CC BY
16VETERINARY MICROBIOLOGY, VIROLOGY AND EPIZOOTOLOGY
positive in 2.7% of the samples. They were recognized as non-quality. As a result, we already registered cases of animal mycotoxicosis in autumn of 2017, and more often in cows. The results of the study revealed the fact that the officially accepted interpretation of the feed toxicity results required adjustment depending on the type of animal. Only a systematic monitoring of feed and preventive measures will allow to prevent the spread of mycotoxicosis in livestock farms in due time.
KEYWORDS: farm feeds, fungi, mycotoxins, corn, fusarium, Stylonychia, toxicity.
References
1. Mikotoksiny (v pischevoy cepochke): monografiya [Mycotoxins (in food chain): monograph] / K.Kh. Papunidi, M.Ya. Tremasov, V.I.Fisinin [et al.]. - 2-e izd., dop. - Kazan: FSBRI "FCTRB-VNIVI", 2017. - 158 p.
2. Mikotoksikozy zhivotnykh (etiologiya, diagnostika, lechenie, profilaktika) [Mycotoxicoses of animals (etiology, diagnosis, treatment, prevention] / A.V.Ivanov, M.Ya. Tremasov, K.Kh. Papunidi, A.K.Chulkov. - M.: Kolos, 2008. - 140 p.
3. Aktualnye problemy veterinarnoy toksikologii [Actual problems of veterinary toxicology] / M.Ya. Tremasov, K.Kh. Papunidi, E.I.Semenov, E.Yu. Tarasova // Vestnik veterinarii. - 2012. - № 4 (63). - P. 16-18.
4. Otsenka toksichnosti kormov po regionam Rossiyskoy Federatsii [Assessment of feed toxicity in the regions of the Russian Federation] / S.A.Semenova, R.M.Potekhina, E.I.Semenov [et al.] // Uchenye zapiski KGAVM im. N.E.Baumana. - 2015. - № 224. - P. 196-199.
5. Smirnov, U.S. Mikotoksiny: fundamentalnye I prikladnye aspekty [Mycotoxins: fundamental and applied aspects] / U.S. Smirnov, F.M.Zaychenko, I.G.Runezhnyak // Sovremennye problemy toksikologii. - 2000. - № 1. - P. 2-12.
6. Griby produtsenty aflatoksina B1 v Povolzhye [Fungi producers of aflatoksin B1 in Povolzhye] / A.V.Ivanov, S.A.Tanaseva, O.K.Ermolaeva, E.I.Semenov // Uspekhi meditsinskoy mikologii. - 2014. - Vol. 13. - P. 347-349.
7. Fuzarioz zernovykh kultur [Fusariose of cereal crops] / T.Yu.Gagkaeva, O.P.Gavrilova, M.M.Levitin, K.V.Novozhilova // Zaschita I karantin rasteniy. - 2011. - № 5. - P. 2-3.
8. A European database of Fusarium graminearum and F.culmorum trichothecene genotypes / M. Pasquali [et al.] // Frontiers in Microbiology. - 2016. - Vol. 7, APR. - P. 00406.
9. Effect of abiotic stressors on T-2-producing environmental isolates of Fusarium sporotrichioides / G.M.Yumangulova [et al.] // Journal of Pharmacy Research. - 2017. - Vol. 11, Issue. 10. - P. 1226-1229.
10. Veterinarno-sanitarnaya ekspertiza myasa sviney pri aflatoksikoze [Veterinary and sanitation examination of pig meat at aflatoxicosis] / L.E.Matrosova, E.I.Semenov, S.A.Tanaseva, S.Yu Smolentsev // Myasnaya industriya. - 2015. -№ 5. - P. 51-52.
11. Metodicheskie rekomendatsii po diagnostike, profilaktike I lecheniyu mikotoksikozov zhivotnykh [Methodological recommendations on diagnosis, prevention and treatment of animal mycotoxicosis] / E.I.Semenov [et al.]; approved by Minselkhoz Rossii on 19.10.2016. - M., 2016.
12. Sravnenie metodov vyavleniya v zerne toksinoprodutsiruyuschikh gribov roda Fusarium [Comparing of methods for detecting toxine producing fungi of genus Fusarium ] / T.Yu. Gagkaeva, O.P.Gavrilova, A.S.Orina [et al.] // Mikologiya I fitopatologiya. - 2017. - Vol. 51, № 5. - P. 292-298.
УДК 619:615.371 DOI: 10.33632/1998-698X.2019-1-24-28
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУчЕНИЯ СПЕЦИФИчЕСКИХ
ботулинических антигенов для реакции преципитации
И ИХ СРАВНЕНИЕ
'Э.Н.Мустафина - кандидат ветеринарных наук, вед.н.с.; 2Т.Р.Мустафин - кандидат биологических наук, зав.лабораторией; 'Н.С.Садыков - доктор ветеринарных наук, профессор, гл.н.с.; 1А.Н.Чернов - доктор биологических наук, зам. директора по НИР и биобезопасности.
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, г.Казань, Научный городок-2, тел.(843)239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru).
2Предприятие «ПромАсептика», г.Казань (420140, г.Казань, ул.Минская, д.6, оф.136, e-mail: swa862@mail.ru).
Реакция преципитации относится к числу наиболее простых и ускоренных методов серологического анализа. В основе реакции лежит образование видимой линии преципитации, состоящего из вступивших друг с другом в соединение антител и молекулярных антигенов. По этой причине, в данном исследовании мы разра-
24
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 1/2019
батываем и сравниваем два метода получения ботулинических антигенов (преципитиногенов) для реакции преципитации. Принцип первого метода состоял в получении ботулинического антигена из возбудителя Clostridium botulinum тип А по методике полного антигена Буавена. Второй же метод заключался в выделении ботулинического антигена из комплекса возбудитель-токсин Clostridium botulinum тип А. В ходе эксперимента выявлено возникновение групповой реакции преципитации, связанной с гомологической структурой антигенов. Наиболее эффективным и специфичным преципитиногеном для реакции преципитации является ботулинический антиген из возбудителя Clostridium botulinum тип А, полученный по методике «Полного антигена Буавена».
КЛЮчЕВЫЕ СЛОВА: ботулизм, диагностика, антиген, преципитиноген, преципитин.
Ботулизм - тяжелая интоксикация, возникающая в результате употребления в пищу продуктов, содержащих токсины СИоБШштЬоУтит и характеризующаяся преимущественным поражением центральной и вегетативной нервной системы.
В настоящее время известно 8 типов возбудителя ботулизма (А, В, Са, Ср, Э, Е, Р, в), которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками.
Возбудитель ботулизма относится к политропным представителям микробов, которые в ходе инфекционного процесса занимают ряд последовательных локализаций в организме, тем самым обнаруживая свою адаптированность к ряду различных органов и тканей. Однако это есть единая форма болезни, в которой локализация возбудителя соответствуют разным стадиям болезни (кишечник, печень, легкие, нервная система).
Анализируя литературные данные по вопросу обнаружения антигенов и антител вообще, токсинов микробного происхождения в частности, можно заключить, что в этих целях наиболее перспективными являются иммуноферментный анализ [1], реакция непрямой гемагглютинации [2], хотя самым распространенным в настоящее время методом индикации ботулинического токсина является биопроба с реакцией нейтрализации токсина на белых мышах [3;4;5;6;7;8]. Для индикации ботулинических токсинов во внешней среде применяли так же РНГА [9;10] и люминесцентный анализ с использованием флуоресцирующих антител [11;12].
Диагностика ботулизма, имеет целый ряд проблем. Это, во-первых, связано со сложностью культивирования клостридий как анаэробов и отсутствием селективных сред для них. Кроме того, единственным методом, позволяющим с высокой чувствительностью идентифицировать ботулинические нейроток-сины, является биопроба на мышах в сочетании с реакцией нейтрализации специфическими анатоксинами. Данный метод требует большого количества лабораторных животных, использование которых в настоящее время принято считать не этичным. Помимо этого, биопроба также не всегда обеспечивает получение необходимой информации. По статистическим данным, 65% клинических случаев ботулизма не имеют лабораторного подтверждения.
Цель работы заключалась в получении ботулинических антигенов и их сравнение для реакции преципитации.
Материалы и методы. Метод №1. Получение ботулинического антигена из возбудителя Clostridium botulinum тип А по методике «Полного антигена Буавена» - в дальнейшем «простой полный ботулинический антиген».
Культуру Cl. botulinum тип А высевали на среду Кит-та-Тароцци под вазелиновым маслом и культивировали в термостате 5 сут при температуре 35°С. После культивирования удаляли вазелиновое масло и кусочки печени. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6°°° об/мин - 4° минут. Супернатант удаляли, а осадок разбавляли стерильной дистиллированной водой до концентрации 4х1°9 м.к./мл (по стандарту мутности им.Тарасевича). Выделенные клетки промывали трехкратно на центрифуге тем же количеством стерильной дистиллированной воды, сколько требовалось для разбавления до 4х1°9 м.к./мл, при 3°°° об/мин - 15 минут. Затем отмытый осадок суспендировали 1°% трихлорук-сусной кислотой (тем же объемом, что и для получения 4х1°9 м.к./мл). Смесь выдерживали в холодильнике (+4°С) 24 часа. После этого смесь центрифугировали при 6°°° об/мин - 5° мин для осаждения грубых частиц. Осадок удаляли, а супернатант диализировали против проточной водопроводной воды 2 сут, и 24 ч против стерильной дистиллированной воды. По истечению диализа, жидкость считали ботулиническим антигеном по методу «Полного антигена Буавена».
Метод №2. Выделение ботулинического антигена из комплекса возбудитель-токсин Clostridium botulinum тип А - в дальнейшем «сложный полный бо-тулинический антиген».
Осуществляли посев культуры Cl. botulinum тип А на среду Китта-Тароцци под вазелиновым маслом и культивировали ее в термостате 5 сут при 35°С. По истечению культивирования, выкачивали куль-туральную жидкость, освобожденную от кусочков печени и вазелинового масла и помещали смесь в ультразвуковой дезинтегратор для направленного разрушения клеток Cl.botulinum в диапазоне не менее 15 микрон в течение 15 минут. В полученную лизированную смесь добавляли сульфат аммония в расчете 6°% аммония от общего объема полученной
VETERINARY MICROBIOLOGY, VIROLOGY AND EPIZOOTOLOGY
культуральной жидкости. Смесь ставили на магнитную мешалку, без подогрева, до полного растворения сульфата аммония. Далее центрифугировали раствор при 6000 об/мин в течение 45 мин, супер-натант удаляли [13]. Полученный осадок ресуспен-дировали стерильной дистиллированной водой до концентрации 8х108 м.к./мл (по стандарту мутности им.Тарасевича). Затем клетки промывали 3 раза центрифугированием при 3000 об/мин - 15 мин, с тем же объемом стерильной дистилированной воды, сколько потребовалось для создания концентрации микробов 8х108 м.к./мл. Отмытый осадок довели до необходимой концентрации 10% раствором трихлоруксусной кислоты и выдерживали смесь в холодильнике 24 часа. После этого ее диализиро-вали против проточной водопроводной воды - 2 сут, стерильной дистиллированной воды - 1 сут и 8 сут против карбонатно-бикарбонатного буфера. После всех этапов диализа, смесь центрифугировали при 6000 об/мин - 1 час для осаждения грубых частиц, осадок удаляли, а надосадочную жидкость считали сложным полным ботулиническим антигеном.
Получение корпускулярного антигена из Clostridium botulinum тип А.
Культуральную жидкость Cl.botulinum тип А выращенную на среде Китта-Тароцци под вазелиновым маслом, кипятили на водяной бане, при температуре 1200С, в течение 2 ч 30 минут. Далее центрифугировали при 6000 об/мин - 45 мин, осадок удаляли, а су-пернатант использовали в качестве корпускулярного антигена Cl. botulinum.
Разработанные антигены (метод №1 и №2) представляют собой коллойдные вещества, выделенные из Cl. botulinum тип А, находящиеся в состоянии тонкой дисперсности и применялись нами в качестве диагностических преципитиногенов для выявления специфических антител (преципитинов) в исследуемой сыворотке в реакции преципитации. Полученный корпускулярный антиген использовался в качестве контроля хода реакции.
Результаты исследований. Реакцию преципитации проводили по общепринятой методике, для выявления специфических антител в исследуемой сыворотке на основе применения определенных антигенов.
Преципитины Преципитиногены
Корпускулярный антиген Простой полный ботулинический антиген Сложный полный ботулинический антиген
1:1000 1:10000 1:1000 1:10000 1:1000 1:10000
Тип А (98/2017 г.) +++ +++ ++++ ++++ ++++ +++
Тип А (98/2016 г.) ++ ++ ++++ +++ +++ +++
Тип А (98/2015 г.) + + ++ + ++ ++
Тип В (16Я/2017 г.) ++ + +++ ++ ++ +
Тип Э (БНи/2017 г.) ++ + ++++ +++ ++++ +++
Тип Е (153/2017 г.) + + ++++ ++++ +++ +++
Тип Р (5964/2017 г.) - - ++++ +++ ++ +
Поливалентная сыворотка АВСЭ (2013 г.) + - ++++ ++++ ++ +
Лошадиная сыворотка - - - - - -
Нормальная кроличья сыворотка - - - - - -
СЬБШЮт регШдепБ - - - - - -
ВаоШиБ БиЫШз - - - - - -
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 1/2019
26
Как видно из таблицы, более чувствительным преципитиногеном является «Простой полный бо-тулинический антиген». Наряду с этим, стоит отметить что «Сложный полный антиген» так же не уступал и взаимодействовал со всеми преципити-нами, представленными в данном исследовании, с разницей лишь в чувствительности к определенным сывороткам (плохо реагировал с С!.Ьо№!1пит тип В; тип Н поливалентная сыворотка АВСЭ). Корпускулярный антиген показал самые низкие результаты чувствительности, что говорит о его несостоятельности в качестве преципитиногена для диагностики С1.ЬоШНпит в реакции преципитации.
Заключение. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод что корпускулярный анти-ген,«Простой полный ботулинический антиген», «Сложный полный ботулинический антиген» - из-
готовленные из Cl.botulinum тип А, реагируют с ботулиническими преципитинами всех видов (тип А; В; D; Е и F (кроме корпускулярного), не дают перекрестных реакций с Clostridium perfringens и Bacillus subtilis, и отрицательны по отношению к контролю (лошадиная сыворотка,нормальная кроличья сыворотка), что указывает как на специфичность данных преципитиногенов к Cl.botulinum, так и на групповую реакцию преципитации,связанную по видимому с неоспоримыми родственными связями всех типов Cl. botulinum, задействованными в данном эксперименте. Наряду с вышесказанным, «Простой полный ботулинический антиген» (метод №1) является более специфичным и менее трудоемким, по сравнению с методом №2 «Сложный полный ботулинический антиген» для постановки реакции преципитации.
Литература
1. Бочарова, Н.Г. Новая тест система обнаружения специфических антител / Н.Г.Бочарова // - Сб. науч. трудов., 1979. - Вып.4. - С.157-161.
2. Никитин, В.М. Справочник серологических реакций / В.М.Никитин // - Кишинев, 1977. - 205 с.
3. Матвеев, К.И. Ботулизм / К.И.Матвеев // - М., 1959. - 408 с.
4. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С.Лабинская // - М.: Медицина, 1978. - 391 с.
5. Пяткин, К.Д. Микробиология / К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин // М.: Медицина, 1981. - 511 с.
6. Каздобина, И.С. Специфическая индикация биологических средств и лабораторная диагностика инфекционного заболевания / И.С.Каздобина // ВПБЗН. - 1985. - Вып. 32. - С.5-13.
7. Никифоров, В.Н. Ботулизм / В.Н.Никифоров, В.В.Никифоров // М.: Медицина, 1985. - 198 с.
8. Dezfulian, M. Kinetics of growth and toxigenicity of Clostridium botulinum in experimental wound botulism / M.Dezfulian, H.G.Bartlett // Infec. andlm-mun. 1985. - V.49. - №2. - P.452-454.
9. Булатова, Т.И. К вопросу о применении РНГА для обнаружения ботулинических токсинов / Т.И.Булатова, К.И.Матвеев // ВПБЗН. - 1966. - Вып.10. - С. 167.
10. Шамсутдинова, А.Х. Методическое указание по индикации ботулинических токсинов в объектах ветеринарного надзора реакцией непрямой гемагглютинации / А.Х.Шамсутдинова, К.Х.Папуниди, Д.А.Кирилюки [и др.] // ГУВ при ГК СМ СССР. - 1989.
11. Бусыгин, К.Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных / К.Ф.Бусыгин // М.: Колос, 1975. - 160 с.
12. Булатова, Т.И. Применение люминесцирующих антител для выявления возбудителей ботулизма. Люми-несцирующие антитела в микробиологии / Т.И.Булатова, Е.А.Кабанова, А.Я.Кульберг // М. - 1962. - С.98-116.
13. Мустафина, Э.Н. Сравнительная оценка получения нативного нейротоксического комплекса dostridium botulinum тип А методом концентрации и высаливания сульфатом аммония / Э.Н.Мустафина, Т.Р.Мустафин, Н.С. Садыков // Ветеринарный врач. - № 4. - 2018. - С. 39-42.
DEVELOPMENT OF A METHOD FOR OBTAINING SPECIFIC BOTULINIC ANTIGENS FOR THE PRECYPTION REACTION AND THEIR COMPARISON
1Mustafina E.N. - Candidate of Veterinary Sciences; 2Mustafin T.R. - Candidate of Biological Sciences;
1Sadykov N.S. - Doctor of Veterinary Sciences, professor; 1Chernov A.N. - Doctor of Biological Sciences.
federal Center for Toxicology, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
2The company "PromAseptika", Kazan (e-mail: swa862@mail.ru).
Precipitation reaction is one of the simplest and fastest methods of serological analysis. The basis of the reaction is the formation of a visible precipitation line, consisting of entered with each other in the combination of antibodies and molecular antigens.For this reason, in this study, we develop and compare two methods for producing botulinum antigens (precipitinogens) for the precipitation reaction. The principle of the first method consisted in obtaining botulinum antigen
