examinee of solution 1 (2, 5, 10, 13 and 16), solution of comparison of cyanocobalamine (1, 4, 9, 12 and 15), solution of comparison of a 2-aminoetanol (3, 6, 11, 14 and 17), the examinee of solution 2 (6) and solution of comparison of taurine (7) before manifestation by solution the ningidriny
Результаты определения интегральных площадей пиков цианокобаламина на хроматограммах испытуемого раствора 1 и раствора сравнения приведены в таблице 1.
Затем, рассчитывают количественное содержание цианокобаламина (XB12) по формуле:
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ
Серия Медицина. Фармация. 2015. № 22 (219). Выпуск 32
203
Si X тп„ X Р
—— _[____V______
В1г ~ SD X 100 X 100
где Si - среднее значение интегральных площадей пиков цианокобаламина, рассчитанное из хроматограмм испытуемого раствора;
So - среднее значение интегральных площадей пиков цианокобаламина, рассчитанное из хроматограмм раствора сравнения цианокобаламина;
mo - масса навески СО цианокобаламина, в миллиграммах;
Р - содержание основного вещества в СО цианокобаламина, в процентах.
Содержание C63H88C0N14O14P (цианокобаламина) в 1 мл препарата должно быть от 0.225 мг до 0,275 мг.
Далее пластинку погружают в раствор нингидрина и выдерживают в течение 3 сек. Пластинку помещают в сушильный шкаф и выдерживают при температуре 110 оС в течение 10 мин, охлаждают до комнатной температуры и сканируют в следующих условиях:
- размер зоны сканирования 6.0 мм х 0.2 мм
- скорость сканирования - 20 мм/сек;
- длина волны регистрации - 425 нм.
Хроматограммы полученные после обработки пластинки раствором нингидрида и после сканирования пластинки представлены на рисунках 3 и 4.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Рис. 3. Хроматограммы испытуемого раствора 1 (2, 5, 10, 13 и 16), раствора сравнения цианокобаламина (1, 4, 9, 12 и 15), раствора сравнения 2-аминоэтанола (3, 6, 11, 14 и 17), испытуемого раствора 2 (7) и раствора сравнения таурина (8) после проявления раствором нингидрином
Fig. 3. Hromatogramma of the examinee of solution 1 (2, 5, 10, 13 and 16), solution of comparison of cyanoco-balamine (1, 4, 9, 12 and 15), solution of comparison of a 2-aminoetanol (3, 6, 11, 14 and 17), the examinee of solution 2 (7) and solution of comparison of taurine (8) after manifestation by solution the ningidriny
По результатам сканирования определяют значения интегральных площадей пиков 2-аминоэтанола на хроматограммах испытуемого раствора и раствора сравнения 2-аминоэтанола. Среднее значение интегральных площадей пиков 2-аминоэтанола не должно превышать среднего значения интегральных площадей пиков 2-аминоэтанола на хроматограммах раствора сравнения 2-аминоэтанола (не более 0.1%).
Приведенные в таблице 1 результаты определения интегральных площадей пиков цианокоба-ламина и 2-аминоэтанола позволяют рассчитать количественное содержание цианокобаламина в препарате, а также определить, что содержание продукта распада таурина - 2-аминоэтанола не превышает предельно допустимый уровень 0.1 %. В данном случае, при содержании основного вещества в СО цианокобаламина 90.6 % и навеске 24.4 мг содержание цианокобаламина в препарате составляет 0.27 мг/мл.
Подлинность таурина подтверждается совпадением положения и окраски основного пятна на хроматограммах испытуемого раствора 2 (трек 7) с положением и окраски пятна на хроматограмме раствора сравнения таурина 2 (трек 8).
204
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ
Серия Медицина. Фармация. 2015. № 22 (219). Выпуск 32
Рис. 4. Сканированные хроматограммы испытуемого раствора 1 (2, 5, 10, 13 и 16), раствора сравнения цианокоба-ламина (1, 4, 9, 12 и 15), раствора сравнения 2-аминоэтанола (3, 6, 11, 14 и 17), испытуемого раствора 2 (7) и раствора сравнения таурина (8) после проявления раствором нингидрином Fig. 4. The scanned hromatogramma of the examinee of solution 1 (2, 5, 10, 13 and 16), solution of comparison of cyanocobalamine (1, 4, 9, 12 and 15), solution of comparison of a 2-aminoetanol (3, 6, 11, 14 and 17), the examinee of solution 2 (7) and solution of comparison of taurine (8) after manifestation by solution the ningidriny
Таблица 1 Table. 1
Результаты определения интегральных площадей пиков цианокобаламина и 2-аминоэтанола Results of determination of the integrated areas of peaks of cyanocobalamine and 2-aminoetanol
Площади пиков циано- Площади пиков циано- Площади пиков 2- Площадь пика 2-
кобаламина на хромато- кобаламина на хромато- аминоэтанола на хро- аминоэтанола на
граммах сравнения граммах испытуемого матограммах испытуе- хроматограммах
раствора 1 мого раствора 1 сравнения
1 4706.5 5806.9 588.3 3032.5
2 477.3-1 5654.0 5,37.,3 3009.3
3 4596.4 5657.6 514.2 2923.7
4 4638,6 5747.4 543.5 2942.7
5 4762.1 5768.7 550.3 2856.7
Среднее значение 4695.3 5729.9 546.7 2953
ОСО (%) 1.64 1.20 4.93 2.38
Валидация методики и обсуждение результатов
Исследования валидационных характеристик методики количественного определения циано-коболомина проводили по характеристикам специфичность, правильность и линейность [Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств, 2007]. Специфичность методики подтверждается приведенными на рис. 5 хроматограммами испытуемого раствора 1, испытуемого раствора 2, раствора сравнения таурина, раствора сравнения цианокобаламина, раствора сравнения 2-аминоэтанола и раствора, раствора для проверки пригодности хроматографической системы, на которых наблюдается полное разделение хроматографических зон цианокобаламина, таурина и 2 -аминоэтанола при этом положение и интенсивность окраски основных пятен на хроматограмме раствора для проверке пригодности хроматографической системы совпадает с интенсивностью окраски и положением соответствующих пятен на хроматограммах растворов сравнения.
Характеристики Линейность и правильность (прецизионность) исследовали на 9 модельных растворов с концентрацией цианокобалами соответствующими от 80% до 120% по отношению к номинальной. Модельные растворы готовили в мерных колбах вместимостью 100 мл непосредственно
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ
Серия Медицина. Фармация. 2015. № 22 (219). Выпуск 32
205
из навесок вспомогательных компонентов препарата, таурина и цианокобаламина. Расчет пригодности метрологических характеристик методики проводили для допуска содержания (В) цианобалами-на±10 %. Результаты определения концентрации цианокобаламина в модельных растворах и их метрологическая обработка приведены в таблице 2.
Таблица 2 Table. 2
Результаты определения цианокобаламина и их статистическая обработка Results of definition of cyanocobalamine and their statistical processing
№ модельной смеси Навески цианокоба-ламина, мг Введенное количество цианокобаламина в % по отношению к номинальному Найденное количество цианокобала-мина в % по отношению к номинальному Найдено цианокобала-мина, в %, по отношению к введенному количеству
1 20.03 80.12 80.94 98.99
2 21.16 84.64 8,3.96 100.81
3 22.51 90.04 90.02 100.02
4 2,3.69 94.76 95.54 99.18
5 25.11 100.44 100.41 100.03
6 26.10 104.40 105.76 98.71
7 27.02 108.08 109.15 99.02
8 28.77 115.08 115.01 100.06
9 30.35 121.40 120.55 100.71
Среднее значение Zcp % 99.65
Относительное стандартное отклонение, sz% 0.70
Относительный доверительный интервал A%=t(95%,9-2)xSz=1.895xSz = 1.33
Систематическая погрешность 8= Zcp-100 0.35
Критерий незначимости систематической ошибки:
1) статистическая незначимость: 8<Az :V9=1-33 : 3 = 0.44%<0.35 % 2) Если не выполняется 1), то 8<max8: 2) практическая незначимость: 5%<0.32х3.2=1.02 %>0.35 % Выполняется Выполняется
Общий вывод о методике КОРРЕКТНА
По приведенным в таблице 2 данным рассчитаны коэффициенты линейной зависимости найденной концентрации цианокобаламина от введенной. График и рассчитанные коэффициенты приведены на рисунке бив таблице 3.
120 -
Ю
О
X
О
£
Л
О.
о
е %
8 5
S
т;
0
1 е-
о
ЭО
1 1 1 1 1 1 1 _ Linear Regression for В12_В: n 1
Y = А + В * X
Parana Value sd .v''
"A 1,18615 2,11317 "
■ В 0,99077 0,02098 ■ ■
_ R = 0,99843
SB :i.82i:::i.N a •' ' P = 4,9904E-1 ■
“ .-yM - '
■
- ■ -
80 90 100 110
X Введенное количество цианокобаламина.
120
в % от номинальной концентрации
Рис. 6. График и коэффициенты линейной зависимости найденной концентрации цианокобаламина
от введенной
Fig. 6. The schedule and coefficients of linear dependence of the found concentration of cyanocobalamine on the entered
206
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ
Серия Медицина. Фармация. 2015. № 22 (219). Выпуск 32
Таблица 3 Table. 3
Метрологические характеристики линейной зависимости найденной концентрации цианокобаламина от введенной
Параметры Значения Требования 1 Требования 2 Заключение
b 0.99077
Sb 0.02098
А 1.18615 < t(95%,n - 2) X Sa =1.895xSa=3.99 □|3-2| Выдерживается по 1 критерию
Sa 2.11317
a 0 0.820
SD0/b 0.83 □1 i-69l Выполняются
r 0.99843 >|0.99236| Выполняются
Как следует из представленных данных, требования к параметрам линейной зависимости выполняются, то есть линейность методики количественного определения цианокобаламина подтверждается в диапазоне концентраций от 80% до 120% от предельно допустимого значения.
Неопределенность методики (Aas) складывается из неопределенности внесенной пробоподготовкой (Asp) и неопределенности конечной аналитической операции - хроматографирования и расчет площадей пиков определяемого вещества (Afao):
А = V ASP+Aao
Поскольку в качестве испытуемого раствора используют непосредственно сам препарат, не-пределенность пробоподготовки определяется только неопределенностью приготовления раствора сравнения цианокобаламина. Рассчитанное значение неопределенности пробоподготовки составляет 0.81 %
Неопределенность конечной аналитической операции рассчитывали по результатам хроматографирования испытуемого раствора и раствора сравнения цианокобаламина (табл. 1) при 5 параллельных хроматограммам составляет 0.91. Отсюда следует, что суммарная неопределенность методики (Aas) составляет 1.22 %, что не превышает предельно допустимую величину - 3.2%.
Заключение
Как свидетельствуют экспериментально полученные данные о валидационных характеристик, разработанная методика соответствуют всем критериям для методик количественного определения действующих веществ в лекарственных препаратах.
Список литературы References
Государственная Фармакопея СССР IX изд, вып.2. 1989. М.: Медицина, 400 с.
Gosudarstvennaya Farmakopeya SSSR IX izd, vyp.2. [State Pharmacopoeia of USSR XI Ed, issue 2]. 1989. M.: Medicine, 400 p (in Russian).
Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств / Под ред. Н.В. Юргеля, А.Л. Мла-денцева, А.В. Бурдейна и др. 2007. М., Фармацевтическая промышленость, 58 с.
Rukovodstvo po validatsii metodik analiza lekarstvennykh sredstv / Pod red. N.V. Yurgelya, A.L. Mladentseva, A.V. Burdeyna i dr. 2007. M., Farmatsevticheskaya promyshlenost [Manual the validation of methods analysis of drugs. Pharmaceutical industry], 58 p (in Russian).
Pei Chen, Wayne R. Wolf, Isabel Castanheira and Ana Sanches-Silva 2010. A LC/UV/Vis method for determination of cyanocobalamin (VB12) in multivitamin dietary supplements with on-line sample clean-up. Anal. Methods, 2:11711175.
Trang, Hung Khiem. 2013. Development of HPLC methods for the determination of water-soluble vitamins in pharmaceuticals and fortified food products. All Theses, 1745.
E.L. Ponder, B. Fried, and J. Sherma 2004. Thin-layer chromatographic analysis of hydrophilic vitamins in standards and from Helisoma trivolvis snails. Acta chromatographica, 14:70-81.
